Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, Paris, France (au Dr Moreau), les Instituts de recherche en santé du Canada (Grant PP2-99466 Dr Moreau) et de quatrième dimension Spine LLC , New York, États-Unis (Bourse de recherche au Dr Moreau).

Toute la procédure est effectuée sous la hotte biologique stérile et toutes les solutions et les équipements entrant en contact avec les cellules doivent être stériles. Une. Préparation des solutions essentielles <ol><li> Préparer des solutions selon le tableau 1. </li><li> Conserver la solution saline équilibrée (BSS) à la température ambiante et toutes les autres solutions à 4 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;utilisation. </li><li> Médias froid au chaud à 37 ° C dans le bain d&#39;eau pendant quelques minutes avant de l&#39;utiliser. </li></ol> 2. Préparation et stockage des PBMC <ol><li> Recueillir 10 ml de sang total dans des tubes de collecte traités à l&#39;EDTA pour préparer deux aliquotes de PBMC en utilisant 5 ml de chaque fraction aliquote. </li><li> Transférer 5 ml de sang entier à partir du tube de prélèvement sur EDTA à un tube de 50 ml. </li><li> Ajouter un volume égal de BSS et l&#39;échantillon mélanger par pipetage doux de haut en bas. </li><li> Placez 3 ml de Ficoll dans deux tubes de 15 ml Falcon. </li><li> Couche avec précaution 4,5 mlde mélange de sang dilué sur le Ficoll dans chaque tube. </li><li> Laissez reposer les tubes pendant 5 min pour favoriser une séparation claire du sang et de Ficoll. </li><li> Centrifuger les tubes à 400 g pendant 30 min à température ambiante, sans frein. </li><li> Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse afin de ne pas perturber la stratification. Les PBMC sont visibles à l&#39;interface BSS / Ficoll. </li><li> Récolter la couche nuageuse de PBMC à l&#39;interface de deux tubes avec une pipette et transférer dans un nouveau tube de 50 ml. </li><li> Ajouter 20 ml de milieu complet. </li><li> Centrifuger le tube à 288 g pendant 7 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant par aspiration. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de milieu supplémentaire. </li><li> Ajouter un volume égal de milieu de congélation. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un tube cryogénique. </li><li> Placer le tube cryogénique dans un récipient de cryocongélation avec de l&#39;isopropanol. </li><li> Entreposer le contenant congélation à -80 ° C pendant la nuit. </li><li> Transfer les PBMC congelés aliquote de l&#39;azote liquide pour le stockage à long terme. </li></ol> 3. Dosage fonctionnel Une. Jour 1 <ol><li> Placez aliquote de l&#39;azote liquide dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant une minute ou jusqu&#39;à ce que décongelé. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un tube de 50 ml avec une pipette stérile. </li><li> Ajouter 15 ml de milieu complet et les cellules tourner vers le bas à 200 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant par aspiration. </li><li> Suspendre doucement culot cellulaire dans 1 ml de PHA médias. </li><li> Compléter le volume à 20 ml avec le même support. </li><li> Boucher le tube lâche pour laisser l&#39;air entrer. </li><li> Laisser le tube pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO2 pour permettre lymphocytes calmes pour se transforment en lymphoblastes rapidement-prolifération. </li></ol> 2. Jour 2 <ol><li> Prenez le tube de l&#39;incubateur, visser les bouchons complètement et tourner les cellules vers le bas à 200 g pendant 5 minà la température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant par aspiration. </li><li> Suspendre doucement culot cellulaire dans 1 ml de milieu complet. </li><li> Compléter le volume à 20 ml avec le même support. </li><li> Boucher le tube lâche pour laisser l&#39;air entrer. </li><li> Laisser le tube pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pour étendre le nombre de cellules. </li></ol> 3. Jour 3 <ol><li> Obtenez le tube de l&#39;incubateur, visser les bouchons complètement et tourner les cellules vers le bas à 200 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant par aspiration. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 10 ml de RPMI-1640 par centrifugation à 200 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension doucement le culot cellulaire dans 600 pi de milieu RPMI-1640. </li><li> Mesurer la concentration et la viabilité cellulaire, en utilisant un compteur de cellules automatisé et la viabilité analyseur. </li><li> Ajouter le volume approprié de milieu RPMI-1640 pour ajuster à une concentration cellulaire de 1,5 x 10 5 cellules/20 ul. </li&gt; <li> Traiter les cellules avec la protéine recombinante OPN (rOPN) ou de véhicule (PBS) dans 1,5 ml de tubes Eppendorf. <ol><li> Transférer 100 pl de suspension cellulaire dans deux tubes Eppendorf de 1,5 ml stériles. </li><li> Ajouter rOPN dans un tube à une concentration finale de 0,5 pg / ml. </li><li> Ajouter un volume égal de PBS dans le second tube. </li><li> Mélanger délicatement chaque condition par aspiration et à deux reprises en utilisant un ensemble de pipette stérile à 100 pi. </li></ol></li><li> Préparer le petit échantillon de 96 puits de microplaques. <ol><li> Ajouter 5 ul de RPMI-1640 à chaque puits. </li><li> Centrifuger la plaque à 200 g pendant 3 min pour éliminer les bulles d&#39;air. </li></ol></li><li> Ensemencer les cellules non traitées ainsi que des cellules traitées avec du PBS ou rOPN. <ol><li> Avant de transférer des cellules de tube pour microplaque, pipette doucement monter et descendre une fois pour assurer une suspension uniforme de cellules. </li><li> Ajouter 40 ul de suspension de cellules par puits en quatre exemplaires pour les cellules non traitées, en double exemplaire, pour rOPN PBS ou des cellules traitées. ReFer à la figure 1 pour la conception. Cette conception permet 12 patients à tester sur le même microplaque. </li><li> Laisser la plaque de cellule sous la hotte stérile pendant 5 minutes pour permettre aux cellules de se reposer et se déposent uniformément sur le fond du puits avant le placement dans l&#39;incubateur. </li></ol></li><li> Incuber la plaque pendant 18 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pour optimiser l&#39;effet de l&#39;OPN. </li></ol> 4. Jour 4 <ol><li> Exécutez la plaque avec des composés. <ol><li> Prenez la plaque de l&#39;incubateur et le laisser à température ambiante pendant environ 30 min. </li><li> Préparer 1 ml de 100 M de la somatostatine et de l&#39;isoprotérénol dans RPMI-1640 en ajoutant 10 ul de la solution mère (10 mM) dans 990 pi de RPMI-1640. </li><li> Remplir la plaque de distribution composé de 20 ul dans les puits appropriés, comme indiqué sur la figure 2. </li><li> Couvrir la plaque avec un composé de joint d&#39;étanchéité pouvant être percé prédécoupée pour éviter un changement de la concentration en composé par évaporation avant d&#39;ou lors de l&#39;incubation dans le système basé sur le CDS. </li><li> plaque de charge de la cellule, des embouts de pipette et plaque de composé dans le système basé sur le CDS. </li><li> Nommez la plaque dans le logiciel de l&#39;appareil à base de CDS. </li><li> Sélectionnez le protocole approprié. Le protocole modifié pour la classification avec des PBMC est appelé «cellules agoniste non adhérentes petite planche de démonstration RT 15 min». Aller à la boîte de protocole et sélectionnez ce protocole dans la liste des protocoles </li><li> Initier le protocole en cliquant sur ​​&quot;Démarrer&quot;. </li><li> Le système fluidique intégré ajoute simultanément les composés à tous les puits en injectant de 5 ul par puits pour obtenir une concentration finale de 10 uM dans un volume total de 50 ul. </li><li> Le système basé sur CDS recueille automatiquement les données pendant 15 minutes après l&#39;addition de composé. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des données <ol><li> Sélectionnez gammes basses et hautes fréquences de à utiliser pour calculer les valeurs extraites de la nonles cellules adhérentes. </li><li> Sélectionnez la correction de dérive pour corriger la variation linéaire de mesures d&#39;impédance de base au fil du temps. </li><li> Sélectionner le filtrage des données pour réduire les variations de la mesure de la réponse cinétique due au bruit électronique et addition de composé. </li><li> Sélectionnez la méthode Max-Min pour le temps d&#39;analyse complet. </li><li> Exporter des données vers Excel vertu de l&#39;option de format de plaque. </li><li> Calculer delta G (AG) en soustrayant la moyenne de l&#39;amplitude de la réponse à la stimulation Gi (RmGi) à partir de la moyenne de l&#39;amplitude de la réponse à la stimulation Gs (RMG) à l&#39;aide de la formule suivante: AG = RmGi - RMG </li><li> Calculer le pourcentage de l&#39;effet de pliage (Fe) de l&#39;OPN sur la réponse à médiation par Gi en divisant la moyenne de la réponse amplitude de stimulation Gi en présence de l&#39;OPN (RmGiOPN) avec l&#39;amplitude moyenne de la réponse à la stimulation Gi en présence de PBS ( RmGiPBS) en utilisant la formule suivante: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Reportez-vous à Tmesure 2 pour classer les patients. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Ce travail a conduit à plusieurs brevets tenir par Hôpital Sainte-Justine de l&#39;Université et de nombreux autres sont en cours dans plusieurs pays. Quatrième Dimension Spine LLC est le licencié exclusif du CHU Sainte-Justine.

Nous avons décrit une procédure détaillée d&#39;un essai à base de cellules de pronostic pour la scoliose idiopathique qui est applicable à des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) fraîchement isolées ou conservé congelé pendant jusqu&#39;à un an dans de l&#39;azote liquide. Depuis l&#39;utilisation de PBMC fraîchement isolés est lourd lors de l&#39;essai grand nombre de personnes, la procédure a été présenté avec des PBMC congelés qui offrent une alternative plus pratique en milieu clinique. Cependant, des problèmes avec la cellule agglutination lors de la décongélation ont été rencontrées lors de PBMC congelés ont été initialement utilisées, conduisant parfois à la variabilité inter-essai. Pour maximiser la reproductibilité test, nous recommandons d&#39;éviter cycle gel-dégel et à l&#39;aide de l&#39;échantillon congelé une seule fois. La procédure est très simple, ce qui permet une détection précise de la fonction des protéines Gi défectueux dans un court laps de temps. En utilisant cette procédure, les enfants asymptomatiques et scoliotique peuvent être facilement classés de mieux prévoir l&#39;issue clinique sans danger pour leur santé. HoWever, lors de l&#39;exécution classification selon le degré de réponse maximum de Gi stimulation par rapport aux sujets témoins sains 12, plusieurs exigences pour les sujets de contrôle devrait être atteint. En effet, afin d&#39;avoir une cohorte de comparaison approprié, les sujets de contrôle doivent être âge et le sexe identifié, pas sur tout type de médicaments, et de fournir des renseignements personnels, tels que les antécédents médicaux particuliers / familiale. Ces exigences ne peuvent constituer un obstacle important pour le recrutement des sujets témoins. Par conséquent, effectuer une classification en examinant le degré de déséquilibre entre la réponse à Gs et Gi stimulation de la protéine chez le même individu est idéale pour éliminer la nécessité d&#39;utiliser des sujets témoins. L&#39;utilisation du système basé sur le CDS pour effectuer ce test pronostique est importante en termes de fournir simultanément Gi-réponses cellulaires et Gs médiation dans le même essai. Bien que de nombreux patients peuvent être classés sans hambiguïté en utilisant la gamme dynamique fixe pour ce test, un petit nombre de patients présentent des valeurs à la limite de gammes, comme illustré par les résultats du présent rapport. Pour distinguer ces personnes, nous avons introduit l&#39;évaluation de l&#39;effet de l&#39;OPN sur la réponse à la stimulation Gi en démontrant que OPN induit un effet différentiel sur la réponse cellulaire Gi-médiation entre les trois groupes fonctionnels. En effet, nous avons constaté que, en présence de l&#39;OPN, réponse à Gi stimulation augmente dans FG1, tandis qu&#39;elle diminue dans GR2 GR3 et, dans une plus large mesure dans FG2. Malgré le coût élevé de l&#39;OPN, l&#39;utilisation de cette chimiokine est essentiel de distinguer les cas ambigus, et donc d&#39;améliorer la précision de notre essai de classification. Toutefois, ce dosage présente un inconvénient en ce que un minimum de 1,5 x 10 5 cellules par puits est nécessaire pour observer la réponse cellulaire avec le système à base de CDS dans nos conditions expérimentales. Certains échantillons de patients n&#39;auront pas un nombre suffisant deles cellules à tester. Dans ce cas, il est nécessaire de rappeler les patients pour la collecte de sang supplémentaire, qui peut être inquiétant pour les familles et frustrant pour le personnel médical et de laboratoire. Des études prospectives sont prévues dans notre laboratoire pour résoudre ce problème. Néanmoins, le protocole actuel repose sur des méthodes simples et éprouvées pour préparer des cellules alors que le test est automatisé en utilisant un système validé sans étiquette 13, 14 pour surveiller les réponses des cellules. La plate-forme de test est relativement peu coûteux par rapport à la plate-forme génétique disponible pour le pronostic d&#39;autres maladies. En outre, le coût de tous les matériaux jetables, y compris les tubes de collecte de sang, des conseils, l&#39;électrode spéciale microplaques, et conique et tubes Eppendorf, n&#39;est pas très cher et est estimée à moins de 3000 $ pour effectuer un test pour environ un millier de patients. Bien que cette estimation ne comprend pas les coûts de main-d&#39;œuvre pour la préparation d&#39;échantillonset la réalisation du test, ce test reste beaucoup plus abordable que les plates-formes de séquençage de nouvelle génération. Il convient de noter, c&#39;est non seulement la comparaison des coûts de plates-formes génétiques, mais plus spécifiquement liées au domaine de l&#39;AIS, ce sont les coûts associés à l&#39;imagerie radiologique. Aujourd&#39;hui, plus d&#39;un million d&#39;enfants aux Etats-Unis et environ 100 000 enfants au Canada reçoivent un diagnostic de la scoliose idiopathique, et le coût total du diagnostic et le suivi des enfants scoliotiques par exposition aux rayons X est plus de 2,5 milliards de dollars par an en Amérique du Nord. Ainsi, on s&#39;attend à notre procédure de test à base de cellules pour être adapté pour le dépistage et le suivi des enfants atteints de scoliose idiopathique sans risque pour la santé et à moindre coût routine.

La scoliose idiopathique est une déformation de la colonne vertébrale de cause inconnue généralement définie comme une courbure latérale est supérieure à 10 degrés accompagnés d&#39;une rotation vertébrale 1. La maladie affecte 4% de la population pédiatrique et est le plus souvent diagnostiquée entre l&#39;âge de 9 à 13 ans 2,3,4. Le diagnostic est principalement de l&#39;exclusion et se fait uniquement après avoir écarté les autres causes de déformation de la colonne vertébrale tels que malformation, neuromusculaire ou de troubles syndromiques. Traditionnellement, l&#39;asymétrie trunkal est révélée par Adams essai flexion vers l&#39;avant et mesurée avec scoliomètre lors de l&#39;examen physique 5. Le diagnostic peut être confirmé par observation radiographique de la courbe et de la mesure d&#39;angle selon la méthode de Cobb 6. Une fois diagnostiquée, la principale préoccupation pour les médecins en charge des enfants scoliotiques est de savoir si la courbe va progresser. En effet, la progression de la courbe est souvent imprévisible etest observée chez les filles plus souvent que chez les garçons 7. Si non traitée, la courbe peut progresser de façon spectaculaire, créant une déformation physique importante et même des problèmes cardio-pulmonaires. Ces manifestations deviennent mortelles quand la courbe dépasse 70 ° 8,9. Les options actuelles de traitement pour prévenir ou arrêter la progression de la courbe comprennent contreventement et la chirurgie. En général, contreventement est recommandé pour les courbes entre 25-40 °, tandis que la chirurgie est réservée aux courbes de plus de 45 ° ou qui ne répondent pas à contreventement. Environ 10% des enfants diagnostiqués avec une scoliose idiopathique ont la progression de la courbe nécessitant une intervention chirurgicale corrective 10. Actuellement, il n&#39;existe pas de méthode ou de test disponible pour identifier cette catégorie de patients éprouvée. Par conséquent, tous les enfants diagnostiqués sont soumis à de multiples radiographies sur plusieurs années, habituellement jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la maturité du squelette. On estime que les patients typiques atteints de scoliose devrontenviron 22 examens radiologiques sur une période de 3 ans 11. En raison du risque potentiel de multiples examens radiographiques, les approches alternatives qui pourraient permettre l&#39;exécution du pronostic de la scoliose idiopathique sans exposer les enfants à des rayonnements ionisants sont fortement souhaitable. Avec l&#39;intention de répondre à ce besoin, nous avons déjà mis au point un test de dépistage à base de cellules d&#39;un test pronostique pour identifier tôt les enfants asymptomatiques à risque de développer une scoliose idiopathique. Le test prédit les résultats cliniques chez les enfants asymptomatiques et touchés par l&#39;examen de l&#39;état fonctionnel des protéines Gi et classer les enfants en trois groupes fonctionnels (FG1, FG2 et GR3) selon le degré de réponse maximale à la stimulation de la protéine Gi 12, telle que mesurée par la CDS Système à base d&#39;. Ce système est largement utilisé pour évaluer la transduction des signaux des protéines G par le biais de divers types de cellules 13,14,15,16. Il donne des informations sur laréponse intégrée totale des cellules à des stimuli externes, en mesurant les changements dans l&#39;impédance suite à l&#39;activation des récepteurs de la surface cellulaire. Les cellules sont ensemencées dans des microplaques contenant des électrodes au fond des puits et le système applique une petite tension qui induisent des courants extracellulaires et transcellulaire. À la suite de l&#39;injection du composé dans le puits, les récepteurs de surface des cellules sont stimulées et des événements de transduction de signal se produisent, ce qui conduit à des changements cellulaires qui affectent la circulation de courants extracellulaires et transcellulaire, et affecter de ce fait la grandeur mesurée. Avec cette approche, les patients et les enfants scoliotiques plus à risque de développer une scoliose sont moins sensibles à la stimulation de la protéine Gi par rapport aux sujets témoins sains, et le classement est basé sur le pourcentage de taux de réduction par rapport au groupe témoin. Les gammes de classification sont fixés entre 10 et 40% pour FG3, 40 et 60% pour FG2, et 60 et 90% pour FG1 12. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Plus récemment, nous avons modifié cette approche en démontrant que les trois groupes fonctionnels peuvent être clairement distingués en fonction du profil de déséquilibre entre la réponse à Gi et Gs stimulation. En effet, nous avons constaté que la réponse à la stimulation Gi prédominait dans GR3, alors qu&#39;aucun déséquilibre apparent a été observée dans FG2. En revanche, FG1 exposé prédominance de la réponse à la stimulation Gs. En outre, nous avons fourni la preuve que les patients appartenant à FG2 sont plus à risque de progression vers le point d&#39;avoir besoin d&#39;une intervention chirurgicale 17. La précision de ce test de classification a encore été amélioré par la démonstration d&#39;un effet différentiel de l&#39;ostéopontine (OPN) sur la réponse à la stimulation Gi entre les groupes fonctionnels. Ici, nous documentons les étapes détaillées de procédures expérimentales et analytiques de ce test fonctionnel a effectué dans notre laboratoire.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

Ce protocole détaille la procédure expérimentale et analytique pour un essai à base de cellules développées dans notre laboratoire comme un test fonctionnel pour prédire le pronostic de la scoliose idiopathique chez les enfants asymptomatiques et affectées. Le test consiste en l&#39;évaluation de l&#39;état fonctionnel de Gi et Gs protéines dans des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) par la spectroscopie diélectrique cellulaire (CDS), en utilisant un instrument à base CDS automatisé, et la classification des enfants en trois groupes fonctionnels (FG1 , GR2, GR3) par rapport au profil du déséquilibre entre le degré de réponse à Gs et Gi protéines stimulation. La classification est en outre confirmée par l&#39;effet différentiel de l&#39;ostéopontine (OPN) sur la réponse à la stimulation Gi entre les groupes et la progression rapide de la maladie est référencé par FG2. Environ, un volume de 10 ml de sang est nécessaire pour extraire des PBMC par gradient de Ficoll-cellules et sont ensuite stockés dans de l&#39;azote liquide. Le nombre adéquat de PBMC pour réaliser le dosage est obtenu après deux jours de culture cellulaire. Essentiellement, les cellules sont d&#39;abord incubées avec phytohemmaglutinin (PHA). Après 24 heures d&#39;incubation, milieu est remplacé par un milieu de culture sans PHA pour une 24 heure supplémentaire avant l&#39;ensemencement des cellules et le traitement OPN. Les cellules sont ensuite examinés par spectroscopie pour leurs réponses à la somatostatine et de l&#39;isoprotérénol, qui activent respectivement les protéines Gi et Gs par leurs récepteurs apparentés. Tant la somatostatine et de l&#39;isoprotérénol sont injectés simultanément avec un système fluidique intégré et les réponses des cellules sont surveillés pendant 15 min. Le dosage peut être effectué avec des PBMC fraîches ou congelées et la procédure est terminée en moins de 4 jours.

La viabilité des cellules était comparable entre tous les échantillons avec des valeurs constantes dans la gamme de 86 et 96%. En revanche, de fortes variations ont été observées dans les nombres de cellules dans les échantillons (tableau 3). Sur les 32 échantillons utilisés, deux ont eu un nombre insuffisant de cellules et n&#39;ont pas été classés. Un exemple de résultats de la classification fonctionnelle en fonction du degré de déséquilibre entre Gi et signalisation Gs est montré dans la Figure 3. L&#39;axe vertical de ce chiffre est divisé en trois sections délimitant les groupes fonctionnels avec des gammes dynamiques établies comme&gt; 10 pour GR3, entre +10 et -10 pour FG2, et enfin &lt;-10 pour FG1. Parmi les 30 patients testés ici, 14, 6 et 5 patients ont été clairement classés en GR3, GR2, et FG1, respectivement, tandis que cinq patients, notamment 345, 353, 370, 371, et 382, ​​étaient à la limite de gammes. L&#39;évaluation de l&#39;effet sur la réponse à l&#39;OPN Gi stimulation avait révélé que OPN a augmenté la réponse en papatients 353 et 371. En revanche, la réaction a été réduit de plus de 50% chez les patients 345 et 382 et par moins de 50% chez le patient après un traitement rOPN 370. Ainsi, selon nos critères de classification (tableau 2), nous avons été en mesure de classer les patients 353 et 371 dans FG1, patients et 345 382 dans FG2, et le patient 370 dans GR3. En parallèle, tous les patients ont été évalués pour leur réponse à la stimulation de la protéine Gi et comparés à des sujets témoins. Comme prévu, tous les patients étaient moins sensibles que les sujets témoins et des patients classés dans le même groupe fonctionnel par notre nouveau procédé montré des niveaux similaires de la réponse maximale (Figure 5). En outre, les disparités entre les patients de chaque groupe fonctionnel est compatible avec notre gamme classique de classification 12, validant notre nouvelle procédure. La classification d&#39;une grande cohorte de patients scoliotiques régulièrement suivis dans notre clinique spécialisée à l&#39;Hôpital Sainte-Justine a révélé que les troisdes groupes fonctionnels ont été distribués de manière similaire chez les cas modérés, tandis que le FG2 était prédominante chez les cas graves (figure 6), l&#39;identification des patients classés dans ce groupe fonctionnel comme plus à risque de progression rapide de la maladie et qui indique que ce test de classification peut être utile dans l&#39; pronostic de la scoliose idiopathique. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Solution A </td><td> D-glucose anhydre </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 0,05 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0,98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Solution B </td><td> NaCl </td><td> 140 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Solution saline équilibrée (BSS) </td><td> Solution A </td><td> 1 volume </td></tr><tr><td> Solution B </td><td> 9 volumes </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; médias complet </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycosique </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Médias supplémentaires </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycosique </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Milieu de congélation </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycosique </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> médias de PHA </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycosique </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Phytohémaglutinine </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Essentialsolutions. <table border="1"><tbody><tr><td> Plages dynamiques avec Ag </td><td> Groupes fonctionnels </td><td> Plages dynamiques avec Fe </td></tr><tr><td> Ag &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;Ag &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> Ag&gt; 10 </td><td> GR3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Catégorisation des groupes fonctionnels selon les gammes dynamiques établis avec Ag et Fe. <table border="1"><tbody><tr><td> Patients </td><td> Viabilité (%) </td><td> La concentration cellulaire (× 10 6 / ml) </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88,7 </td><td> 11,64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90,5</td><td> 13,6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94,4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94,3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94,6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91,2 </td><td> 0,82 </td><td> Nombre insuffisant de cellules </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90,3 </td><td> 8,92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92,6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91,3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86,9 </td><td> 7,62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91,2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90,3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95,1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92,3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89,4 </td><td> 7.67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93,5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86,5 </td><td> 2.2 </td><td> Nombre insuffisant de cellules </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92,6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93,4 </td><td> 10,9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92,5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88,8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93,9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92,9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93,1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93,6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92,6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91,1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93,9 </td><td> 14,82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92,1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92,9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89,1 </td><td> 7.73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Pour cent viabilité et concentration cellulaire telle que déterminée en utilisant un compteur de cellules automatique et la viabilité analyseur. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Figure 1. Conception pour l&#39;ensemencement des cellules. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Figure 2.Concevez pour la distribution des composés. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Figure 3. La gamme dynamique de la classification fonctionnelle en utilisant le système basé sur le CDS. Le graphique illustre les valeurs du degré de déséquilibre entre les réponses à Gs et Gi stimulation obtenue dans les PBMC provenant de patients atteints de scoliose idiopathique. Les valeurs ont été mesurées par le système basé sur le CDS en réponse à 10 uM de la somatostatine et de l&#39;isoprotérénol. Chaque point représente la Ag des deux réponses en double. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Figure 4. Effet de rOPN sur la réponse à la stimulation Gi dans les CMSP. Les cellules ont été privées de sérum pendant 18 heures en présence ou en absence de 0,5 pg / ml rOPN et ensuite stimulées avec 10<html> 56; M de la somatostatine pour initier la réponse cellulaire Gi-médiation. Les données dans le graphique ont été générées à partir de l&#39;impédance maximum-minimum et correspondent à la moyenne de la réponse en double exemplaire. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Figure 5. D&#39;état fonctionnel de la protéine Gi dans les CMSP de contrôle et les sujets scoliostic. PBMC de sujets témoins et des patients scoliotiques ont été exposés à des concentrations croissantes de la somatostatine pour stimuler protéines Gi via récepteur de la somatostatine endogène. La réponse cellulaire a été mesurée par un système à base de CDS de la manière décrite dans la section de la procédure. Courbes ont été générées à partir d&#39;impédance maximale et minimale. Chaque courbe représente la régression non linéaire. Les données ont été normalisées à la réponse maximale dans des cellules provenant de sujets de contrôle et chaque point correspond à la moyenne de la réponse en double exemplaire./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Figure 6. Répartition des groupes fonctionnels entre les différentes phases de la scoliose. Une grande cohorte de patients scoliotiques 794 modérés (entre 10-44 ° courbures) et 162 cas graves (courbure supérieur à 45 °) régulièrement suivis à l&#39;Hôpital Sainte-Justine, ont été classés en fonction de leur degré de déséquilibre entre la réponse à Gi et Gs stimulation. Réponses ont été mesurées par le système basé sur le CDS en réponse à 10 uM de la somatostatine et de l&#39;isoprotérénol.

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Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Un protocole structuré est présentée pour un dosage à base de cellules comme un test fonctionnel pour prédire le pronostic de la scoliose idiopathique de l&#39;utilisation de la spectroscopie diélectrique cellulaire (CDS). Le dosage peut être effectué avec des cellules mononucléaires de sang périphérique fraîches ou congelées (PBMC) et la procédure est terminée en moins de 4 jours.

Protocole de dosage à base de cellules pour la prédiction du pronostic de la scoliose idiopathique de l&#39;aide Cellular Spectroscopie Diélectrique

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

cell-based-assay-protocol-for-prognostic-prediction-idiopathic

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K vues.  Sainte-Justine University Hospital Research Center.  Un protocole structuré est présentée pour un dosage à base de cellules comme un test fonctionnel pour prédire le pronostic de la scoliose idiopathique de l'utilisation de la spectroscopie diélectrique cellulaire (CDS). Le dosage peut être effectué avec des cellules mononucléaires de sang périphérique fraîches ou congelées (PBMC) et la procédure est terminée en moins de 4 jours. 

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An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative short-term and long-term effects on the mother. Prior to women undergoing surgery, can we predict who is at risk for developing significant postoperative pain and potentially prevent or minimize its negative consequences? These are the fundamental questions that a team from the University of Washington, Stanford University, the Catholic University in Brussels, Belgium, Santa Joana Women's Hospital in S&atilde;o Paulo, Brazil, and Rambam Medical Center in Israel is currently evaluating in an international research collaboration. The ultimate goal of this project is to provide optimal pain relief during and after cesarean section by offering individualized anesthetic care to women who appear to be more 'susceptible' to pain after surgery.
A significant number of women experience moderate or severe acute post-partum pain after vaginal and cesarean deliveries. 1 Furthermore, 10-15% of women suffer chronic persistent pain after cesarean section. 2 With constant increase in cesarean rates in the US 3 and the already high rate in Brazil, this is bound to create a significant public health problem. When questioning women's fears and expectations from cesarean section, pain during and after it is their greatest concern. 4 Individual variability in severity of pain after vaginal or operative delivery is influenced by multiple factors including sensitivity to pain, psychological factors, age, and genetics. The unique birth experience leads to unpredictable requirements for analgesics, from 'none at all' to 'very high' doses of pain medication. Pain after cesarean section is an excellent model to study post-operative pain because it is performed on otherwise young and healthy women. Therefore, it is recommended to attenuate the pain during the acute phase because this may lead to chronic pain disorders. The impact of developing persistent pain is immense, since it may impair not only the ability of women to care for their child in the immediate postpartum period, but also their own well being for a long period of time.
In a series of projects, an international research network is currently investigating the effect of pregnancy on pain modulation and ways to predict who will suffer acute severe pain and potentially chronic pain, by using simple pain tests and questionnaires in combination with genetic analysis. A relatively recent approach to investigate pain modulation is via the psychophysical measure of Diffuse Noxious Inhibitory Control (DNIC). This pain-modulating process is the neurophysiological basis for the well-known phenomenon of 'pain inhibits pain' from remote areas of the body. The DNIC paradigm has evolved recently into a clinical tool and simple test and has been shown to be a predictor of post-operative pain.5 Since pregnancy is associated with decreased pain sensitivity and/or enhanced processes of pain modulation, using tests that investigate pain modulation should provide a better understanding of the pathways involved with pregnancy-induced analgesia and may help predict pain outcomes during labor and delivery. For those women delivering by cesarean section, a DNIC test performed prior to surgery along with psychosocial questionnaires and genetic tests should enable one to identify women prone to suffer severe post-cesarean pain and persistent pain. These clinical tests should allow anesthesiologists to offer not only personalized medicine to women with the promise to improve well-being and satisfaction, but also a reduction in the overall cost of perioperative and long term care due to pain and suffering. On a larger scale, these tests that explore pain modulation may become bedside screening tests to predict the development of pain disorders following surgery.

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

Diffuse noxious inhibitory control, temporal summation and wound hyperalgesia testing are demonstrated in the obstetric patient. These tests evaluate inhibitory and excitatory mechanisms of pain processing and are here utilized to evaluate endogenous analgesia at different time-points during pregnancy and the peripartum period to help reveal individual s risk for persistent pain.

Un paradigme expérimental pour la prédiction de douleur post-opératoire (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

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Médecine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Une méthode pour isoler l&#39;îlot murin et transplantation rénale sous-capsulaires

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Concentrez Formation: Un test cellulaire pour déterminer le potentiel oncogène d&#39;un gène

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

Diffuse Spectroscopie optique pour l&#39;évaluation quantitative de la toxicité de la peau induit par les rayonnements ionisants aiguë Utilisation d&#39;un modèle de souris

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently inhibit viral replication, they have no direct effect on the expression of viral proteins transcribed from a viral covalently closed circular DNA (cccDNA). As high viral antigen load may play a role in this chronic and HBV-related carcinogenesis, the goal of HBV treatment is to eradicate viral proteins. HBV regulatory protein X (HBx) binds to the host DNA damage-binding protein 1 (DDB1) protein to degrade structural maintenance of chromosomes 5/6 (Smc5/6), resulting in activation of viral transcription from cccDNA. Here, using a split luciferase complementation assay system, we present a comprehensive compound screening system to identify inhibitors of the HBx-DDB1 interaction. Our protocol enables easy detection of interaction dynamics in real time within living cells. This technique may become a key assay to discover novel therapeutic agents for treatment of HBV infection.

Here, we present a method for screening anti-hepatitis B viral agents that inhibit the HBx-DDB1 interaction using a split luciferase assay system. This system allows easy detection of protein-protein interactions and is suitable for identifying inhibitors of such interactions.

Identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1 à l'aide d'un système d'assay Split Luciferase

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic nerve cross-sectional assessment and quantification using 3 T MRI for image acquisition and ImageJ's Fiji software for image processing quantification. Image acquisition was performed using 3 T MRI, with proper instructions for the patient to ensure straight fixation during imaging. A T2-weighted fat suppressed sequence was used. A coronal cut taken 3 mm behind the globe and perpendicular to the optic nerve axis should be uploaded to the software. Using the threshold function, the white matter area of the optic nerve is selected and quantified, thus, eliminating inter-individual measurement bias. We also described the normal limits for the optic nerve cross-sectional area according to age, based on previously published literature. We used the described protocol to assess optic nerve of a suspected glaucoma patient. The optic nerve cross-sectional area was found to be within the normal limits, a finding further confirmed via optical coherence tomography of the optic nerve.

We provided a detailed protocol for a standardized method of optic nerve assessment and quantification using MRI, utilizing a widely available imaging sequence, and open access software for image analysis. Following this standardized protocol would provide meaningful data for comparison between different patients and different studies.

Quantification de la section transversale du nerf optique sur l’IRM: un nouveau protocole utilisant le logiciel Fidji

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...

A Real-World High-Intensity Interval Training Protocol for Cardiorespiratory Fitness Improvement

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, few studies have tested the efficiency of HIIT protocols in a &#34;real world&#34; setting, e.g., HIIT protocols designed for outdoor spaces without specialized equipment. This study presents a &#34;real world&#34; training protocol, named &#34;beep training&#34;, and compares the efficiency of a HIIT regiment versus a traditional long-duration Moderate-Intensity Continuous Training (MICT) regiment using this beep training protocol on VO2 max of overweight untrained men. Twenty-two subjects performed outdoor running with MICT (n = 11) or HIIT (n = 11). Cardiorespiratory fitness was assessed before and after training protocols using a metabolic analyzer. Both training protocols were performed 3 days a week for 8 weeks using the Beep Test results. The MICT group performed the exercise program at 60%-75% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax) and with a progression of the distance of 3,500-5,000 m. The HIIT group performed the interval exercise with 7-10 bouts of 200 m at 85%-100% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax), interspersed with 1 min of passive recovery. Although the HIIT group presented a significantly lower training volume than the MICT group (p &#60; 0.05) after 8 weeks of beep training, HIIT was superior to MICT in improving VO2 max (MICT: ~4.1%; HIIT: ~7.3%; p &#60; 0.05). The &#34;real world&#34; HIIT regiment based on beep training protocol is a time-efficient, low-cost, and easy-to-implement protocol for overweight untrained men.

This study presents a low-cost and easy-to-implement "real world" high-intensity interval training (HIIT) protocol for scientific research and discusses its efficiency for cardiorespiratory fitness.

Un protocole d’entraînement par intervalles de haute intensité dans le monde réel pour l’amélioration de la condition physique cardiorespiratoire

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, ...

Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug against hyperlipidemia in Traditional Chinese Medicine (TCM) and Indian Medicine theories, however the potential mechanism requires further exploration. The present research aims to reveal the mechanism of FP against hyperlipidemia based on an integrated strategy combining network pharmacology prediction with metabolomics validation. A high-fat diet (HFD)-induced mice model was established by evaluating the plasma lipid levels, including total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). Network pharmacology was applied to find out the active ingredients of FP and potential targets against hyperlipidemia. Metabolomics of plasma and liver were performed to identify differential metabolites and their corresponding pathways among the normal group, model group, and intervention group. The relationship between network pharmacology and metabolomics was further constructed to obtain a comprehensive view of the process of FP against hyperlipidemia. The obtained key target proteins were verified by molecular docking. These results reflected that FP improved the plasma lipid levels and liver injury of hyperlipidemia induced by a HFD. Gallic acid, quercetin, and beta-sitosterol in FP were demonstrated as the key active compounds. A total of 16 and six potential differential metabolites in plasma and liver, respectively, were found to be involved in the therapeutic effects of FP against hyperlipidemia by metabolomics. Further, integration analysis indicated that the intervention effects were associated with CYP1A1, AChE, and MGAM, as well as the adjustment of L-kynurenine, corticosterone, acetylcholine, and raffinose, mainly involving tryptophan metabolism pathway. Molecular docking ensured that the above ingredients acting on hyperlipidemia-related protein targets played a key role in lowering lipids. In summary, this research provided a new possibility for preventing and treating hyperlipidemia.

The present protocol describes an integrated strategy for exploring the key targets and mechanisms of Fructus Phyllanthi against hyperlipidemia based on network pharmacology prediction and metabolomics verification.

Prédiction pharmacologique en réseau et validation métabolomique du mécanisme de Fructus phyllanthi contre l’hyperlipidémie

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug ...

Découverte non invasive de biomarqueurs pour la protéomique des larmes à l’aide de la LC-MS

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser l’analyse du liquide lacrymal à l’aide d’un protocole normalisé pour la recherche en protéomique 

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

Préparation d’échantillons de piégeage de suspension de protéines pour la protéomique lacrymale par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...