Les auteurs tiennent à remercier Cairn Research Ltd. pour leur aimable contribution financière qui a couvert les coûts de production de cette publication. De plus, nous remercions Mme Ines Mueller et Mme Stefanie Kestel pour leur excellent soutien technique.
Les recherches des auteurs sont soutenues par le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 et dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne - EXC 2067/1- 390729940) et la Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).

1. Préparations cellulaires
REMARQUE: Les CS IPS humains utilisés dans ce protocole ont été dérivés de donneurs sains et différenciés en monocouches en utilisant une modulation de petites molécules entièrement définie des techniques de signalisation WNT et de purification du lactate comme décrit précédemment12,13,14. Les iPSC-CM ont été maintenus tous les 2-3 jours avec un milieu de culture décrit ci-dessous.
<ol><li>Préparer un milieu de culture de milieu basal (RPMI 1640) et un supplément à 2% (B27). Conserver à 4 °C. Utilisation à température ambiante (RT).</li>
	<li>Préparer un milieu de placage de milieu basal (RPMI 1640), de supplément à 2% (B27) et d’inhibiteur de ROCK 1:2000. Conserver à 4 °C. Utilisation à RT.</li>
	<li>Recouvrir les couvercles en verre rond #0 de 10 mm stérilisés avec 150 μL de matrice de membrane basale sans facteur 1:60 et incuber à 4 °C pendant 4 h. REMARQUE: L’optimisation du volume de glissement des couvercles est nécessaire pour s’assurer que tout le verre est recouvert tout en maintenant une tension superficielle adéquate pour éviter les déversements. 150 μL est recommandé pour les couvercles ronds de 10 mm. La taille du lot, le type de couvercle, le volume du couvercle et le type de plaque de culture peuvent être adaptés aux besoins des expérimentateurs.</li>
	<li>Commencez la dissociation iPSC-CM avec un réactif de dissociation cellulaire à base d’EDTA. Assurez-vous que la monocouche est complètement détachée en rinçant doucement avec une pipette de 1 000 μL.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et ajouter un milieu de placage à double volume. Centrifuger pendant 10 min à 100 x g.</li>
	<li>Resuspendez la pastille avec le volume souhaité (volume de remise en service) du milieu de placage. Compter les cellules manuellement ou électroniquement.</li>
	<li>Sélectionnez la densité optimale par couvercle (15 000) qui permettra l’analyse cellulaire isolée plus tard.</li>
	<li>Calculez le volume de suspension cellulaire « active » (A) nécessaire pour plaquer tous les couvercles à cette densité souhaitée. Appliquez la formule suivante et retirez dans un tube séparé: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ01v2.jpg">
</li>
	<li>Calculez le volume de milieu de placage supplémentaire (B) nécessaire pour accueillir chaque couvercle à un volume souhaité. Appliquez la formule suivante et ajoutez le volume obtenu au tube de suspension active: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ02v2.jpg">
</li>
	<li>Retirez la matrice des couvercles et appliquez le « volume du couvercle » de la suspension cellulaire (A + B) sur chaque couvercle. Ressuspendez régulièrement dans le tube pour assurer une distribution cellulaire uniforme.</li>
	<li>Incuber à 37 °C pendant 1 h. Remplissez doucement le puits avec du milieu de placage.</li>
	<li>Après 24 h, échangez les médias avec le milieu de culture normal et maintenez tous les 2-3 jours.</li>
</ol>2. Configuration expérimentale
<ol><li>Équipez un microscope à épifluorescence inversée d’une lentille à haute ouverture numérique à grossissement de 40x (N.A: > 0,75) pour mener des expériences.</li>
	<li>Couplez une LED blanche chaude à commutation rapide sur le port d’éclairage transmis du microscope. Insérez un simple filtre rouge de 660 nm dans le trajet de la lumière transmise. REMARQUE: Cette lumière peut être activée tout au long des expériences de photométrie pour observer l’échantillon sans contaminer le signal fluorescent vert.</li>
	<li>Montez une tête LED à commutation rapide de 470 nm pour l’enregistrement photométique. Insérez un filtre d’excitation 470/40 à l’angle épifluorescent du microscope pour nettoyer la lumière générée par la LED. REMARQUE: Pour une quantification optimale du signal, un système d’éclairage avec contrôle de rétroaction à haute vitesse de la sortie optique est recommandé.</li>
	<li>Insérez un cube de microscope contenant un séparateur de faisceau de passage de 495 nm de long dans le carrousel de l’unité miroir du microscope.</li>
	<li>Ajustez un bras de détection contenant un diaphragme de champ réglable sur le port de monture C du microscope pour permettre la sélection de la région d’intérêt.</li>
	<li>Couplez séparément un détecteur photomultiplicateur (PMT) et une caméra USB au microscope. Cela constituera la base du système de détection des émissions.</li>
	<li>Insérez un cube filtrant contenant un séparateur de faisceau passe-long de 565 nm et un filtre d’émission 535/50 dans le port PMT. Cela divise la lumière d’émission entre les deux détecteurs. REMARQUE: Une caméra fixée au port transmis du système de détection des émissions peut détecter la lumière transmise sous fond clair tout au long de toutes les expériences.</li>
	<li>Couplez le PMT à une alimentation et à un amplificateur PMT. Connectez la sortie de l’amplificateur PMT à une broche d’entrée analogique d’un système d’acquisition de données.</li>
	<li>Filtrez les données analogiques du PMT à 1 kHz ou plus.</li>
	<li>Numérisez les données à une fréquence au moins le double de celle de la fréquence la plus élevée présente dans le signal analogique (2 kHz ou plus) pour répondre aux critères de Nyquist et empêcher l’aliasing.</li>
</ol>3. Chargement cellulaire avec VF2.1Cl
REMARQUE: Toutes les étapes impliquant ce colorant doivent être effectuées dans des conditions de faible luminosité.
<ol><li>Préparer une solution de bain de Tyrode de (en mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glucose, 4 KCl, 1 MgCl2,2 CaCl2,pH = 7,35 et chaud à 37 °C.</li>
	<li>Préparer une aliquote de solution de chargement dans un tube de microcentrifugation en mélangeant 5 μL de 1 000 x VF2.1Cl et 50 μL de solution de poloxamère solubilisante à 20 %.</li>
	<li>Appliquer 5 μL de la solution de chargement sur 5 mL de solution de Tyrode chauffée (concentration totale de colorant de 0,1x) dans une boîte de Petri de 20 mm. REMARQUE: La concentration finale de colorant est de 0,1x. C’est1/10ème de ce qui a été suggéré par le fabricant. Cela permet de préserver les ressources, d’assurer une cytotoxicité négligeable et, surtout, de conserver des signaux optiques clairs provenant de cellules chargées avec des rapports signal/bruit élevés.</li>
	<li>Ajouter un seul couvercle iPSC-CM au plat et incuber à 37 °C pendant 20 min.</li>
	<li>Assemblez une chambre d’imagerie à cellules vivantes chauffée. Montez sur l’étage du microscope et remplissez avec 500 μL de solution fraîche de Tyrode.</li>
	<li>Laver le couvercle avec la solution fraîche de Tyrode à 37 °C.</li>
	<li>Appliquez soigneusement le couvercle iPSC-CM sur la chambre de bain préchauffée à l’aide de pinces à pointe fine. REMARQUE: Assurez-vous que la chambre et son contenu sont toujours chauffés à des températures physiologiques. Si vous le souhaitez, commencez par une perfusion continue de la solution de Tyrode réchauffée.</li>
</ol>4. Stimulation du champ électrique
REMARQUE: Le déclenchement externe d’iPSC-CM est facultatif mais utile pour la normalisation de la dynamique cellulaire et des paramètres expérimentaux. Il augmente la facilité d’analyse et permet d’enquêter sur les effets dépendant de la fréquence.
<ol><li>Fixez un insert de stimulation avec deux électrodes en platine espacées de 5 mm dans la chambre d’enregistrement.</li>
	<li>Connectez un stimulateur externe à l’insert de stimulation. Réglez sur des impulsions de champ bipolaire de 5 ms à 0,5 Hz.</li>
	<li>Déterminez la tension de stimulation optimale en augmentant le stimulus de 1 V vers le haut. Le stimulus de seuil est défini comme la tension la plus basse à laquelle les cellules commencent à se contracter. Appliquez des tensions d’environ 25 % au-dessus de ce seuil. La plage normale est comprise entre 1 V et 30 V.</li>
	<li>Fixez la fréquence de stimulation avec le stimulateur externe ou déclenchez-la avec un logiciel d’acquisition.</li>
</ol>5. Acquisition de potentiel d’action optique
REMARQUE: Ce protocole utilise un logiciel commercial pour l’acquisition et l’analyse.
<ol><li>Visualisez les myocytes en mode champ clair à l’aide du chemin de lumière transmis et de la caméra USB.</li>
	<li>Sélectionnez une cellule isolée et recadrez étroitement son chemin optique avec le diaphragme de champ en veillant à ce que seule la lumière de la cellule d’intérêt soit surveillée.</li>
	<li>Activez l’amplificateur PMT et réglez l’alimentation PMT sur 750 V.</li>
	<li>Exécutez le protocole de stimulation (voir étape 4) avec le logiciel d’acquisition et activez simultanément la lumière d’excitation de 470 nm. Ce dernier peut se faire via un panneau distant ou automatisé à une intensité fixe (signal TTL).</li>
	<li>Ajustez le gain et le décalage de l’amplificateur PMT pour vous assurer que le signal ne sature pas et est optimisé pour la plage de détection du système d’enregistrement.</li>
	<li>Enregistrez 10 balayages en veillant à ce que des potentiels d’action stables soient détectés.</li>
	<li>Continuez l’enregistrement et déplacez immédiatement l’étage du microscope pour acquérir brièvement le signal de fond d’une région dépourvue de cellules. Éteignez le voyant d’excitation. REMARQUE: Cette valeur de fond(décalage F) sera utilisée pour tenir compte de toute fluorescence de fond.</li>
	<li>Si vous le souhaitez, perfuser localement des médicaments de référence tels que la nifédipine de 1 μM pour identifier les réponses cellulaires à la manipulation pharmacologique.</li>
	<li>De manière séquentielle, répétez les étapes 5.2 à 5.7, en sélectionnant chaque fois une nouvelle cellule. Remplacez les couvercles si vous le souhaitez pour assurer un roulement expérimental élevé en une seule séance. REMARQUE : Les protocoles de chargement et d’acquisition d’images sont décrits à la figure 2.</li>
</ol>6. Analyse des données
<ol><li>Ouvrez un enregistrement enregistré avec le logiciel d’analyse et en moyenne 10 balayages contenant des potentiels d’action stimulés à partir d’une seule cellule.</li>
	<li>Prenez une moyenne du signal de base représentant ledécalage F et soustrayez-la de la trace moyenne.</li>
	<li>Calculer ∆F/F0 avec la formule suivante (où F est mesuré fluorescence et F0 est fluorescence diastolique) : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ03v2.jpg">
</li>
	<li>Identifier la trace de référence (diastolique) et la zone d’intérêt (PA) et mesurer les paramètres de potentiel d’action cardiaque souhaités. Cela inclut, mais sans s’y limiter, le temps de désintégration pour la repolarisation à50%(APD 50) età 90%(APD 90).</li>
	<li>Exportez les données de cette cellule unique vers un tableur.</li>
	<li>Répétez les étapes 6.1 à 6.5 pour tous les enregistrements. Évaluer les résultats à l’auprès de tests non appaire appropriés ou d’une analyse de la variance.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2.jpg"> Figure 2 : Protocoles de chargement et d’acquisition d’images. (A) Organigramme du protocole complet de chargement VF2.1Cl pour les iPSC-CM et les cardiomyocytes natifs. (B) Schéma simplifié des configurations de séparateur de faisceau (BS) et de filtre utilisées dans ce protocole pour l’excitation et la détection de l’émission de VF2.1Cl en réponse aux changements de tension transmembranaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<ol>
	<li>Miller, E. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+fluorescence+of+amphiphilic+hemicyanine+dyes+in+neuron+membrane.">Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).</li><li>Salama, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+new,+long-wavelength,+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart.">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+action+potentials+and+subthreshold+electrical+events+imaged+in+neurons+with+a+fluorescent+protein+voltage+probe.">Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe.</a> Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).</li><li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin.">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).</li><li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins.">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li><li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements.">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3 (6), 2514 (2008).</li><li>Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submillisecond+optical+reporting+of+membrane+potential+in+situ+using+a+neuronal+tracer+dye.">Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye.</a> The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).</li><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+&amp;+tissues.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells &amp; tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li><li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution,+contraction,+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts.">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).</li><li>Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrophysiological+and+mechanical+effects+of+2,3-butane-dione+monoxime+and+cytochalasin-D+in+the+Langendorff+perfused+rabbit+heart.">The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).</li><li>K&#233;pir&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+Myosin+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li></ol>

Cairn Research Ltd a soutenu cette publication en couvrant les coûts de production du fichier vidéo.

Nous décrivons ici un protocole de base permettant d’acquérir facilement des profils AP détaillés à partir d’iPSC-CM isolés adaptés à la modélisation électrophysiologique et au dépistage de médicaments cardiaques. Nous détectons des points d’accès réguliers et robustes à partir de nos iPSC-MC peu ensemencés, ce qui suggère à la fois la fonctionnalité des indicateurs et la fidélité méthodologique.
En raison du large éventail de méthodologies commerciales pour la r...

La modélisation électrophysiologique des cardiomyocytes et la construction de plateformes efficaces pour le dépistage des médicaments cardiaques sont essentielles pour le développement de stratégies thérapeutiques pour une variété de troubles arythmiques. L’expansion rapide de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (IPSC) a produit des percées prometteuses dans la modélisation des maladies humaines et l’investigation pharmacologique à l’aide de cardiomyocytes dérivés de patients isolés (iPSC-CM). Les techniques de « référence » pour la caractérisation électrophysiologique de ces cellules par patch-clamp (current-clamp) peuvent quantifier la morphologie et la durée du potentiel d’action (AP), cependant, cette méthode est incroyablement complexe et lente, et mal adaptée à l’acquisition de données à haut débit1. On rapporte régulièrement que les iPSC-CM ont un potentiel de membrane diastolique accru et un courant de fuite accru par rapport aux cardiomyocytes natifs adultes2. Il est suggéré que la plus petite taille des cellules et la capacité membranaire réduite observée dans les iPSC-CM peuvent produire une erreur systématique lors de l’utilisation de la technique de serrage de courant, expliquant peut-être ces écarts3. Afin de maximiser l’utilité d’une plate-forme iPSC-CM, une méthode supplémentaire est précieuse pour augmenter le débit et assurer la précision des données lors de la caractérisation des changements de tension transmembranaire au niveau d’une seule cellule dans les iPSC-CM.
Les colorants sensibles à la tension (VSD) sont depuis longtemps une méthode proposée pour fournir une analyse plus rapide, non invasive et équivalente de la cinétique des AP cardiaques par rapport à celles des techniques traditionnelles4. Une étude récente a démontré l’adéquation de la photométrie de sonde sensible à la tension ratiométrique pour quantifier avec précision l’APcardiaque 5. De plus, la capacité d’étendre facilement les approches de photométrie optique prête cette technique aux écrans de cardiotoxicité à grande échelle essentiels au développement de médicaments thérapeutiques (par exemple, CiPA). Le développement de protocoles de cardiotoxicité standardisés dans le cas d’une étude multi-sites en aveugle utilisant des techniques optiques de réseau de microélectrodes et de détection de tension a démontré la valeur clé de cette approche6.
De nombreux colorants potentiométriques sont disponibles dans le commerce, et le développement synthétique en cours de nouvelles sondes montre un potentiel passionnant pour rationaliser leur efficacité dans une variété de constructions cardiaques et neuronales. Le VSD idéal aura une cinétique et une sensibilité accrues, tout en affichant une diminution de la charge capacitive, du photobleaching et de la cytotoxicité. Le VF2.1Cl (FluoVolt) récemment synthétisé exprime bon nombre de ces propriétés bénéfiques en grande partie en raison de sa nouvelle structure moléculaire filaire, partagée par d’autres membres de la nouvelle famille VoltageFluor (VF)7. Contrairement aux VSD électrochromes courants dans lesquels de simples sondes se conjuguent moléculairement et électriquement à la membrane plasmique, ce colorant consiste en un fil synthétique inséré passivement et couvrant la membrane qui associe un donneur riche en électrons à un fluorophore de fluorescéine modifié (FITC). Les détails mécanistes sont fournis à la figure 1. Ce colorant démontre une excellente sensibilité aux fluctuations de tension de la membrane, affichant un changement de 27% de l’intensité d’émission par 100 mV contre environ 10% observé dans d’autres sondes courantes à des vitesses comparables7. En outre, les systèmes PeT à base de fil n’interagissent pas directement avec le champ électrique cellulaire, ce qui produit des interférences électriques minimales et des changements négligeables de la charge capacitive cellulaire.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg"> Figure 1 : Paramètres chimiques, spectraux et mécanistes du colorant VF2.1Cl. (A) Structure chimique de VF2.1Cl. Les caractéristiques moléculaires à noter comprennent de multiples groupes alkyles dans le fil moléculaire phénylène vinylène qui facilitent l’insertion dans la membrane plasmique. Un groupe d’acide sulfonique chargé négativement conjugué à la sonde FITC assure la stabilisation du fluorophore sur la surface extracellulaire et facilite l’insertion près perpendiculaire par rapport au champ électrique de la bicouche lipidique. (B) Schéma simplifié de VF2.1Cl perpendiculaire s’intégrant dans la membrane plasmique d’une cellule cible. (C) Spectres d’absorption et d’émission du colorant VF2.1Cl. Spectra est identique à celui des sondes FITC et GFP standard. (D) Représentation du mode d’action mécaniste de VF2.1Cl. Dans des conditions de repos (hyperpolarisées), des tensions intracellulaires négatives entraînent les électrons libres vers le fluorophore rostral. L’abondance d’électrons garantit que le transfert d’électrons photo-induit (PeT) est privilégié comme une voie hors de l’état excité après l’excitation optique, éteignant efficacement la fluorescence. En revanche, un potentiel membranaire dépolarisé influence le mouvement descendant des électrons favorisant la fluorescence lors de l’excitation optique. La réponse fluorescente qui en résulte est linéairement liée à la tension de la membrane et peut être utilisée avec précision pour recueillir des informations temporelles détaillées sur la cinétique électrophysiologique cellulaire. (E) Images représentatives en champ lumineux (supérieur) et fluorescence à 470 nm (inférieur) de cardiomyocytes de léporine chargés de VF2.1Cl. (F) Z pile d’un seul cardiomyocyte chargé. Les flèches indiquent les zones de localisation claire de VF2.1Cl à la membrane cellulaire. Les images ont été acquises avec un système confocal à disque rotatif composé d’une tête confocale à disque rotatif X-lightv3 avec un motif sténopé de 50 μm; Illuminateur LDI-7; Caméra Prime95B et objectif PlanApo Lambda 100x. Barre d’échelle : 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La sonde FITC conjuguée à VF2.1Cl garantit qu’elle peut être utilisée efficacement dans des configurations de filtre standard et GFP, et qu’elle ne nécessite qu’un système d’acquisition à canal unique, qui sont toutes deux des caractéristiques communes des plates-formes d’imagerie fluorescente. L’analyse de monocouches iPSC-CM humaines denses avec ce colorant a été récemment rapportée8,9,10,11. Notre protocole diffère de ces études en raison de notre étude des iPSC-CC uniques et isolés, non perturbés par les influences électriques et paracrines des monocouches syncytaires denses, et de notre utilisation d’un système de photométrie abordable et personnalisable par opposition à des arrangements complexes d’imagerie confocale ou à grand champ.
Nous décrivons ici notre protocole pour l’acquisition et l’analyse rapides de points d’accès optiques robustes à partir de cardiomyocytes humains isolés dérivés de l’iPSC et de cardiomyocytes natifs (voir Dossier supplémentaire). Nous utilisons VF2.1Cl couplé à une plate-forme de pointe personnalisable pour les mesures de photométrie à cellule unique. Ces protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d’éthique du Centre médical universitaire de Göttingen (n° 10/9/15).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 Trypsin EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>HN04.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous&#160;BioChemica</td>
			<td>ITW Reagents</td>
			<td>A1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt Membrane Potential Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>HN77.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamanin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21829-25-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor Y27632</td>
			<td>Stemolecule</td>
			<td>04-0012-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15040033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>495LP Dichroic Beamsplitter&#160;</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circle Coverslips, Thickness 0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00100RA020MNT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual OptoLED Power Supply&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET470/40x Excitation Filter&#160;</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET535/50m</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etched Neubauer Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cubes&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoLED</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiport Adaptors&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myopacer Cell Stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optomask Shutter&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optoscan System Controller</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-1 Temperature Controlled Platform&#160;&#160;</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier Detector&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Amplifier Insert</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Supply Insert</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC-26G Open Bath Chamber&#160;</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-OLY/2AL Stage Adaptor&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T565lpxr Dichroic Beamsplitter&#160;</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T660lpxr Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 Dual Channel Temperature Controller&#160;</td>
			<td>npi Electronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLFLN 40X Objective</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB 3.0 Colour Camera&#160;</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex 11.1</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit 11.1</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IC Capture 2.4&#160;</td>
			<td>Imaging Source&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

Les techniques conventionnelles de microélectrode intracellulaire pour quantifier l’électrophysiologie des cardiomyocytes sont extrêmement complexes, nécessitent beaucoup de main-d’œuvre et sont généralement réalisées à faible débit. L’expansion rapide et continue de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSI) constitue une nouvelle norme dans la recherche cardiovasculaire et d’autres méthodes sont maintenant nécessaires pour augmenter le débit de données électrophysiologiques au niveau d’une seule cellule. VF2.1Cl est un colorant sensible à la tension récemment dérivé qui fournit une réponse rapide à canal unique et de grande magnitude aux fluctuations du potentiel membranaire. Il possède une cinétique supérieure à celle des autres indicateurs de tension existants et met à disposition des données fonctionnelles équivalentes à celles des techniques traditionnelles de microélectrode. Ici, nous démontrons une caractérisation simplifiée et non invasive du potentiel d’action dans des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC à rythme externe à l’aide d’un système de photométrie modulaire et très abordable.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg"> Figure 3 : Profils de potentiel d’action optique (PA) de cardiomyocytes natifs isolés et de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC-CM). (A) AP optique représentatif d’un seul cardiomyocyte murin (au centre) avec un SEM moyen ± d’APD50 et aPD90 (n = 7, à droite). (B) AP optiqu...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Nous décrivons ici l’acquisition optique et la caractérisation des potentiels d’action à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites à l’aide d’un système de photométrie modulaire à grande vitesse.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K vues.  University Medical Center Goettingen, Goettingen, Germany. Nous décrivons ici l’acquisition optique et la caractérisation des potentiels d’action à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites à l’aide d’un système de photométrie modulaire à grande vitesse.

Vidéo: Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Cartographie optique de potentiels d&#39;action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput electrophysiological approaches for hiPSC-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) preparations is much needed for efficient drug testing. Although multielectrode arrays (MEAs) are frequently employed for field potential measurements of excitable cells, a recent publication by Joshi-Mukherjee and colleagues described and validated its application for recurrent action potential (AP) recordings from the same hiPSC-CM preparation over days. The aim here is to provide detailed step-by-step methods for seeding CMs and for measuring AP waveforms via electroporation with high precision and a temporal resolution of 1 &#181;s. This approach addresses the lack of easy-to-use methodology to gain intracellular access for high-throughput AP measurements for reliable electrophysiological investigations. A detailed work flow and methods for plating of hiPSC-CMs on multiwell MEA plates are discussed emphasizing critical steps wherever relevant. In addition, a custom-built MATLAB script for rapid data handling, extraction and analysis is reported for comprehensive investigation of the waveform analysis to quantify subtle differences in morphology for various AP duration parameters implicated in arrhythmia and cardiotoxicity.

This article contains a set of protocols for the development of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) networks cultured on multiwell MEA plates to reversibly electroporate the cell membrane for action potential measurements. High-throughput recordings are obtained from the same cell sites repeatedly over days.

Réseaux de cardiomyocytes dérivés de l'iPSC sur des réseaux de micro-électrodes multipuits pour des enregistrements potentiels d'action récurrents

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney disease and eventual end-stage renal failure are often caused by the damage to the glomerular podocytes, which are the highly specialized epithelial cells that function together with endothelial cells and the glomerular basement membrane to form the kidney&#8217;s filtration barrier. Advances in renal medicine have been hindered by the limited availability of primary tissues and the lack of robust methods for the derivation of functional human kidney cells, such as podocytes. The ability to derive podocytes from renewable sources, such as stem cells, could help advance current understanding of the mechanisms of human kidney development and disease, as well as provide new tools for therapeutic discovery. The goal of this protocol was to develop a method to derive mature, post-mitotic podocytes from human induced pluripotent stem (hiPS) cells with high efficiency and specificity, and under chemically defined conditions. The hiPS cell-derived podocytes produced by this method express lineage-specific markers (including nephrin, podocin, and Wilm&#8217;s Tumor 1) and exhibit the specialized morphological characteristics (including primary and secondary foot processes) associated with mature and functional podocytes. Intriguingly, these specialized features are notably absent in the immortalized podocyte cell line widely used in the field, which suggests that the protocol described herein produces human kidney podocytes that have a developmentally more mature phenotype than the existing podocyte cell lines typically used to study human kidney biology.

Presented here is a chemically defined protocol for the derivation of human kidney podocytes from induced pluripotent stem cells with high efficiency (&#62;90%) and independent of genetic manipulations or subpopulation selection. This protocol produces the desired cell type within 26 days and could be useful for nephrotoxicity testing and disease modeling.

Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of functional models that can accurately predict human biological responses and nephrotoxicity. Advancements in kidney precision medicine could help overcome these limitations. However, previously established in vitro models of the human kidney glomerulus-the primary site for blood filtration and a key target of many diseases and drug toxicities-typically employ heterogeneous cell populations with limited functional characteristics and unmatched genetic backgrounds. These characteristics significantly limit their application for patient-specific disease modeling and therapeutic discovery. 
This paper presents a protocol that integrates human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived glomerular epithelium (podocytes) and vascular endothelium from a single patient to engineer an isogenic and vascularized microfluidic kidney glomerulus chip. The resulting glomerulus chip is comprised of stem cell-derived endothelial and epithelial cell layers that express lineage-specific markers, produce basement membrane proteins, and form a tissue-tissue interface resembling the kidney's glomerular filtration barrier. The engineered glomerulus chip selectively filters molecules and recapitulates drug-induced kidney injury. The ability to reconstitute the structure and function of the kidney glomerulus using isogenic cell types creates the opportunity to model kidney disease with patient specificity and advance the utility of organs-on-chips for kidney precision medicine and related applications.

Presented here is a protocol to engineer a personalized organ-on-a-chip system that recapitulates the structure and function of the kidney glomerular filtration barrier by integrating genetically matched epithelial and vascular endothelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. This bioengineered system can advance kidney precision medicine and related applications.

Puce de glomérule rénal isogénique conçue à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used in regulatory submissions. Here, we extend their use to cardiac medical device safety or performance assessments. We developed a novel method to evaluate cardiac medical device contractile properties in robustly contracting 2D hiPSC-CMs monolayers plated on a flexible extracellular matrix (ECM)-based hydrogel substrate. This tool enables the quantification of the effects of cardiac electrophysiology device signals on human cardiac function (e.g., contractile properties) with standard laboratory equipment. The 2D hiPSC-CM monolayers were cultured for 2-4 days on a flexible hydrogel substrate in a 48-well format.
The hiPSC-CMs were exposed to standard cardiac contractility modulation (CCM) medical device electrical signals and compared to control (i.e., pacing only) hiPSC-CMs. The baseline contractile properties of the 2D hiPSC-CMs were quantified by video-based detection analysis based on pixel displacement. The CCM-stimulated 2D hiPSC-CMs plated on the flexible hydrogel substrate displayed significantly enhanced contractile properties relative to baseline (i.e., before CCM stimulation), including an increased peak contraction amplitude and accelerated contraction and relaxation kinetics. Furthermore, the utilization of the flexible hydrogel substrate enables the multiplexing of the video-based cardiac-excitation contraction coupling readouts (i.e., electrophysiology, calcium handling, and contraction) in healthy and diseased hiPSC-CMs. The accurate detection and quantification of the effects of cardiac electrophysiological signals on human cardiac contraction is vital for cardiac medical device development, optimization, and de-risking. This method enables the robust visualization and quantification of the contractile properties of the cardiac syncytium, which should be valuable for nonclinical cardiac medical device safety or effectiveness testing. This paper describes, in detail, the methodology to generate 2D hiPSC-CM hydrogel substrate monolayers.

Here, we demonstrate a non-invasive cardiac medical device contractility evaluation method using 2D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) monolayers, plated on a flexible substrate, coupled with video-based microscopy. This tool will be useful for the in vitro evaluation of the contractile properties of cardiac electrophysiology devices.

Évaluation de la thérapie de modulation de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes 2D dérivés de cellules souches humaines

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

Génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de cellules souches pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

Génération, criblage à haut débit et biobanque de sphéroïdes cardiaques dérivés de cellules souches pluripotentes d’origine humaine

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical cardiotoxicity testing. In two-dimensional monolayer formats, hiPSC-CMs recapitulate the structure and function of the adult human heart muscle cells when cultured on an optimal extracellular matrix (ECM). A human perinatal stem cell-derived ECM (maturation-inducing extracellular matrix-MECM) matures the hiPSC-CM structure, function, and metabolic state in 7 days after plating. 
Mature hiPSC-CM monolayers also respond as expected to clinically relevant medications, with a known risk of causing arrhythmias and cardiotoxicity. The maturation of hiPSC-CM monolayers was an obstacle to the widespread adoption of these valuable cells for regulatory science and safety screening, until now. This article presents validated methods for the plating, maturation, and high-throughput, functional phenotyping of hiPSC-CM electrophysiological and contractile function. These methods apply to commercially available purified cardiomyocytes, as well as stem cell-derived cardiomyocytes generated in-house using highly efficient, chamber-specific differentiation protocols. 
High-throughput electrophysiological function is measured using either voltage-sensitive dyes (VSDs; emission: 488 nm), calcium-sensitive fluorophores (CSFs), or genetically encoded calcium sensors (GCaMP6). A high-throughput optical mapping device is used for optical recordings of each functional parameter, and custom dedicated software is used for electrophysiological data analysis. MECM protocols are applied for medication screening using a positive inotrope (isoprenaline) and human Ether-a-go-go-related gene (hERG) channel-specific blockers. These resources will enable other investigators to successfully utilize mature hiPSC-CMs for high-throughput, preclinical cardiotoxicity screening, cardiac medication efficacy testing, and cardiovascular research.

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) offer an alternative to using animals for preclinical cardiotoxicity screening. A limitation to the widespread adoption of hiPSC-CMs in preclinical toxicity screening is the immature, fetal-like phenotype of the cells. Presented here are protocols for robust and rapid maturation of hiPSC-CMs.

Criblage de cardiotoxicité à haut débit utilisant des monocouches de cardiomyocytes de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme mature

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...