Nous remercions RB Tesh pour fournir la souris des anticorps polyclonaux anti-RVFV sérum et M. Griffin de l&#39;UTMB cytométrie en flux Core Facility de l&#39;aide avec la cytométrie de flux. Ce travail a été soutenu par 5 U54 AI057156 par le Centre régional de l&#39;Ouest de l&#39;excellence, NIH R01 AI08764301 et le financement du Centre Sealy pour le développement de vaccins à UTMB.BK a été soutenu par le Fonds James W. McLaughlin Fellowship à UTMB.OL a été soutenue par une bourse de chercheur Maurice R. Hilleman stade précoce carrière.

Analyse de la transcription par microscopie à fluorescence 1. Infecter les cellules avec MP-12 et étiquettes ARN naissant avec l&#39;UE <ol><li> Placer les lamelles rondes de 12 mm dans la plaque de culture tissulaire à 12 puits, une lamelle par puits. </li></ol> Note: Si les cellules ont du mal à adhérer à lamelles, manteau avec de la poly-L-lysine (MW ≥ 70.000) avant de le placer dans les puits. Dans ce but, des lamelles de plonger dans une solution mg / ml stérile à 0,1 en H 2 O de poly-L-lysine pendant 5 min. Rincer lamelles avec H 2 O stérile et sécher à l&#39;air pendant au moins 2 heures. <ol start="2"><li> Aux semences de 293 cellules sur des lamelles, ajouter 5 x 10 4 cellules dans un milieu de croissance 1 ml (DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine) par puits. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2 O / N. </li><li> Infecter les cellules avec MP-12 à une multiplicité d&#39;infection (moi) de 3. Inclure au moins deux<html> puits non infectés: l&#39;un des deux puits serviront de témoins non infectés, l&#39;autre sera traité avec actinomycine D (ACTD) à l&#39;étape 1.5 en tant que témoin pour la répression de la transcription. Retirez le milieu de croissance et de diluer le stock de virus de sorte que le volume total ajouté à chaque puits est de 200 ml. Incuber pendant 1 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> Remarque: Au lieu d&#39;infecter les cellules, les cellules peuvent également être transfectées avec l&#39;ADN plasmidique ou synthétisés in vitro d&#39;ARN codant pour une protéine virale spécifique. Dans ce but, la transfection de cellules avec un réactif de transfection chimique approprié conformément aux instructions du fabricant et passez à l&#39;étape 1.5 à 16 h après la transfection. Il est conseillé d&#39;optimiser les conditions de transfection et le temps d&#39;incubation avant l&#39;ARN étiquetage et la fixation. <ol start="4"><li> Retirer inoculum et ajouter 1 ml de milieu de croissance frais par puits. Incuber à 37 ° C pendant 15 heures. </li></ol>ove_content &quot;&gt;. Remarque: Si l&#39;adaptation de ce protocole pour l&#39;utilisation avec un autre virus, il est conseillé d&#39;effectuer une expérience de stage de temps pour déterminer le moment optimal pour l&#39;ARN étiquetage et la fixation mettre en place cette évolution dans le temps de sorte que les temps d&#39;infection sont décalés et tous échantillons peuvent être étiquetés, fixe, et colorées en même temps. <ol start="5"><li> À 15 h après l&#39;infection (HPI), remplacer le milieu de croissance avec un milieu contenant 1 mM UE. Pour l&#39;un des puits infectés simulacres, ajouter également 5 ug / ml ACTD. Cela servira de contrôle pour la suppression de la transcription, comme ACTD inhibe la synthèse de l&#39;ARN ADN-dépendante. Retour aux cellules de l&#39;incubateur. </li><li> A 16 HPI, éliminer le milieu et laver les lamelles une fois avec 1 ml de PBS (KCl 0,20 g / L, KH 2 PO 4 0,20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / L, pH 7,4) par puits. Fixer les cellules en ajoutant 1 ml de paraformaldéhyde 4% (PFA) par puits et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li></ol>&gt; NOTE: Pour préparer la solution de fixation de 4% PFA, dissoudre 10 g de paraformaldéhyde dans 150 ml H 2 O chauffée à 60 ° C sur un agitateur magnétique chauffant. Ajouter 500 ul de NaOH 1M et continuer à remuer jusqu&#39;à ce que solution devient limpide. Filtrer la solution PFA travers un papier filtre pour éliminer les particules et ajouter un tampon phosphate 62,5 ml (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4). Ajoutez H 2 O jusqu&#39;à un volume total de 250 ml. Congeler à -20 ° C en aliquots à usage unique. <ol start="7"><li> Laver une fois avec 1 ml de PBS par puits. Pas le temps d&#39;incubation est nécessaire pour cela et toutes les étapes de lavage ultérieures. Procéder immédiatement à l&#39;étape 2. </li></ol> Note: Il est important de procéder immédiatement à la réaction de clic, comme l&#39;ARN dégénère si elles sont conservées à ce stade pour des périodes prolongées; une perte du signal de fluorescence ARN peut déjà être observée si les cellules sont conservées pendant 1 h à 4 ° C . De même, si parla formation d&#39;une expérience de stage de temps, n&#39;oubliez pas de l&#39;étiquette, fixer, et aux taches tous les échantillons en même temps. 2. Cliquez réaction pour détecter les ARN marqué <ol><li> Perméabiliser les cellules par addition de 1 ml de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS. Incuber pendant 10 min à température ambiante. </li></ol> Note: Toutes les solutions utilisées dans les étapes 2.1 à 2.3 doivent être nucléase libre. <ol start="2"><li> Laver trois fois avec 1 ml de PBS par puits. </li><li> Retirez les lamelles sur la plaque de 12 puits et le transfert dans la chambre humide. Couvrir chaque lamelle avec 50 - une solution de coloration de clic de 100 ul (Tris 100 mM, pH 8,5, 1 mM de CuSO 4, 20 uM d&#39;azides fluorescente [excitation / émission maximale: 590/617 nm], l&#39;acide ascorbique 100 mM) chacune. Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Note: Pour assembler la chambre humide, tapisser le fond d&#39;une culture cellulaire ou boîte de Pétri avec un 10 cm de diamètre avec un film de paraffine plastique. Ligne à l&#39;intérieur du bord de la dish avec du papier absorbant humide. Placer les lamelles sur la pellicule de paraffine plastique. Remarque: Veillez à ne pas laisser les lamelles se dessèchent pas pendant cette ou toute autre étape dans le protocole. Il est préférable d&#39;ajouter la solution de coloration à chaque lamelle directement après qu&#39;il a été placé dans la chambre humide. Note: Préparer la solution de coloration de clic frais immédiatement avant cette étape. Les solutions mères de Tris 1,5 M pH 8,5, 100 mM de CuSO 4, et de l&#39;acide ascorbique 500 mM peuvent être conservés à 4 ° C. Toutefois, jeter toute solution mère d&#39;acide ascorbique qui a jauni. Remarque: Veillez à sélectionner un fluorophore qui correspond aux filtres sur votre microscope à fluorescence. <ol start="4"><li> Retirez les lamelles de la chambre humide et le placer dans une assiette fraîche de 12 puits et laver trois fois avec 1 ml de PBS par puits. </li></ol> Remarque: Si aucun detection des protéines virales est souhaitée, des lamelles peut être monté et imagée après cette étape (passez à l&#39;étape 3.3). 3. Immunofluorescence pour détecter l&#39;expression de protéines virales <ol><li> Ajouter 1 ml de tampon de blocage (3% (p / v) de sérum albumine bovine (BSA) dans du PBS) à chaque puits et incuber pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirez les lamelles sur la plaque de 12 puits, le transfert dans la chambre humide et couvrir avec 50 - 100 pi d&#39;anticorps primaire (anti-FVR, un cadeau aimable du Dr RB Tesh, UTMB) dilué dans du tampon de blocage (1:500). Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Remarque: Lors de l&#39;adaptation de ce protocole à utiliser avec un autre virus, déterminer la dilution optimale pour votre premier anticorps primaire. Note: Alternativement, cette étape peut être effectuée O / N à 4 ° C dans l&#39;obscurité. <ol start="3"><li> Retirez les lamelles de la chambre humide et remettez-le dans la plaque de 12 puits et lavertrois fois avec 1 ml de PBS par puits. </li><li> Retirez les lamelles de place de 12 puits, lieu dans la chambre humide et couvrir avec 50 - 100 pi d&#39;anticorps secondaire (IgG anti-souris conjugué à un colorant fluorescent [excitation / émission maximale: 495/519 nm]) dilué dans du tampon de blocage (1: 500). Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Remarque: Veillez à sélectionner un anticorps secondaire qui peut reconnaître votre anticorps primaire et correspond aux filtres sur votre microscope à fluorescence. Note: Si vous le souhaitez, à 200 ng / ml DAPI peut être ajouté à la dilution d&#39;anticorps secondaire de visualiser les noyaux. <ol start="5"><li> Retirez les lamelles de la chambre humide et remettez-le dans la plaque de 12 puits et laver trois fois avec 1 ml de PBS par puits. </li><li> Monter les lamelles en plaçant une goutte (ca. 15 pi) de Fluoromount-G sur une lame de microscope. Trempez la lamelle en H 2 O, enlever l&#39;excès de H 2 O en touchant èmecôté de l&#39;e sur une serviette en papier, et le lieu du côté de la cellule vers le bas dans la goutte de Fluoromount-G. Air sec pendant 5 min. </li></ol> Remarque: Si l&#39;imagerie sur un microscope inversé, permettre Fluoromount-G à se solidifier à 4 ° CO / N ou apposer les lamelles à la lame de microscope en scellant le bord avec du vernis à ongles transparent. Note: Les diapositives peuvent être visualisés immédiatement ou conservés à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant une semaine. 4. Acquisition de données <ol><li> L&#39;image en utilisant un microscope à fluorescence. </li></ol> Remarque: Veillez à sélectionner fluorophores appropriés qui peuvent être visualisés à l&#39;aide de votre microscope. Pour référence, voici les fluorophores et des jeux de filtres utilisés pour acquérir des images présentées dans cette publication. DAPI: filtre d&#39;excitation: BP 330-385 Dichromatique miroir: 400 DM Filtre d&#39;émission: LP 420 filtre d&#39;excitation: BP 460-490 Dichromatique miroir: DM 505 Filtre d&#39;émission: LP 510 Fluorophore avec une excitation / émission maximale de 590/617: filtre d&#39;excitation: BP 545-580 Dichromatique miroir: 600 DM Filtre d&#39;émission: LP 610 L&#39;analyse de la transcription par cytométrie de flux 5. Infecter les cellules avec MP-12 et étiquettes ARN naissant avec l&#39;UE <ol><li> Graine de 293 cellules en plaque de culture tissulaire à 6 puits dans un milieu de croissance (DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine). Incuber dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2, jusqu&#39;à ce que les cellules ont atteint 80 - 100% de confluence. </li><li> Infecter les cellules avec MP-12 à une MOI de 3. Inclure au moins deux puits non infectés: l&#39;un des deux puits servira de témoin non infecté, l&#39;autre sera traité avec ACTD à l&#39;étape5.4. Retirez le milieu de croissance et de diluer le stock de virus de sorte que le volume total ajouté à chaque puits est de 400 pi. Incuber pendant 1 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Retirer inoculum et ajouter 2 milieu de croissance frais ml par puits. Incuber à 37 ° C pendant 12 heures. </li></ol> Remarque: Si l&#39;adaptation de ce protocole pour l&#39;utilisation avec un autre virus, il est conseillé d&#39;effectuer une expérience de stage de temps pour déterminer le moment optimal pour l&#39;étiquetage et la récolte. Mettre en place cette évolution dans le temps de sorte que les temps d&#39;infection sont décalés et tous les échantillons peuvent être étiquetés, récolté, et colorées en même temps. <ol start="4"><li> A 12 HPI, remplacer le milieu de croissance avec un milieu contenant 0,5 mM UE. Pour l&#39;un des puits infectés simulacres, ajouter également 5 ug / ml ACTD. Cela servira de contrôle pour la suppression de la transcription, comme ACTD inhibe la synthèse de l&#39;ARN ADN-dépendante. Retour aux cellules de l&#39;incubateur. </li><li> À 13 HPI, laver les cellules une fois l&#39;esprith PBS et la récolte par la trypsine des cellules. Laver les cellules récoltées trois fois avec du PBS contenant 1 mM EDTA (PBS-EDTA). </li></ol> Remarque: Pendant ce sujet et les étapes ultérieures, ne pas centrifuger les cellules plus rapidement que 500 - 1000 xg pour éviter la rupture des cellules. Centrifuger les cellules pendant 1 - 2 min à sédiments. Remarque: Si un immunomarquage de surface est prévu après la réaction clic, la récolte en utilisant une spatule en caoutchouc ou d&#39;un grattoir cellulaire jetable à la place. <ol start="6"><li> Fixer les cellules en les remettant en suspension dans 1 ml de PFA 4% et incuber pendant 30 min à température ambiante. Reportez-vous à l&#39;étape 1.6 pour obtenir des instructions sur la façon de préparer PFA 4%. </li><li> Laver une fois avec 1 ml de PBS-EDTA par puits. Procéder immédiatement à l&#39;étape 6. </li></ol> Note: Il est important de procéder immédiatement à la réaction de clic, comme l&#39;ARN dégénère si elles sont conservées à ce stade pour des périodes de temps prolongées. De même, si vous effectuez un moment cexpérience ourse, n&#39;oubliez pas d&#39;étiqueter, fixer et colorer tous les échantillons en même temps. 6. Cliquez réaction pour détecter les ARN marqué <ol><li> Perméabiliser les cellules en remettant en suspension dans 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS. Incuber pendant 10 min à température ambiante. </li></ol> Note: Toutes les solutions utilisées dans les étapes 6.1 à 6.3 doivent être nucléase libre. Note: Si les cellules ne sont pas correctement les sédiments au cours de cette étape, augmenter le temps de centrifugation de 5 min. comportement de sédimentation va s&#39;améliorer une fois que les cellules sont mises en suspension dans un tampon FACS (étape 6.4). <ol start="2"><li> Laver une fois avec 1 ml de PBS. </li></ol> Note: Ne pas utiliser EDTA dans cette étape car cela chélate le Cu 2 + ions nécessaires à la réaction de clic. <ol start="3"><li> Remettre les cellules dans 200 ul de solution de coloration de clic (Tris 100 mM pH 8,5, 1 mM CuSO 4, 200 nM azoture marqué par un colorant fluorescent [HTitation / émission maximale: 650/665 nm], acide ascorbique de 100 mm). Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Note: Préparer la solution de coloration de clic frais immédiatement avant cette étape. Les solutions mères de Tris 1,5 M pH 8,5, 100 mM de CuSO 4, et de l&#39;acide ascorbique 500 mM peuvent être conservés à 4 ° C. Toutefois, jeter toute solution mère d&#39;acide ascorbique qui a jauni. Note: Si les cellules s&#39;agrègent lors de cette étape, remettre en suspension par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Remarque: Veillez à sélectionner un fluorophore qui peut être détecté par votre cytomètre en flux. Note: préparent également un échantillon des cellules infectées qui ne sont pas soumises à la procédure de coloration de clic; ceux-ci seront nécessaires pour l&#39;étalonnage du cytomètre de flux. Soit utiliser la moitié des cellules infectées ou comportent un supplément de bien infecté à l&#39;étape 5.2. Ces concellules contrôle seront immunocolorées à l&#39;étape 7.1. <ol start="4"><li> Laver deux fois avec du tampon FACS (PBS contenant 1 mM d&#39;EDTA et 0,5% (p / v) BSA). </li></ol> Remarque: Si aucun immunomarquage des protéines virales est souhaitée, les cellules peuvent être analysés immédiatement (passez à l&#39;étape 8). 7. Immunofluorescence pour détecter l&#39;expression de protéines virales <ol><li> Remettre les cellules dans 200 ul d&#39;anticorps primaire (anti-FVR) dilué dans tampon FACS (1:10,000) et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Note: Alternativement, cette étape peut être effectuée O / N à 4 ° C dans l&#39;obscurité. Note: préparent également un échantillon de cellules non infectées qui ont été soumises à la procédure de coloration de clic, mais ne sera pas immunocolorées, ceux-ci seront nécessaires pour l&#39;étalonnage du cytomètre de flux. Soit utiliser la moitié des cellules infectées simulées ou comprennent un puits non infecté supplémentaire àl&#39;étape 5.2. Remarque: Lors de l&#39;adaptation de ce protocole à utiliser avec un autre virus, déterminer la dilution optimale pour votre premier anticorps primaire. <ol start="2"><li> Laver les cellules deux fois dans le tampon FACS. </li><li> Remettre les cellules dans 200 ul d&#39;anticorps secondaire (IgG anti-souris conjugué à un colorant fluorescent [excitation / émission maximale: 495/519 nm]) dilué dans tampon FACS (1:1000) et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules une fois dans un tampon FACS. </li></ol> Remarque: À ce stade, les cellules peuvent être stockées O / N à 4 ° C dans l&#39;obscurité. 8. Acquisition de données <ol><li> Resuspendre les cellules dans 500 pl de tampon FACS, le transfert dans des tubes de 5 ml de polystyrène et d&#39;analyser en utilisant un cytomètre de flux. Utilisez-12 MP cellules infectées (aucune réaction clic, coloration anti-RVFV seulement) et les cellules infectées simulées (cliquez réaction uniquement) pour calibrer l&#39;instrument. </li></ol> None: Veillez à sélectionner fluorophores appropriés qui peuvent être détectés par votre instrument. Pour référence, voici les lignes laser et jeux de filtres utilisés pour acquérir les données présentées dans cette publication. Fluorophore avec un spectre d&#39;excitation / émission de 495/519: Laser: 488 nm Filtre: 530/30 Fluorophore avec un spectre d&#39;excitation / émission de 650/665: Laser: 640 nm Filtre: 670/20

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	<li>Fakan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+support+for+RNA+synthesis+in+the+cell+nucleus.">Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus.</a> Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).</li><li>Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+RNA+synthesis+using+bromouridine+labelling+and+bromodeoxyuridine+antibodies.">Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies.</a> Cytometry. 14, 455-458 (1993).</li><li>Jao, C. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole fourni décrit une méthode pour mesurer l&#39;effet de l&#39;infection virale sur la transcription de la cellule hôte via l&#39;incorporation de l&#39;uridine analogique UE en ARN naissants. Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes précédentes: il est rapide, sensible et il ne repose pas sur l&#39;utilisation des isotopes radioactifs. En outre, le procédé peut être adapté pour fournir des données qualitatives par microscopie à fluorescence ou des données quantitative...

<html> Traditionnellement, l&#39;activité transcriptionnelle a été mesurée par incorporation de deux radioactif (3 H-uridine) ou 1 (BRU) 2 nucléosides halogénés en ARN naissants. Ces analogues d&#39;uridine sont prises par les cellules, convertis en uridine triphosphate (UTP) à travers la voie de récupération nucléosidique, et par la suite incorporés dans l&#39;ARN nouvellement synthétisé. 3H-uridine peuvent être détectés par autoradiographie, ce qui peut prendre beaucoup de temps, ou scintillation comptage, qui nécessite un équipement spécialisé. En outre, l&#39;utilisation d&#39;isotopes radioactifs ne peut être pratique dans un certain nombre de paramètres de laboratoire, y compris les laboratoires de biosécurité Haut de confinement. BrU peut être détectée par immunomarquage avec des anticorps anti-Bru, qui peuvent nécessiter perméabilisation dur pour assurer l&#39;accès de l&#39;anticorps dans le noyau ou la dénaturation partielle de l&#39;ARN, que la structure secondaire de l&#39;ARN pourrait être un encombrement stérique de la liaison d&#39;anticorps. _content &quot;&gt; Le protocole décrit ici utilise le récemment développé click chemistry 3 pour mesurer l&#39;activité transcriptionnelle dans les cellules infectées par la souche RVFV MP-12. click chemistry s&#39;appuie sur un cuivre très sélective et efficace (I) catalysée par réaction de cycloaddition entre un alcyne et un groupement azoture de 4,5. Dans ce protocole, ARN naissant dans les cellules infectées est d&#39;abord marqué par l&#39;incorporation de l&#39;uridine analogique de l&#39;UE. Dans un deuxième temps, le incorporée UE est détectée par réaction avec un azoture fluorescent. Les principaux avantages de cette méthode sont (1) qu&#39;il ne nécessite pas l&#39;utilisation d&#39;isotopes radioactifs et (2) qu&#39;il ne nécessite pas de perméabilisation sévère ou dénaturation de l&#39;ARN. avec un poids moléculaire de moins de 50 Da, l&#39;accès de l&#39;azoture fluorescent n&#39;est pas entravée par l&#39;insuffisance structure secondaire perméabilisation ou d&#39;ARN. Par ailleurs, les chercheurs ne sont pas limités dans leur choix d&#39;anticorps primaires en combinant la détection de l&#39;ARN avec une classeimmunocoloration iCal pour les protéines virales. Deux méthodes différentes sont décrites dans ce protocole: l&#39;un pour la visualisation de la transcription par microscopie à fluorescence (étapes 1-4), et l&#39;autre pour quantifier la transcription par cytométrie de flux (étapes 5-8). Ces deux méthodes combinent l&#39;étiquetage des ARN naissant avec un immunomarquage intracellulaire des protéines virales, ce qui permet d&#39;établir une corrélation entre l&#39;activité transcriptionnelle et l&#39;infection virale sur une base par cellule à cellule. Les auteurs ont utilisé avec succès le protocole décrit ici de déterminer l&#39;activité de transcription dans les cellules infectées par la souche RVFV MP-12 6 cellules infectées par différents-12 MP mutants 7,8, 9, et les cellules infectées par le virus Toscana (TOSV) 10. Le protocole décrit ici peut être facilement adapté pour une utilisation avec différents virus et a le potentiel d&#39;être modifié pour inclure immunofluorescence des protéines virales ou cellulaires spécifiques.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-uridine</td>
			<td>Berry &amp; Associates</td>
			<td>PY 7563</td>
			<td>dissolve in DMSO for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-mm round coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D (ActD)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9415</td>
			<td>dissolve in DMSO for 10 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2323</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8027</td>
			<td>dissolve in H2O for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-9542</td>
			<td>dissolve in H2O for 5 mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10270</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10277</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5960</td>
			<td>dissolve in H2O for 500 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper filter</td>
			<td>VWRbrand</td>
			<td>28333-087</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine (MW &ge; 70000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1274</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. Olympus IX71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using click chemistry to measure the effect of viral infection on host-cell rna synthesis

De nombreux virus à ARN ont développé la capacité à inhiber la transcription de la cellule hôte comme un moyen de contourner les défenses cellulaires. Pour l&#39;étude de ces virus, il est donc important de disposer d&#39;un moyen rapide et fiable de mesure de l&#39;activité transcriptionnelle dans les cellules infectées. Traditionnellement, la transcription a été mesurée soit par incorporation de nucléosides radioactifs tels que 3H-uridine suivie d&#39;une détection par autoradiographie ou comptage à scintillation, ou l&#39;incorporation d&#39;uridine halogénés analogues tels que le 5-bromouridine (BRU) suivie d&#39;une détection par coloration immunologique. L&#39;utilisation d&#39;isotopes radioactifs, cependant, nécessite un équipement spécialisé et n&#39;est pas réalisable dans un certain nombre de paramètres de laboratoire, tandis que la détection de BrU peut être lourde et peut souffrir d&#39;une faible sensibilité. La chimie de clic récemment mis au point, ce qui implique une formation de triazole cuivre catalysée par un azoture et un alcyne, offre maintenant une rapide et highly alternatif sensibles à ces deux méthodes. Cliquez chimie est un processus en deux étapes dans lequel ARN naissant est d&#39;abord marquées par incorporation de l&#39;uridine analogique 5 éthynyluridine (UE), suivie par la détection de l&#39;étiquette avec un azoture fluorescent. Ces azides sont disponibles en plusieurs fluorophores différents, ce qui permet un large éventail d&#39;options pour la visualisation. Ce protocole décrit une méthode permettant de mesurer la répression de la transcription dans les cellules infectées par le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (FVR) souche MP-12 à l&#39;aide click chemistry. Parallèlement, l&#39;expression de protéines virales dans ces cellules est déterminé par immunomarquage intracellulaire classique. Les étapes 1 à 4 en détail une méthode pour visualiser la répression de la transcription par microscopie à fluorescence, tandis que les étapes 5 à 8 détaillent une méthode pour quantifier la répression de la transcription par cytométrie de flux. Ce protocole est facilement adaptable pour une utilisation avec d&#39;autres virus.

La protéine NS du RVFV (famille des Bunyaviridae, genre Phlebovirus) 11 inhibe la cellule hôte transcription général à travers deux mécanismes distincts: (i) en séquestrant la sous-unité p44 du facteur de transcription basal TFIIH 11 et (ii) en favorisant la dégradation par le protéasome de la p62 sous-unité de TFIIH 6. La souche vaccinale RVFV MP-12 13 a été utilisé pour les expériences décrites dans ce protocole depuis souche MP-12 peut êtr...

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Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Cette méthode décrit l&#39;utilisation de la chimie clic pour mesurer les changements dans la transcription de la cellule hôte après infection par le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (FVR) souche MP-12. Les résultats peuvent être visualisés qualitativement par microscopie à fluorescence ou obtenus quantitativement par cytométrie de flux. Cette méthode est adaptable pour une utilisation avec d&#39;autres virus.

Utilisation de Click Chemistry pour mesurer l&#39;effet de l&#39;infection virale sur Host-Cell Synthèse des ARN

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

using-click-chemistry-to-measure-effect-viral-infection-on-host-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K vues.  University of Texas Medical Branch. Cette méthode décrit l'utilisation de la chimie clic pour mesurer les changements dans la transcription de la cellule hôte après infection par le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (FVR) souche MP-12. Les résultats peuvent être visualisés qualitativement par microscopie à fluorescence ou obtenus quantitativement par cytométrie de flux. Cette méthode est adaptable pour une utilisation avec d'autres virus.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolement des variantes des virus à ARN de Fidelity et caractérisation de la fréquence de mutation de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

Séparation de l&#39;ADN simple brin, double brin de l&#39;ADN et l&#39;ARN à partir d&#39;un environnement communautaire viral en utilisant chromatographie d&#39;hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Modification des surfaces chimiosélective virales via Click Chemistry Bioorthogonal

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recently there were several publications on the bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of the spectrum (400 nm-500 nm) is responsible for killing various pathogens1-5. The phototoxic effect of blue light was suggested to be a result of light-induced reactive oxygen species (ROS) formation by endogenous bacterial photosensitizers which mostly absorb light in the blue region4,6,7. There are also reports of biocidal effect of red and near infra red8 as well as green light9.
In the present study, we developed a method that allowed us to characterize the effect of high power green (wavelength of 532 nm) continuous (CW) and pulsed Q-switched (Q-S) light on Pseudomonas aeruginosa. Using this method we also studied the effect of green light combined with antibiotic treatment (gentamycin) on the bacteria viability. P. aeruginosa is a common noscomial opportunistic pathogen causing various diseases. The strain is fairly resistant to various antibiotics and contains many predicted AcrB/Mex-type RND multidrug efflux systems10.
The method utilized free-living stationary phase Gram-negative bacteria (P. aeruginosa strain PAO1), grown in Luria Broth (LB) medium exposed to Q-switched and/or CW lasers with and without the addition of the antibiotic gentamycin. Cell viability was determined at different time points. The obtained results showed that laser treatment alone did not reduce cell viability compared to untreated control and that gentamycin treatment alone only resulted in a 0.5 log reduction in the viable count for P. aeruginosa. The combined laser and gentamycin treatment, however, resulted in a synergistic effect and the viability of P. aeruginosa was reduced by 8 log's.
The proposed method can further be implemented via the development of catheter like device capable of injecting an antibiotic solution into the infected organ while simultaneously illuminating the area with light.

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

We show that a developed biomedical device involving continuous or pulsed visible laser based treatment that is combined with antibiotic treatment (gentamycin), results in a statistically significant synergistic effect leading to a reduction in the viability of P. aeruginosa PAO1, by 8 log's compared to antibiotic treatment alone.

L&#39;effet synergique de la lumière visible et sur Gentamycin<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Microorganismes

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

L&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Utilisation de l&#39;Essai de superposition pour mesurer qualitativement la production bactérienne et la sensibilité à pneumocoque bactériocines

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucléocapside recuit-Mediated électrophorèse (NOM) Assay permet l&#39;identification rapide des VIH-1 inhibiteurs Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Méthode d&#39;échantillonnage pour la détection des norovirus humains sur les surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...