This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unit&#224; per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

<ol>
	<li>Druillennec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mimic+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+impairs+reverse+transcription+and+displays+antiviral+activity.">A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).</li><li>Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+functions,+and+drug+targeting+of+the+multifunctional+nucleocapsid+protein+of+the+human+immunodeficiency+virus.">Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus.</a> Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).</li><li>Thomas, J. A., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+protein+function+in+early+infection+processes.">Nucleocapsid protein function in early infection processes.</a> Virus Res. 134, 39-63 (2008).</li><li>Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features,+processing+states,+and+heterologous+protein+interactions+in+the+modulation+of+the+retroviral+nucleocapsid+protein+function.">Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function.</a> RNA Biol. 7, 724-734 (2010).</li><li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nucleation,+reverse+annealing,+and+chaperone+function+along+the+reaction+path+of+HIV-1+single-strand+transfer.">Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).</li><li>Basu, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand+transfer+events+during+HIV-1+reverse+transcription.">Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription.</a> Virus Res. 134, 19-38 (2008).</li><li>Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+nucleocapsid+protein+promotes+efficient+strand+transfer+and+specific+viral+DNA+synthesis+by+inhibiting+TAR-dependent+self-priming+from+minus-strand+strong-stop+DNA.">Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA.</a> J Virol. 71, 5178-5188 (1997).</li><li>Godet, J., Mely, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+studies+of+the+nucleic+acid+chaperone+properties+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> RNA Biol. 7, 687-699 (2010).</li><li>Darlix, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+nature+and+specific+functions+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).</li><li>Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+nucleic+acid+annealing+activities+of+nucleocapsid+protein+from+HIV-1.">Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1.</a> Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).</li><li>Vo, M. -. N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+mini-TAR+RNA/DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).</li><li>Beltz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+for+cTAR+DNA+binding+and+destabilization,+and+correlation+with+inhibition+of+self-primed+DNA+synthesis.">Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis.</a> J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).</li><li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+Protein:+a+Desirable+Target+for+Future+Therapies+against+HIV-1.">Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1.</a> Curr Top Microbiol Immunol. , .</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis+and+biological+evaluation+of+TAR+and+cTAR+binders+as+HIV-1+nucleocapsid+inhibitors.">Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors.</a> MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).</li><li>Tabarrini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Anti-HIV+Transcription+Inhibitor+Quinolones:+Identification+of+Potent+N1-Vinyl+Derivatives.">Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives.</a> Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).</li><li>Hagan, N., Fabris, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mass+spectrometric+determination+of+the+stoichiometry+and+binding+affinity+of+the+complexes+between+nucleocapsid+protein+and+RNA+stem-loop+hairpins+of+the+HIV-1+Psi-recognition+element.">Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element.</a> Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).</li><li>Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+RNA+chaperone+proteins:+from+functions+to+disease.">Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease.</a> Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).</li><li>Zagotto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+G-quadruplex+vs+double-stranded+DNA+recognition+in+regioisomeric+lysyl-peptidyl-anthraquinone+conjugates.">Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates.</a> Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).</li><li>Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferred+RNA+binding+sites+for+a+threading+intercalator+revealed+by+in+vitro+evolution.">Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution.</a> Chem Biol. 10, 663-672 (2003).</li><li>Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+duplex+RNA+by+helix-threading+peptides.">Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides.</a> J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).</li><li>Kanevsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+TAR+RNA-DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

NAME est un test qui permet d&#39;évaluer rapidement l&#39;inhibition de l&#39;activité de chaperon de la protéine de nucléocapside du VIH-1, une cible intéressante pour la recherche de nouveaux médicaments anti-VIH. NC annèle rapide et à des acides nucléiques de température ambiante dont pliage stable exigerait autrement dénaturation thermique à haute température suivi d&#39;un recuit prudent. Le dosage peut être effectué soit avec pleine longueur NC ou avec le tronquée (12-55) NC: dans les deux cas, les deux acides nucléiques (ARN et sa copie d&#39;ADN complémentaire) sont recuits rapidement. Ceci est cohérent avec l&#39;observation de la littérature avec le tronc NC peptide: recuit est initiée par la fusion efficace de la tige de cTAR suivie par interaction de la boucle apicale complémentaire, qui est un faible site de liaison de NF, avec la séquence complémentaire de TAR boucle apicale, de se retrouver à travers plusieurs intermédiaires instables à l&#39;hybride recuit étendu. 21 NC est une prot très stableein et quelques problèmes lors de NOM performant peuvent se produire. Il est très important cependant pour ajouter SDS fraîchement préparés dans le Gel Loading Buffer utilisé pour arrêter la réaction: si cela ne est pas atteint, le gel ne sera pas montrer les bandes d&#39;acides nucléiques dans les positions correctes. En fait, NC est une protéine de liaison d&#39;acide nucléique, de sorte que de visualiser correctement TAR / cTAR heteroduplex par électrophorèse sur gel de SDS doit être présent dans le tampon de chargement de gel pour dénaturer la protéine et le libérer de son complexe étanche avec les acides nucléiques. Ce est aussi un possible dépannage de l&#39;expérience, ce est à dire la formation de bandes décalées pendant la course au gel. Cet effet est particulièrement évident lorsque la pleine longueur NC a été utilisé, comme dans la figure 2, et est liée à la présence de la queue N-terminale fortement basique, ayant un effet d&#39;agrégation solide sur les acides nucléiques. La présence de la queue de base terminal effectue la réaction de recuit plus difficile d&#39;être inhibé, comme le montrentn à la figure 3 en utilisant le composé 1, un filetage intercalant représentant, soit une intercalant particulièrement efficace à stabiliser les structures tige-boucle de goudron et de cTAR. En fait, ce type d&#39;interaction avec des acides nucléiques est favorisée lorsque des renflements et des boucles interrompent la continuité de la double hélice, ce qui permet un enfilage plus facile de les substituants volumineux dans les paires de bases. Stabilisation de TAR et cTAR par ces liants d&#39;acides nucléiques a été préalablement analysé par la détermination de l&#39;augmentation de la température de fusion des deux oligonucleotides. 14 En outre, l&#39;augmentation de la température de fusion est en corrélation avec l&#39;inhibition de l&#39;hybridation catalysée par le VIH-1 NC, conduisant à la formation réduite de la TAR hétéroduplex / cTAR et indiquant que intercalants filetage constituent une classe intéressante de liants pour des structures dynamiques de l&#39;ARN tel que l&#39;élément TAR. 14 Le mécanisme d&#39;action invoquée pour ces compounds peut encore être validé en effectuant le test in NOM différents formats de rechange, comme représenté sur la figure 4: dans le cas des agents intercalants de l&#39;inhibition de recuit heteroduplex est améliorée lorsque le médicament est incubé avec les deux oligos pliées. Composés agissant avec mécanisme d&#39;action différent, comme liants directs de la protéine NC, seraient moins touchés par les différents mode de pré-incubation. NOM test effectué dans les deux méthodes peuvent donc être utilisés pour cribler des bibliothèques de composés pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs NC, et aussi pour évaluer le mécanisme d&#39;action présumé des réponses positives lors de la recherche pour les médicaments anti-VIH ciblées au NC. De toute évidence, l&#39;utilisation de ces seules techniques lors réclamé un mécanisme spécifique d&#39;action des inhibiteurs identifiés NC ne est pas suffisant, et d&#39;autres tests biochimiques appropriés sont nécessaires pour soutenir l&#39;hypothèse de travail. 14 Enfin, il faut souligner que NOM utilise trèsenzymes purifiées, soit recombinaison ou de synthèse, ce qui donne des informations précieuses sur l&#39;inhibition &quot;in vitro&quot; de NC par les composés testés. Ce est la &quot;force et la faiblesse&quot; de l&#39;essai: NOM peut ainsi compléter criblage virtuel et modélisation moléculaire approches dans les étapes préliminaires de programmes de découverte de médicaments, permettant de construire et d&#39;analyser rapidement les relations structure-activité et éventuellement réorienter la conception de synthèse et de drogues. Cependant, comme d&#39;autres dosages biochimiques utilisés dans des projets de développement de médicaments dans le VIH, NOM ne donnera pas d&#39;informations sur les effets des inhibiteurs putatifs dans les cellules infectées par le virus.

La protéine de nucléocapside NCp7 (NC) de l&#39;immunodéficience humaine virus de type 1 (VIH-1) est une petite protéine basique qui est étroitement associé à l&#39;ARN génomique du virus infectieux mature, jouant un rôle essentiel dans la réplication du virus en tant que cofacteur pendant la transcription inverse , la reconnaissance du génome, et l&#39;emballage. 1-3 NC agit comme un chaperon d&#39;acide nucléique catalyser la déstabilisation des structures stables d&#39;acide nucléique et l&#39;hybridation de séquences complémentaires. Son activité acide nucléique agrégation réside principalement dans les 11 acides aminés N-terminal alors que l&#39;activité déstabiliser duplex a été cartographiée à ses structures de doigt de zinc (12 à 55 peptidiques). 4 La protéine chargée positivement abaisse la barrière électrostatique de la réaction d&#39;hybridation et augmente la vitesse à laquelle les deux séquences complémentaires distincts se rejoignent. Les acides nucléiques pliées de conformation stable exigent les activités chaperonnes de NC à facilitate leur recuit 5 Cela est particulièrement important dans la transcription inverse, où NC est critique dans des événements de transfert de brins:. dans le transfert brin moins, l&#39;ADN d&#39;arrêt brin moins, tout rétrotranscrit, doit être transférée et hybridée à une séquence complémentaire de la région R à l&#39;extrémité 3 &#39;du génome de l&#39;ARN matrice. 6 Bien que thermodynamiquement favorisée, cette réaction ne se produit pas largement en l&#39;absence de NC en raison de la présence de la structure stable de l&#39;activation trans région sensible (TAR) ARN dans les régions de recherche, qui doit être associé à sa copie d&#39;ADN (cTAR ADN). Les sept régions cTAR et TAR sont, en fait, très structuré avec une tige-boucle conformation caractéristique. NC protéine se dénature ces épingles à cheveux, et favorise le transfert de brin négatif en augmentant le taux de recuit intermoléculaire entre les brins d&#39;acide nucléique complémentaires. Le mécanisme de NC recuit de goudron et cTAR a été soigneusement étudié et dedécrite comme test TAR de recuit dans plusieurs documents de recherche et le schéma proposé est représenté dans d&#39;excellentes critiques. 8-11 Résumer, NC déstabilise la structure secondaire de l&#39;ARN stable comme TAR-ARN, déstabilise la structure secondaire de sa séquence complémentaire, cTAR-DNA et favorise la réaction d&#39;annelage de l&#39;ARN / ADN conduisant à TAR / cTAR formation d&#39;hétéroduplex. 10,11 Par conséquent, l&#39;étape de transfert de brin pendant la replication du VIH est favorisée. 12 NC est une cible intéressante pour le développement de nouveaux agents antiviraux puisque les risques d&#39;interférence induite par de petites molécules en vue NC entraînerait une diminution de la transcription inverse du génome viral à la suite d&#39;une activité NC compromise. 2,13 Cette approche pourrait finalement conduire au développement d&#39;agents anti-VIH réussies. Dans le cadre d&#39;un dépistage de la NC inhibiteurs 14 nous avons développé un test en se appuyant sur ​​les propriétés bien connuesde nucléocapside de déstabiliser efficacement et recuit oligonucléotides complémentaires 10,11. Nous l&#39;avons appelé N ucleocapsid Un nnealing- M ediated E lectrophoresis (NOM) dosage. NOM essai utilise NC pour arbitrer le recuit entre les copies de manière stable structurés d&#39;acides nucléiques complémentaires, dans notre cas de l&#39;oligonucléotide correspondant à la partie apicale d&#39;une séquence TAR-ARN avec sa séquence d&#39;ADN complémentaire (cTAR) pour donner le hybride TAR / cTAR heteroduplex . L&#39;analyse de la TAR / cTAR réaction de recuit en présence de NC peut être étudiée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (PAGE). Ce protocole montre comment effectuer le dosage NOM à recuire rapidement à des oligonucleotides à la température ambiante dans des structures pliées en épingle à cheveux stable, la manière d&#39;analyser les résultats de la réaction et éventuellement de dépannage de l&#39;expérience. Le marquage radioactif de l&#39;acide nucléique ne est pas demandée, et detectisur des bandes d&#39;oligonucléotides peut être réalisée par des procédés classiques de coloration. L&#39;essai, qui emploie soit la protéine pleine longueur recombinant ou une version synthétique tronqué de NC, permet l&#39;identification des agents intercalants d&#39;enfilage NC inhibant une activité corrélée à une forte liaison à l&#39;ARN et de l&#39;ADN 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="631">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:192px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:155px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified.</td>
			<td style="width:140px;">Metabion International AG</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock&#160; solution at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Metabion International AG</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock aliquot at -80 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">(12-55)NC peptide</td>
			<td style="width:140px;">EspiKem srl</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">0030 120 086</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">0.5 mL tubes</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">0030 121 023</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 0.1-10 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">701,130,210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 2-20 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">70,760,213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 200 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">70,760,213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Syringe Filter 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">Biosigma srl</td>
			<td style="width:145px;">51,798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Ethanol</td>
			<td style="width:140px;">Carlo Erba</td>
			<td style="width:145px;">414631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">71725-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">D8418-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">71376-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">B0252-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Magnesium Perchlorate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">222283-100G</td>
			<td style="width:155px;">Store the 1M solution at&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Glycerol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">49770-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:145px;">17-1329-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:192px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">T9281-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:192px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A7460-500G</td>
			<td style="width:155px;">Prepare the 10% solution freshly before use</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:192px;">Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1)</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:145px;">1006401000</td>
			<td style="width:155px;">Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Tris ultrapure</td>
			<td style="width:140px;">Applichem</td>
			<td style="width:145px;">A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">DEPC-treated water</td>
			<td style="width:140px;">Ambion</td>
			<td style="width:145px;">AM9922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">22,621,408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">NanoDrop 1000 spectrometer</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">UV-VIS spectrometer Lambda 20</td>
			<td style="width:140px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Protean II xi Cell</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:145px;">165-1803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:145px;">164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:192px;">SybrGreen II RNA Gel Staining</td>
			<td style="width:140px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">50523</td>
			<td style="width:155px;">Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4&#176;C for two weeks&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Geliance 600 Imaging System</td>
			<td style="width:140px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleocapsid annealing-mediated electrophoresis (name) assay allows the rapid identification of hiv-1 nucleocapsid inhibitors

ARN ou ADN plié en pliage tridimensionnel stable sont des cibles intéressantes dans le développement de médicaments antiviraux ou anti-tumorale. Dans le cas du VIH-1, les protéines virales impliquées dans la régulation de l&#39;activité du virus reconnaissent plusieurs acides nucléiques. La protéine de nucléocapside NCp7 (NC) est une protéine de régulation clé plusieurs procédés au cours de la réplication du virus. NC est en fait un chaperon déstabilisant les structures secondaires de l&#39;ARN et de l&#39;ADN et facilitant leur recuit. L&#39;inactivation du NC est une nouvelle approche et une cible intéressante pour la thérapie anti-VIH. Le N ucleocapsid Un nnealing- M ediated E lectrophoresis (NOM) test a été développé pour identifier des molécules capables d&#39;inhiber la fusion et le recuit de l&#39;ARN et de l&#39;ADN plié en conformations tridimensionnelles thermodynamiquement stables, comme les structures en épingle à cheveux de goudron et éléments cTAR du VIH, par la protéine de nucléocapside du VIH-1. Le nouveau test emploie soit la rérecombinant ou la synthèse des protéines, des oligonucléotides et sans la nécessité de leur marquage précédente. L&#39;analyse des résultats est réalisée par électrophorèse sur gel de Polyacrylamide standard (PAGE) suivie d&#39;une coloration d&#39;acide nucléique conventionnel. Le protocole rapporté dans cet ouvrage explique comment effectuer le NOM test avec la protéine pleine longueur ou sa version tronquée dépourvue du domaine N-terminal de base, à la fois compétente comme les acides nucléiques chaperons, et comment évaluer l&#39;inhibition de l&#39;activité de chaperon NC par un filetage intercalant. En outre, le nom peut être effectué dans deux modes différents, utile pour obtenir des indications sur le mécanisme d&#39;action présumé des inhibiteurs NC identifiés.

La figure 1 montre un résultat représentatif de l&#39;essai Nucleocapsid recuit Mediated électrophorèse (NOM), effectué i) avec la protéine recombinante pleine longueur, ii) sans la protéine, ce est à dire le mélange cTAR + TAR et l&#39;incubation jusqu&#39;à 1 heure à température ambiante, et iii ) le même essai réalisé avec (12-55) NC, un peptide synthétique ne ayant pas les 11 acides aminés du domaine N-terminal. Le TRE pré-pliée et cTAR ont été mélangés et la formation d&#39;heteroduplex recuit du TRE / cTAR a été contrôlée en présence de la pleine longueur recombinant NC (voies gauche de la figure 1), en l&#39;absence de protéine (pistes au centre de la figure 1 ), et en présence des (12-55) NC (peptides tronqués voies de droite sur la figure 1). Les contrôles sont: croisés cTAR, TAR pliées et recuites hybride (TAR / cTAR), obtenu par dénaturation thermique des structures de manière stable pliées de TAR à cTAR suivie par leur annealin lenteg. 14 La capacité de NC pour dénaturer deux séquences d&#39;acide nucléique stables dans l&#39;hélice heteroduplex étendue est clairement évidente: la pleine longueur de protéine NC conduit immédiatement à la formation de la TAR / cTAR hybride: 0 »indique le temps minimal passant entre l&#39;addition de NC pour les échantillons et addition de tampon de chargement de gel, ce qui stoppe la réaction; formation complète est déjà atteint après 15 &#39;temps d&#39;incubation. L&#39;augmentation de l&#39;intensité de l&#39;hétéroduplex recuit est parallèle à la diminution de l&#39;intensité des oligonucléotides cTAR TAR et pliées. La formation d&#39;heteroduplex est obtenu également en présence de la forme tronquée, ce est à dire le (12-55) NC, confirmant l&#39;activité biologique du peptide synthétique. En l&#39;absence de la protéine ou du peptide de la formation d&#39;heteroduplex est pas respecté, et le goudron et les oligonucleotides cTAR ne se anneler à la température ambiante dans l&#39;hétéroduplex (figure 1). Entoutes les expériences, la formation rapide des intermédiaires instables (les «complexes intermédiaires» à la figure 1) qui diminuent au fil du temps est observée, en conformité avec le mécanisme proposé d&#39;échange de brin à travers les épingles de cTAR et TAR jusqu&#39;à ce que les acides nucléiques repliement correct. 17 Un dépannage possible de l&#39;expérience est le manque de SDS dans le tampon de chargement de gel. En l&#39;absence de SDS dans le GLB le résultat de la réaction est représenté sur la figure 2 et par rapport à l&#39;issue de GLB + SDS. Le TAR pré-plié et cTAR étaient mélangés et incubés pendant 3 heures à température ambiante d&#39;pendant 3 heures à 37 ° C avec le pleine longueur protéine NC recombinant. Après incubation, les échantillons ont été divisés en deux: d&#39;une moitié du tampon de charge de gel sans SDS (GLB) a été ajoutée, tandis que l&#39;autre moitié était GLB avec SDS (SDS GLB). Les échantillons ont été chargés sur le gel, et la position des bandes d&#39;acides nucléiques a été visualisée après que le gel de fonctionner parcolorant coloration. Lorsque NC était présent mais les échantillons ont été chargé avec GLB, toutes les bandes des acides nucléiques ont été décalées vers le haut: ce est prévu et indique une forte liaison entre la protéine et les acides nucléiques. Les résultats avec GLB SDS sont présentés dans l&#39;extrême droite du gel: l&#39;addition de SDS dénature les protéines et libère les acides nucléiques du complexe stable avec la protéine, ce qui permet la comparaison avec les contrôles. Le dosage de nom est utilisé pour évaluer la capacité de filetage intercalateurs pour stabiliser des structures dynamiques d&#39;acide nucléique et d&#39;inhiber NC activité chaperon. 14 intercalateurs Threading sont des molécules aromatiques planaires substitués par des chaînes latérales volumineuses situées sur les sites opposés du système de cycle, comme l&#39;anthraquinone représentés sur la figure 3A. 18 Ces agents intercalants sont en mesure de fil à travers la double hélice des acides nucléiques, localiser finalement leurs chaînes latérales dans chaque sillon de la doublehélice. 19,20 La figure 3B montre les résultats de l&#39;essai NOM en présence du composé 1, un agent intercalant de filetage connu, 18 en présence de pleine longueur NC ou du peptide tronqué. Dans les deux cas, la formation de l&#39;hybride TAR / cTAR par NC est réduite en augmentant la concentration de l&#39;agent intercalant, tandis que, en même temps, la quantité de goudron libre et augmente cTAR. La forme tronquée de la protéine dépourvue de la queue N-terminale (12-55NC) est plus sensible à l&#39;inhibition de son activité: cette différence a été vérifiée avec les composés testés à ce jour. Le dosage de nom peut être réalisé de deux manières, soit par pré-incubation du composé d&#39;essai avec NC, puis on ajoute les oligonucleotides pliées (mode NC-préincubation), ou en pré-incubant le composé d&#39;essai pendant 15 min avec les substrats d&#39;acides nucléiques pliées , suivi par l&#39;addition de NC et une nouvelle incubation pendant 15 min (oligo-prmode eincubation). Bien que le temps total d&#39;incubation est le même dans les deux modes, la préincubation avec les oligonucléotides pliées avant l&#39;addition du NC permet plus de temps pour l&#39;enfilage des intercalants dans l&#39;acide nucléique repliée. Il en résulte une stabilisation plus forte de leurs structures dynamiques et plus facile en une inhibition des activités chaperonnes CN. L&#39;analyse de l&#39;essai de NOM dans les deux modes améliore donc les différences dans le mécanisme d&#39;action des inhibiteurs de NF, comme représenté sur la figure 4: lorsque le composé 1 a été analysée par leur nom dans le mode d&#39;oligo-préincubation (figure 4, voies à gauche) il montre une inhibition puissante de recuit NC-médiée, alors que l&#39;inhibition observée est beaucoup plus faible dans le mode NC-préincubation (figure 4, voies à droite). Se il vous plaît noter que pour la détermination des concentrations inhibitrices Pendant le filtrage séries de composés apparentés avec ce dosage et dans ces conditions, chacun EXPERIment doit être effectuée au moins en triple, avec des concentrations très rapprochées (en particulier autour de la valeur IC 50). 14 <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> Figure 1:. NOM dosage avec pleine longueur et avec le NC (12-55) NC TAR Plié et cTAR, chaque 1 uM tronqué, ont été incubées avec recombinant NC ou avec (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) de 0 min, 15 min, 30 min et 1 h. TAR cTAR et incubées en l&#39;absence de protéine (0 min, 15 min, 30 min et 1 h) ont été utilisés comme témoin négatif. TAR plié, plié cTAR hybride et le TRE / cTAR obtenus après dénaturation thermique suivie d&#39;un recuit in vitro ont été utilisés comme témoins. Les réactions ont ensuite cessé d&#39;utiliser GLB SDS. Les échantillons ont été séparés sur un gel de Polyacrylamide à 12% dans 1 x TBE; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur. <html><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> Figure 2:. Effet de SDS dans le tampon de chargement de gel (GLB) lors de l&#39;analyse TAR / cTAR recuit par NC TAR et cTAR, préplié dans TNMg 1x, ont été incubées avec pleine longueur recombinantes NC (oligos / NC = 1/8) pour 3 h à la température ambiante ou à 37 ° C. GLB GLB ou SDS ont ensuite été ajoutés aux échantillons incubés avec NC. Contrôles: TAR, cTAR et TAR hybride recuit / cTAR (chacun 1 uM). L&#39;électrophorèse a été effectuée en utilisant un gel de Polyacrylamide à 12% dans du TBE 1x; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur. Ce chiffre a été modifié depuis Figure S4:. Sosic, A. et al Conception, synthèse et l&#39;évaluation biologique de goudron et de liants cTAR que le VIH-1 inhibiteurs de la nucléocapside MedChemComm 4, 1388-1393, doi:. 10.1039 / c3md00212h (2013) . &quot;&gt; <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> Figure 3: (A) la structure chimique du filetage intercalant 1. (B) Effet de filetage intercalant une évalués par NOM dosage. Plié TAR et cTAR, chaque 1 uM, ont été incubées en présence de concentrations indiquées du composé avec une pleine longueur NC ou avec le (12-55) NC, chaque 8 uM. TAR plié, plié cTAR et de la TAR hétéroduplex étendue / cTAR ont été utilisés comme témoins. Les réactions ont ensuite cessé d&#39;utiliser GLB SDS. Les échantillons ont été séparés sur un gel de Polyacrylamide à 12% dans 1 x TBE; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> Figure 4: Oligo-préincubation par rapport modes NC-préincubation: effets sur NOM dosage Oligo-préincubation mod.e: TAR pliée et repliée cTAR, chaque 1 uM, ont été pré-incubées avec les concentrations indiquées du filetage intercalant une pendant 15 minutes, puis pendant encore 15 min en présence de la pleine longueur NC (8 uM) NC-de préincubation. Mode: les concentrations indiquées du filetage intercalant 1 ont été pré-incubé avec la pleine longueur NC (8 uM) pendant 15 min, puis pendant encore 15 min en présence de TAR plié et replié cTAR, chaque 1 uM. TAR plié, plié cTAR et de la TAR hétéroduplex étendue / cTAR ont été utilisés comme témoins. Toutes les réactions ont finalement cessé d&#39;utiliser GLB SDS. Les échantillons ont été séparés sur un gel de Polyacrylamide à 12% dans 1 x TBE; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur.

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Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucléocapside recuit-Mediated électrophorèse (NOM) Assay permet l&#39;identification rapide des VIH-1 inhibiteurs Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

nucleocapsid-annealing-mediated-electrophoresis-name-assay-allows

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

8.8K vues.  University of Padova. This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Vidéo: Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

Marquage spécifique du VIH-1 des cellules positives à l&#39;aide d&#39;un vecteur Rev-dépendante lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Recherche

Immunologie et infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Prédiction du VIH-1 Utilisation corécepteur (tropisme) par analyse de séquence en utilisant une approche génotypique

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

En décapsidation in vitro du VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

De nouveaux outils pour multiplier des cellules T régulatrices de personnes VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines d&#39;enveloppe l&#39;aide d&#39;un base de cellules test ELISA

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolement des exosomes dans le plasma du VIH-1 individus positifs

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Mesure de<em&gt; In vitro</em&gt; Activité d&#39;intégration du VIH-1 préintégration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...