Ce travail a été soutenu par un financement de la recherche médicale et sanitaire subvention de la Ville de Paris, les Français nationaux ANR-09-JCJC-0118-1, et l&#39;ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax Projet aucune. 242719.

<ol>
	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. 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K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. 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R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

Choix de la lignée cellulaire. L&#39;efficacité des analogues de base que l&#39;ARN mutagènes en corrélation avec leur absorption relative par différents types de cellules 11. Si la lignée cellulaire qui est normalement utilisé pour le passage du virus s&#39;avère être réfractaire à l&#39;absorption mutagène ou trop sensibles (toxicité cellulaire élevée), il peut être nécessaire d&#39;utiliser une autre lignée cellulaire qui répond à ces exigences et est toujours permissives à la réplication virale. Une fois que la variante la résistance mutagène est isolé, le reste de la caractérisation peut être réalisée dans l&#39;original, lignée cellulaire de choix. Dans notre expérience, les cellules HeLa facilement prendre jusqu&#39;à mutagène; cellules BHK nécessitent jusqu&#39;à 10 fois plus élevé et les concentrations de cellules Vero sont réfractaires à l&#39;absorption mutagène. Choix du mutagène. En essayant d&#39;isoler variantes fidélité par traitement mutagène, la probabilité de succès augmente si plus d&#39;un type d&#39;agent mutagène est utilisé. Base de mutagènes analogique de structure différente, qui sont incorporés dans les génomes tort lors de la réplication sera principalement induisent entraîner un sous-ensemble spécifique de mutations dans les cycles de réplication ultérieure: traitement ribavirine favorise GTOA de transition et de mutations CTOU 12; 5-azacytidine a un biais similaire, avec le Outre des CtoG et transversions GTOC 13; 5-fluorouracile préférentiellement induit des transitions et des ATOG UtoC 14. Alternativement, des concentrations plus élevées de Mg 2 + ou Mn 2 + peut être complétée au milieu pour augmenter la fréquence de mutation globale des virus à ARN, sans le biais décrits ci-dessus 12. Selon le codon séquences du virus, et les changements de codons nécessaires pour générer une variante fidélité, certaines de ces conditions seront favorables à l&#39;émergence de cette variante par rapport aux autres. Pour plus de fidélité le poliovirus et le virus Coxsackie G64S A372V, ribavirine plus facilement sélectionnés pour les variantes, car la transition ATOG requis sur le site codon correspondait à la prédominance des mutations générées par cette ribavirine. La taille de la population vs MOI. En virologie, les protocoles d&#39;infection culture de tissus accorder une attention particulière à la multiplicité d&#39;infection (MOI), pour éviter l&#39;accumulation de particules défectives interférentes (faible MOI) ou pour favoriser la recombinaison entre les virus (MOI élevé), pour par exemple. Pour sélectionner des événements de l&#39;émergence au cours de série repiquage, il est également important de considérer la taille des populations de virus. Depuis le mutant résistant existe d&#39;abord à basse fréquence, il est préférable de transférer une aussi grande taille de la population que possible d&#39;un passage à la suivante (10 5 -10 6 virus, par exemple) pour éviter de perdre ces variantes émergentes à chaque passage. Amplifier l&#39;importance de bien ou flacon (nombre de cellules infectées) peut aider à minimiser l&#39;augmentation de la MOI, si ce n&#39;est de préoccupation. D&#39;autre part, pour des expériences dans lesquelles la sensibilité d&#39;un virus à mutagène est actuellement testé, faible d&#39;infection MOI est effectuée afin d&#39;augmenter le nombre de cycles de réplication se produisent dans l&#39;expérience et d&#39;éviter le sauvetage des génomes mutagenèse par les génomes de fitness supérieur à travers complémentation en collaboration cellules infectées. Ceci est important car les mutations générées sur les génomes descendance durant le premier tour de la réplication ne sera pas immédiatement détecté. La plupart de ces ARNs mutagénisées sera toujours emballés dans des virions. C&#39;est dans le prochain cycle d&#39;infection qui mutations létales présents dans ces génomes se traduira par un cycle de réplication avorté, et la réduction du titre du virus. Il peut être nécessaire pour permettre plusieurs cycles d&#39;accumulation de mutations avant un effet significatif de la mutagenèse létale est observée. Enfin, si le passage sur la série, en présence du mutagène, les titres de virus continuent à baisser jusqu&#39;à l&#39;extinction, alors le chercheur devrait essayer de repiquage du virus dans progressivement des quantités croissantes d&#39;agent mutagène (à partir d&#39;une concentration très faible). L&#39;isolement et la génération du clone résistant à mutagène ARN à partir de l&#39;ARN mutagène résistant population. Mutagènes ARN d&#39;introduire de multiples mutations aléatoires à chaque génome, mais sélection pour la résistance ne enrichir (et fixer à la séquence consensus) la mutation de résistance. Pour identifier cette mutation, nous avons la séquence de la population résistante mutagène (consensus de la population) et non des virus individuels. Par conséquent, la seule, des mutations aléatoires créés par le mutagène ne sont pas détectés dans la séquence; que les mutations qui entraînent des changements consensus suivant la sélection, sont trouvés. Dans notre expérience, nous avons seulement identifier un ou deux changements tels séquence consensus. Une fois que la population résistante mutagène est obtenue et la mutation de résistance est identifié, il est nécessaire de générer un stock plus pure de cette variante. Ci-dessus, nous avons décrit une procédure de purification sur plaque. Alternativement, si le virus d&#39;intérêt ne produit pas de plaques facilement identifiables, la variante souhaitée peut être PurifIED en limitant la dilution. Cette approche est essentiellement un 50 DICT au format 96 puits, où le stock de virus est dilué de telle sorte que moins de 50% des puits sont contaminés. En utilisant cette dilution, la même approche que ci-dessus est prise, dans l&#39;isolement jusqu&#39;à 10 variantes individuelles et confirmant leurs séquences. Comme mentionné précédemment, dans le meilleur des cas, un clone d&#39;ADNc infectieux de la souche du virus est disponible. Isolement de la variante ne serait donc pas nécessaire. Dans notre expérience, la fidélité variantes sont le résultat de simples substitutions d&#39;acides aminés et peuvent ainsi être générés en utilisant de simples kits commercialisés tels que la mutagenèse QuikChange (Agilent). Une option secondaire est d&#39;utiliser un clone d&#39;ADNc d&#39;une souche étroitement liés. Cependant, si une souche apparentée est utilisé, nous recommandons fortement d&#39;utiliser à la fois cette approche et l&#39;isolement du virus (purification sur plaque, par exemple) parce que nous avons constaté que la même mutation altérant la fidélité de deux virus étroitement apparentés ne sera pas nécessairement le même effet. Fidelity et de réplication. Sélection de variants résistants mutagène ARN ont abouti à l&#39;isolement des deux variantes de fidélité supérieures et inférieures avec des caractéristiques de croissance qui sont semblables à leurs homologues de type sauvage 4,12,15. Actuellement, le lien entre les taux d&#39;activité de la polymérase et la fidélité n&#39;est pas entièrement comprise. In vitro, des études biochimiques utilisant l&#39;ARN polymérase purifiée ont montré que plus la fidélité variantes ont des taux de traitement plus lent, tandis que la baisse des variantes de fidélité ont tendance à avoir un traitement plus rapide 1-3,12. En culture de tissu, ces différences ne sont généralement pas évidente, ce qui suggère que la disponibilité des ressources, plutôt que de la cinétique intrinsèque de l&#39;activité polymérase, est l&#39;étape limitante. Si la variante la fidélité réplique avec une cinétique qui ne sont pas significativement différents de type sauvage, puis une comparaison de leurs fréquences de mutation peut être faite directement. Si un changement très important dans la cinétique de réplication existe, alors les données doivent être normalisées pour tenir compte des différences cinétiques, par exemple en comparant les virus qui ont subi le même nombre de cycles de réplication. Dans notre expérience, même si aucune différence significative dans une seule étape cinétique de croissance ont été observées entre le type sauvage et de haute fidélité de variantes, nous avons observé que plus la fidélité constamment variantes titre plus élevé (moins de 1 log) par rapport au type sauvage, mais ils font un peu moins d&#39;ARN (dans les du même ordre de grandeur), plus loin en suggérant que les génomes contiennent elles produisent moins de mutations et sont donc plus infectieux. La préparation des échantillons et le séquençage. Pour toutes les étapes de ces protocoles, il est impératif que haute-fidélité, la relecture des enzymes sont utilisées pour la PCR et RT-PCR afin de limiter l&#39;introduction de mutations supplémentaires, car ils ne peuvent pas être distingués des mutations biologiquement pertinentes. Il est essentiel que les populations de virus à comparer ont été préparés dans les mêmes conditions (historique des passages, milieu de culture tissulaire, la température, la méthode d&#39;extraction d&#39;ARN, RT-PCR des protocoles, etc) Il est également important de s&#39;assurer que suffisamment de matériel de départ a été obtenu à partir de l&#39;extraction d&#39;ARN tel que une forte bande est généré par RT-PCR. Une dilution 1 / 100 de l&#39;échantillon d&#39;ARN devrait également donner une détectable par RT-PCR bande, ce qui indique que l&#39;échantillon contient un nombre suffisant de molécules d&#39;ARN pour éviter les biais de représentation (amplification du génome mêmes à plusieurs reprises). Depuis la fréquence de mutation est une distribution, on pourrait s&#39;attendre à ce que des valeurs similaires seront obtenus indépendamment de la taille de la population, à condition que le biais susmentionnés ne se produit pas. Comme la figure 6 montre, à 10 5 fois la dilution d&#39;un stock de virus donne une fréquence de mutation qui n&#39;est pas significativement différente de la souche parentale. Jusque dans les conditions optimales pour le clonage TopoTA sont trouvés, de confirmer la présence d&#39;inserts après criblage bleu / blanc, par PCR sur colonie avant le séquençage. Comme un contrôle de bruit mutationnelle (mutations introduites par RT-PCR et séquençage), clone d&#39;un produit de PCR à partir d&#39;un plasmide portant les mêmes séquences virales et / ou le clone et la séquence de RT-PCR des produits ARN transcrit in vitro correspondant au génome du virus (soit conscients que différents dans les enzymes de transcription in vitro ont un taux d&#39;erreur différent et ne peuvent donner des informations utiles à l&#39;erreur de fond réel dans votre procédure). Certaines séquences de virus peuvent être toxiques pour les bactéries, il est donc important de vérifier cela avant de décider sur la région du génome viral à être séquencé pour la fréquence de mutation. En analysant les séquences obtenues par TopoTA, notez que chaque clone doit contenir qu&#39;une seule insertion / séquence. Si un double pic est observé, suggérant une population mixte, il est possible que les deux voisins colonies bactériennes ont été sélectionnés. Il est également possible, bien que hautement improbable étant donné les fréquences de mutation faible réplication bactérienne, que la mutation a été introduite lors de l&#39;amplification du plasmide dans la culture bactérienne. Dans la plaque purified populations, un double pic peut représenter des plaques qui se chevauchent, ou un virus qui est l&#39;acquisition d&#39;une nouvelle mutation ou de revenir d&#39;une mutation au cours du développement de plaque. Soyez cohérent et décider sur l&#39;opportunité de compter ou ne comptent pas ces mutations. Enfin, gardez à l&#39;esprit que les fréquences de mutation utilisés ici sont des valeurs relatives. Ils ne sont valables que dans la comparaison des populations de virus cultivés dans les mêmes conditions, et séquencé au cours de la même région! Ils ne devraient pas être prises comme des valeurs absolues des taux de mutation, ou la fréquence des mutations du génome dans son ensemble. Toutefois, lorsque les conditions sont contrôlées, elles ne permettent reproductibles, des comparaisons quantitatives des différences dans la répartition et la fréquence de mutation.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> ribavirine </td><td> Sigma </td><td> R9644-10MG </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorouracile </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacytidine </td><td> Sigma </td><td> A2385-100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Le bleu trypan </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA kit de clonage </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> QuikChange mutagenèse kit </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Si un clone d&#39;ADNc infectieux est disponible </td></tr><tr><td> 96-ainsi Miniprep Kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> Ou d&#39;autres logiciels d&#39;alignement </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

Les virus à ARN utilisent l&#39;ARN dépendante ARN polymérases à répliquer leurs génomes. Le taux d&#39;erreur intrinsèque élevée de ces enzymes est un contributeur important à la génération de la diversité de la population extrêmes qui facilite l&#39;adaptation du virus et son évolution. L&#39;augmentation de preuve montre que le taux d&#39;erreur intrinsèque, et les fréquences de mutation résultant, des virus à ARN peuvent être modulés par de subtiles changements d&#39;acides aminés de la polymérase virale. Bien que des dosages biochimiques existent pour certains ARN polymérases virales qui permettent une mesure quantitative de l&#39;incorporation de fidélité, ici nous décrire une méthode simple pour mesurer les fréquences de mutation des virus à ARN qui s&#39;est avéré être aussi précis que des approches biochimiques dans l&#39;identification des mutations altérant la fidélité. L&#39;approche utilise les techniques classiques virologiques et séquençage qui peuvent être effectuées dans les laboratoires les plus biologie. Basé sur notre expérience avec un certain nombre de virus différents, nous avons identifié les étapes clés qui doivent être optimisés pour augmenter la probabilité d&#39;isoler variantes fidélité et générer des données de la signification statistique. L&#39;isolement et la caractérisation de mutations altérant la fidélité peuvent fournir de nouveaux aperçus sur la structure et la fonction polymérase 1-3. En outre, ces variantes de fidélité peuvent être des outils utiles pour caractériser les mécanismes d&#39;adaptation du virus et l&#39;évolution 4-7.

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Le présent article décrit les étapes nécessaires pour isoler et caractériser l&#39;ARN polymérase variantes fidélité des virus à ARN et la façon d&#39;utiliser les données de fréquence de mutation pour confirmer les modifications fidélité dans la culture de tissus.

Isolement des variantes des virus à ARN de Fidelity et caractérisation de la fréquence de mutation de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

29.4K vues.  Institut Pasteur. Le présent article décrit les étapes nécessaires pour isoler et caractériser l'ARN polymérase variantes fidélité des virus à ARN et la façon d'utiliser les données de fréquence de mutation pour confirmer les modifications fidélité dans la culture de tissus.

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RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolement des ARN Pseudomonas aeruginosa La colonisation du tractus gastro-intestinal murin

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Recherche

Immunologie et infection

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolement et caractérisation de neutrophiles avec des propriétés anti-tumorales

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bactérienne Artificial Chromosomes: Un outil de génomique fonctionnelle pour l&#39;étude du brin positif de virus à ARN

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d&#39;un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Génération des variantes d’évasion de neutraliser les anticorps monoclonaux Influenza Virus

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identification de codage et de Classes d’ARN Non codants exprimée chez le porc sang total

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Analyses de compétence vectorielle sur les moustiques Aedes aegypti utilisant le virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...