Sarah A. Alfaqeeh est financé par Genre Saud University College of Dentistry, Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur, Royaume d&#39;Arabie Saoudite.

Une. Set Up <ol><li> Aiguisez les instruments de dissection (en utilisant une pierre à aiguiser lubrifié avec de l&#39;huile minérale) et stériliser avant utilisation pour la culture d&#39;organes à l&#39;aide d&#39;un spray d&#39;éthanol à 70% et la stérilisation à chaleur sèche. Affûter les aiguilles de dissection par électrolyse dans de l&#39;hydroxyde de sodium 2 M en utilisant une alimentation de 12 V. </li><li> Préparer le milieu de culture utilisé pour la dissection et la culture d&#39;organes embryonnaires, consistant en la modification F12 Eagle Medium avancée Dulbecco (DMEM F12) complété avec 1% GlutaMAX et 1% de pénicilline-streptomycine. </li></ol> 2. Embryon Dissection <ol><li> Abattre une femme enceinte accouplés chronométré en utilisant une méthode horaire un tel qu&#39;approuvé par le Home Office ou autre organe. Disséquer la peau autour de l&#39;abdomen inférieur, et couper ouvrir l&#39;abdomen avec des ciseaux. Repérez les deux cornes utérines, qui relient ensemble à la ligne médiane inférieure. </li><li> Disséquer l&#39;utérus et le placer dans un tube rempli de milieu sur la glace. EPMn sur de la glace, le tissu peut être laissée pendant plusieurs heures. </li><li> Enlever l&#39;utérus et les placer dans une boîte de Pétri en milieu sous le microscope. Où dissections d&#39;embryons possibles doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire pour minimiser la contamination. </li><li> Disséquer les embryons de l&#39;utérus et les libérer de leurs tissus extra-embryonnaires. </li><li> Décapiter les embryons en utilisant une aiguille de tungstène et de transférer les têtes dans une nouvelle boîte de milieu. </li><li> Isoler les mandibules de la tête en plaçant une aiguille dans la cavité buccale et couper vers l&#39;arrière de la tête (figures 1A et 1B). Mandibules isolées peuvent être stockés temporairement dans un milieu sur la glace en attendant pour hacher. </li><li> Pour les tranches mandibule ensemble des étapes E11.5 E15.5-sont idéales pour la culture des germes dent. Après E15.5 l&#39;os en développement dans la mandibule est trop dur pour hacher. tranches de dents peuvent encore être apportées, mais l&#39;os (l&#39;os alvéolaire dentaire et la formation) doivent d&#39;abord être éliminés pardissection avant de les hacher 9. Retirez soigneusement os en utilisant des aiguilles de tungstène et une pince. </li></ol> 3. Embryon tranchage <ol><li> Préparer les tranches de tissu mandibule en utilisant un broyeur de tissu de table standard (figure 1C). Utilisez une lame neuve après environ 200 mandibules, et assurez-vous qu&#39;il affleure avec le disque de montage quand il tombe. </li><li> Nettoyez le disque de montage et la lame avec 70% d&#39;éthanol avant utilisation. Il faut prendre soin lors de l&#39;utilisation de la machine, comme la lame est très pointue. </li><li> Régler le hacheur à une distance de coupe de 200 à 400 um entre fonction de l&#39;âge de l&#39;échantillon, et selon que l&#39;ensemble du germe dentaire est nécessaire. Réglez la pression de la lame au maximum. </li><li> Transférer une mandibule vers le disque de support en plastique à l&#39;aide d&#39;une pipette ou d&#39;une pince. Organiser la mandibule sur le disque en veillant à l&#39;orientation est toujours clair. La languette de développement peut être utilisé comme un point de repère utile pour déterminer l&#39;orientation. Pour molaires utilisation afRontal / orientation transversale (voir plan de découper la figure 1B), tandis que pour les incisives utiliser un coupe sagittale par la mandibule afin de refléter l&#39;orientation différente de ces dents à mesure qu&#39;ils grandissent (voir plan de découper la figure 2A). </li><li> Éliminer le milieu en excès à travers le tissu en utilisant un papier-filtre afin de sécher légèrement la mandibule sur le disque de montage. </li><li> Immédiatement après le séchage, placez le disque sur le tableau de l&#39;hélicoptère circulaire en acier inoxydable. Allumez la machine et appuyez sur start. Le tableau qui traverse automatiquement à partir de la gauche vers la droite alors que dans le même temps le bras portant la lame de hachage est élevée, et a chuté jusqu&#39;à 200 coups / min. </li><li> Eteignez la machine une fois que le tissu a été complètement tranché. Assurez-vous que le bras de la lame est en position relevée et retirez le disque. Ne pas placer les doigts sous le bras de la lame ou laisser la machine sans surveillance pour hacher. </li><li> Prenez le disque de montage et ajouter immédiatement milieu to les tranches sur le disque afin de prévenir l&#39;assèchement excessif. Dégagez délicatement le tissu en tranches de la partie inférieure du disque à l&#39;aide d&#39;une aiguille de tungstène et la pipette dans une petite boîte de Pétri de milieu (figure 2A). </li><li> Séparer les tranches à l&#39;aide d&#39;une aiguille, puis sélectionnez les tranches de tissu contenant le tissu d&#39;intérêt sous un stéréomicroscope (figures 1D, 1E, et 2B). Placer les tranches sélectionnées dans des boîtes de culture frais avec le milieu. </li></ol> 4. Tranche Culture <ol><li> Préparer des boîtes de culture organe central-bien prêts pour la culture en ajoutant environ 2 ml d&#39;eau à l&#39;autoclave pour le bien externe pour éviter la déshydratation, et par le positionnement d&#39;une grille métallique à travers le centre de l&#39;assiette (figures 3A et 3B). </li><li> Préparer des grilles métalliques par des bandes d&#39;environ 4 cm x 1,5 cm à partir de feuilles de treillis en acier inoxydable de coupe. Utilisez une perforatrice pour faire un trou au centre et plierles côtés pour créer une fin en quinconce. La grille doit être bien à plat à travers le puits central, couché parallèlement au fond de la cuvette (figures 3A et 3B). Autoclave pour stériliser les grilles avant de l&#39;utiliser. </li><li> Couper un morceau de téréphtalate de polyéthylène transparent (PET) membrane (taille des pores 0,4 um) suffisamment grand pour recouvrir le trou de la grille. Placer la membrane de coupe dans le plat avec la tranche sélectionnée. </li><li> Placez la tranche au-dessus de la membrane, puis soulevez délicatement la membrane de la moyenne, avec une tranche aplatie dans le centre. </li><li> Placer le filtre dans la grille sur le trou circulaire au centre, et à environ 1 ml de milieu de culture à la source, au niveau de la membrane. </li><li> Pour les manipulations ajouter des protéines ou des inhibiteurs de petites molécules dans le milieu (par exemple 8). </li><li> Photographier la tranche pour un enregistrement de la morphologie au jour 0 de la culture. </li><li> Placez les plats dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO <sub&gt; 2 à 37 ° C dans un incubateur. </li><li> Photographier les cultures à intervalles réguliers pour en moyenne 7 jours. Changer le milieu de culture tous les 48-72 heures. Pour la photographie afficher les tranches avec une source de lumière de dessous (figures 2C-E). </li></ol> 5. Lineage traçage Si lignée traçage est nécessaire, des colorants lipophiles tels que Dil ou DiO peuvent être injectés dans le germe de la dent avant l&#39;étape 4, la culture de la tranche. <ol><li> Tirez aiguilles capillaires en verre à l&#39;aide d&#39;un extracteur d&#39;aiguilles. </li><li> Casser l&#39;embout de l&#39;aiguille en utilisant une pince et placer la pointe vers le bas dans la solution de colorant. Laissez agir quelques minutes tandis que le colorant remplit la pointe par capillarité. </li><li> Placez l&#39;aiguille rempli dans un support et fixer par un tuyau à un injecteur ou la bouche aspirateur. </li><li> Positionner la pointe de l&#39;aiguille dans le milieu de culture de toucher la zone de la tranche due à étiqueter. Appliquer une pression d&#39;air pour déplacer une petite quantité de colorant sur la une de l&#39;aiguilleD sur le tissu. </li><li> Retirer l&#39;aiguille et vérifier si l&#39;étiquetage en fluorescence. </li><li> Tranches marquées avec succès peuvent être transférées sur des filtres et cultivées comme décrit dans l&#39;étape 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+dental+mesenchyme:+dynamic+development+of+the+dental+papilla+and+follicle.">Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle.</a> Developmental biology. 366, 244-254 (2012).</li><li>Ferguson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+an+essential+early+mesenchymal+signal+in+tooth+development+that+is+required+for+patterning+of+the+murine+dentition.">Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition.</a> Genes &amp; development. 12, 2636-2649 (1998).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).</li><li>Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+primary+and+secondary+enamel+knots.">Cell lineage of primary and secondary enamel knots.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).</li><li>Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+relationship+between+Tbx1+and+FGF+signaling+during+tooth+morphogenesis+and+ameloblast+lineage+determination.">A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination.</a> Developmental biology. 320, 39-48 (2008).</li><li>Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+tooth+bud+mesenchyme+to+alveolar+bone.">Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone.</a> Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).</li><li>Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mesoderm+to+the+developing+dental+papilla.">Contribution of mesoderm to the developing dental papilla.</a> The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).</li><li>Buchtova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+patterning+of+the+snake+dentition+are+dependent+on+Sonic+hedgehog+signaling.">Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling.</a> Developmental biology. 319, 132-145 (2008).</li><li>Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+regression+of+the+dental+lamina+underlies+the+development+of+diphyodont+dentitions.">Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions.</a> Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).</li><li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+enamel+knot+determines+the+position+of+the+first+buccal+cusp+in+developing+mice+molars.">The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars.</a> Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).</li><li>Sakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+in+cervical+loop+epithelium+during+transition+from+crown+to+root:+implications+for+Hertwig's+epithelial+root+sheath+formation.">Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation.</a> Journal of periodontal research. , (2012).</li><li>Fisher, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+in+vitro+of+the+whole+and+halved+lower+molar+tooth+germ+of+the+mouse.">Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse.</a> Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).</li><li>Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+halved+embryonic+lower+first+mouse+molars:+correlation+with+the+distribution+pattern+of+non+dividing+IDE+cells,+the+putative+organizers+of+morphogenetic+units,+the+cusps.">Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps.</a> The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).</li><li>Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+evolutionary+patterns+of+mammalian+teeth+from+development.">Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development.</a> Nature. 449, 427-432 (2007).</li><li>Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+the+inductive+mesenchyme:+Sostdc1+uncovers+the+role+of+dental+mesenchyme+in+limiting+tooth+induction.">Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction.</a> Development. 136, 393-402 (2009).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Cette méthode de culture de la dent présente l&#39;avantage que l&#39;accès au germe de la dent est excellente, ce qui permet lignée de traçage précis et le placement des billes à l&#39;intérieur de l&#39;épithélium ou du mésenchyme. Régions définies du germe dentaire en développement peuvent donc être spécifiquement ciblées. Au cours de la culture de la morphologie évolution du germe de la dent peut être suivie, et l&#39;effet de manipulations a rapidement évalué. Le pr...

Pour un certain nombre d&#39;expériences, il est important d&#39;être en mesure de tissu de culture ex vivo pour suivre le développement. Culture de développer le tissu permet d&#39;accéder à des périodes déterminées de développement et permet la manipulation de gènes par l&#39;addition de facteurs de milieu de culture, ou sur des billes chargées, et par l&#39;utilisation de la transfection et électroporation 1. Pour de nombreuses expériences, il est important d&#39;être capable de visualiser le tissu pendant sa croissance, par exemple, de suivre le sort des cellules de la lignée marqué que le tissu est soumis à la morphogenèse. Cela peut être particulièrement problématique pour les tissus qui se développent plus profond de l&#39;embryon, qui ne sont pas évidentes lorsque un bloc de tissu à partir de l&#39;embryon est mis en culture. Les dents sont de bons exemples de ce qui se développent au sein du processus nasal mandibule, maxillaire et frontal. Lorsque l&#39;ensemble de la mandibule est cultivé les structures superficielles de la dent peut être consulté mais des changements dans la morphologie ne peuvent être analysés après la coupe de tissu fixe <sjusqu&#39;à&gt; 2. Nous avons adapté une technique de culture de tranche en direct nous permettant de suivre le développement du germe dentaire et l&#39;accès aux différentes parties de la dent au cours du développement. Les cultures de la technique des tranches dent germinales à l&#39;interface gaz-liquide, en utilisant une méthode Trowell modifiée 3. Ces cultures tranche ont été très utiles en suivant directement la morphogenèse de la dent, et en permettant le traçage lignée de composants distincts, tels que le noeud de l&#39;émail et de la papille dentaire et follicule 1,4-7. La technique ne se limite pas à des embryons de souris et a été utilisé avec succès pour la culture tranches en direct de porc et serpent dentaire 8,9 tissulaire. En plus de l&#39;avantage d&#39;être en mesure de visualiser le développement des dents, la méthode de la tranche a aussi l&#39;avantage que les fines tranches de tissu ont un accès accru à des éléments nutritifs du milieu et de l&#39;air de l&#39;incubateur. Il en résulte une amélioration de la croissance des germes dentaires, qui correspondent le développement in vivo, et montrent invasion des cellules endothéliales dans la papille 7. En revanche, les germes dentaires dans des cultures entières mandibule se développent plus lentement que ceux in vivo et le centre de la culture est souvent nécrotique dans des cultures à long terme. Dans la culture de la tranche, la dent se développe à l&#39;intérieur d&#39;une tranche de la mâchoire, et son interaction avec le développement de l&#39;os environnant et d&#39;autres tissus peut être surveillée. Dans notre procédé, le tissu est coupé immédiatement après dissection sans qu&#39;il soit nécessaire d&#39;incorporer dans un milieu de support 10,11 et aucun besoin pour un système pour fixer le tissu sur le billot. La méthode est donc non invasive et rapide, permettant à de nombreux mandibules à sectionnés en une seule session.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101077Y</td>
			<td>100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Advanced Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>Cell-labeling solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Cell tracker CM-DiI, C-7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geminator 500</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>Thomas No. 3885A20</td>
			<td>Dry-heat sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Standard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 &#956;m pore size)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>PET track-etched membrane, 6-well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>FE228710</td>
			<td>(Fe/Cr18/Ni10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td>Intracel Ltd</td>
			<td>051-0500-900 0-100 psi</td>
			<td>Single channel picospritzer III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary with filament 1 mm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.1 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.38 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>Used for mouth aspiration lineage tracers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the slice culture method for following development of tooth germs in explant culture

culture de l&#39;explantation permet la manipulation de développer des organes à des moments spécifiques et est donc un moyen important pour la biologie du développement. Pour de nombreux organes, il est difficile d&#39;accéder à un tissu en développement pour permettre la surveillance au cours de la culture ex vivo. Procédé de culture de tranche permet l&#39;accès à un tissu de sorte que les mouvements morphogénétiques peuvent être suivies et des populations de cellules spécifiques peuvent être ciblés pour la manipulation ou la lignée de traçage. Dans cet article, nous décrivons une méthode de culture de la tranche qui a été très fructueuse pour la culture des germes de dents dans une gamme d&#39;espèces. La méthode offre un excellent accès aux germes dentaires, qui se développent à un rythme similaire à celui observé in vivo, entouré par les autres tissus de la mâchoire. Ceci permet des interactions entre tissus situés entre la dent et du tissu environnant à contrôler. Bien que ce document se concentre sur les germes dentaires, le même protocole peut être appliqué à suivre le développement d&#39;un certain nombred&#39;autres organes, comme les glandes salivaires, le cartilage de Meckel, les glandes nasales, de la langue, et l&#39;oreille.

Afin de suivre le mouvement du premier follicule dentaire molaire, 250 um tranches frontales ont été prises au moyen d&#39;un maxillaire inférieur en utilisant la méthode décrite ci-dessus. Le follicule dentaire est la couche de mésenchyme qui entoure l&#39;émail épithélium externe (OEE) de la dent de développement, et a été montré précédemment pour participer à la formation de tissus du parodonte 6. Mandibules ont été disséqués à E14.5, l&#39;étape de bouchon de développement des dents...

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The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Ici, nous détaillons une méthode de culture des germes de dents dans la mandibule tranches en utilisant un broyeur de tissus. Cette méthode permet un accès unique à la dent au cours du développement, offrant une excellente occasion pour la manipulation et de la lignée de traçage, pas disponible en utilisant des méthodes de culture traditionnelles.

La méthode la Culture Slice pour la suite du développement des germes de dents dans explantation Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

the-slice-culture-method-for-following-development-tooth-germs

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K vues.  King's College London.  Ici, nous détaillons une méthode de culture des germes de dents dans la mandibule tranches en utilisant un broyeur de tissus. Cette méthode permet un accès unique à la dent au cours du développement, offrant une excellente occasion pour la manipulation et de la lignée de traçage, pas disponible en utilisant des méthodes de culture traditionnelles. 

Vidéo: The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Culture organotypique des cerveaux de rat E18

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Recherche

Biologie

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

Préparation de balles pistolet à gènes et transfection biolistique des neurones en culture Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

La méthode de culture des embryons rongeurs entier en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

Une nouvelle méthode pour la Culture et polarisé stimulation des explants de muqueuse intestinale de l&#39;homme

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Méthode de la culture pour le embryonnaire Souris Coeur

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d&#39;embryons sans sérum

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.