La qualité de la suspension monocellulaire préparée est cruciale pour obtenir des résultats fiables et de haute qualité pour toute méthodologie omique unicellulaire. Et ce protocole vous montrera comment isoler les cellules rapidement, doucement et de manière robuste à partir de tissus même très difficiles. Le principal avantage de ce protocole est le traitement rationalisé des tissus qui permet la dissociation tissulaire et l’isolement des cellules d’un grand nombre d’échantillons en peu de temps avec une qualité parfaite.
Bien que cette méthode ait été développée pour les dents de souris et humaines, elle pourrait également être appliquée à d’autres tissus riches en matrice extracellulaire, y compris le cartilage, les os ou le tissu conjonctif dense. La procédure d’isolement des pulpes dentaires des dents humaines et en particulier des souris est manuellement difficile. Nous conseillons à tout le monde de tester cela avant le début des expériences réelles.
Pour commencer, tenez la souris euthanasiée derrière sa tête en regardant l’aspect ventral de sa tête afin que la queue pointe vers l’extérieur. À l’aide des ciseaux petits et tranchants, retirez rapidement la peau de la mandibule pour exposer l’arc mandibulaire, les tissus mous entre chaque moitié des mandibules et les muscles faciaux adjacents. Pour faire une coupe profonde de chaque côté de la mandibule, coupez d’abord à travers le masséter le long du côté buccal de la mandibule jusqu’à l’articulation temporo-mandibulaire, puis coupez le long de la partie interne de chaque moitié de la mandibule à travers la base de la cavité buccale.
Coupez tous les muscles et ligaments le long de la mandibule jusqu’à l’articulation temporo-mandibulaire de l’extérieur et de l’intérieur de la cavité buccale. Saisissez la mandibule à l’aide de la pince à épiler à pointe pliée et retirez-la. Ensuite, avec les ciseaux, coupez à travers la symphyse mandibulaire pour diviser la mandibule disséquée en deux moitiés.
Utilisez une lingette industrielle à faible peluche pour froisser les tissus mous restants de chaque moitié de la mandibule. Une fois les deux parties de la mandibule nettoyées, placez-les dans une boîte de Petri pré-préparée avec du HBSS glacé. Pour la dissection des incisives mandibulaires, retirer la crête alvéolaire avec les trois molaires et fissurer transversalement l’arc mandibulaire à l’endroit correspondant à la position entre la première et la deuxième molaire.
Retirez soigneusement l’incisive du reste de l’alvéole dentaire. Si nécessaire, retirez les fragments d’os restants attachés à l’incisive avec une pince à épiler et un scalpel. Placez les incisives disséquées dans du HBSS frais et glacé.
Après avoir disséqué le tissu d’intérêt, placez les tissus mous disséqués dans une gouttelette de HBSS frais glacé au milieu d’une boîte de Petri de 10 centimètres conservée sur de la glace. À l’aide d’une lame de scalpel numéro 10 de forme ronde, coupez le tissu en morceaux les plus petits possibles. Après avoir réagrégé les morceaux de tissu au milieu de la gouttelette, coupez à plusieurs reprises les agrégats de tissu avec la même lame de scalpel et répétez ce processus jusqu’à ce que le matériau soit suffisamment haché.
Transférer les morceaux de tissu déchiquetés à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre dans un mélange de digestion préalablement préparé. Placez ensuite le tube à un angle de 60 degrés et réglez la vitesse à 150 à 200 tr / min pour assurer des mouvements de suspension constants à l’intérieur du tube et incuber pendant 15 à 20 minutes. Après toutes les trois à quatre minutes pendant l’incubation, titrer vigoureusement la suspension à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre pour désintégrer toutes les touffes.
À la fin de l’incubation, après avoir titré la suspension cellulaire pour la dernière fois, ajoutez lentement la solution de lavage à froid glacé à un volume final de 12 millilitres. Centrifuger la suspension de la cellule à 300 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis retirer soigneusement le surnageant avec une pipette sérologique de 10 millilitres. Remettre la pastille dans la solution de lavage pour atteindre la concentration finale de 700 à 1 200 cellules par microlitre.
Passez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 50 micromètres pour enlever les touffes ou les morceaux de tissu calcifié restants et garder le tube sur la glace jusqu’à un traitement ultérieur. Ensuite, pour le tri des cellules activées par fluorescence, chargez les cellules dans un tube préparé. Chargez le tube dans le trieur de cellules et définissez une stratégie de contrôle stricte pour éliminer les débris cellulaires, les doublets et les cellules mortes, comme décrit dans le manuscrit du texte.
Tout d’abord, la coloration des anticorps CD45 et l’analyse FACS subséquente ont été utilisées pour clarifier le nombre de cellules immunitaires dans la suspension monocellulaire finale. À titre de méthode complémentaire, le nombre total de cellules immunitaires CD45 positives dans les données de séquençage de l’ARN unicellulaire a été analysé. En utilisant FACS, 14,44% des cellules CD45 positives ont été identifiées.
L’analyse des données de séquençage de l’ARN unicellulaire a montré que 10,9 % des cellules exprimant le CD45 et que la diminution du nombre de cellules dans les données de séquençage de l’ARN unicellulaire pourrait être causée par un seuil supplémentaire au cours de l’analyse du séquençage. L’essentiel est d’être rapide et de garder ce tissu ou ces cellules sur la glace autant que possible. Le nombre de cellules isolées peut être très faible, en particulier lors de l’isolement molaire de la souris.
Évitez la perte de cellules. La réduction du temps d’isolement d’une seule cellule est très importante pour le succès de toutes les expériences sur une seule cellule. Et cette méthode spécifique a vraiment permis de réduire ce temps et d’ouvrir la voie à un type de cellule dentaire de haute qualité pour les systèmes souris et humains.
