L&#39;auteur remercie Roberto Kolter (Harvard Medical School) pour ses conseils et son aide lors de l&#39;élaboration de cet écran de co-culture inestimable. Elle remercie également Matthew Powers pour lire le manuscrit pour plus de clarté, et Chia-yi Cheng pour l&#39;aide à l&#39;obtention de la figure 6.

<ol>
	<li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+microbial+metabolites.">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis.">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Shank, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+interactions+that+result+in+Bacillus+subtilis+forming+biofilms+are+mediated+mainly+by+members+of+its+own+genus.">Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).</li><li>Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fluorescent Proteins. , (2013).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Nicolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condition-dependent+transcriptome+reveals+high-level+regulatory+architecture+in+Bacillus+subtilis.">Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis.</a> Science. 335, 1103-1106 (2012).</li><li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis.">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li><li>Shimotsu, H., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+single-copy+integration+vector+and+its+use+in+analysis+of+regulation+of+the+trp+operon+of+Bacillus+subtilis.">Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.</a> Gene. 43, 85-94 (1986).</li><li>Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+for+ectopic+integration+in+Bacillus+subtilis.">Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis.</a> Gene. 180, 57-61 (1996).</li><li>Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrative+elements+of+rhizobiophage+16-3+can+integrate+into+proline+tRNA+(CGG)+genes+in+different+bacterial+genera.">Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera.</a> J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).</li><li>Charpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cassette-based+shuttle+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).</li><li>Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+an+integration-proficient+vector+based+on+the+site-specific+recombination+mechanism+of+enterococcal+temperate+phage+phiFC1.">Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1.</a> J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (60), e3796 (2012).</li><li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis.">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li><li>Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+culture+of+'unculturable'+bacteria.">Strategies for culture of 'unculturable' bacteria.</a> FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).</li><li>Romano, J. D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas-Saccharomyces+interactions:+influence+of+fungal+metabolism+on+bacterial+physiology+and+survival.">Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival.</a> J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).</li><li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix.">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Une des limites inhérentes à ce protocole est qu&#39;il repose sur la cultivabilité d&#39;organismes microbiens. Comme il a été bien documenté 24, plus la vie microbienne sur la planète ne peut pas (encore) être cultivé dans les conditions de culture explorées à ce jour. Ainsi, un grand nombre d&#39;interactions entre les espèces microbiennes qui se produisent dans les milieux naturels ne soit pas détecté en utilisant cette approche. Cependant, depuis notre désir est d&#39;identifier non seulem...

Nous sommes intéressés à comprendre comment les métabolites que les bactéries sécrètent affectent la physiologie et le développement des microbes voisins. De nombreux métabolites ont été caractérisés pour leurs effets bioactifs sur d&#39;autres microbes. Deux exemples bien décrits comprennent les antibiotiques, qui inhibent la croissance d&#39;autres micro-organismes et des molécules de détection de quorum, qui altèrent l&#39;expression génique globale d&#39;autres microbes. Cependant, les bactéries produisent de nombreuses autres petites molécules de produits naturels qui n&#39;ont pas de bioactivité connus 1. Nous émettons l&#39;hypothèse que les bactéries ont évolué et conservé la capacité de produire certains de ces métabolites car ils leur permettent de moduler la physiologie cellulaire de leurs voisins microbiennes dans les communautés microbiennes complexes qui existent dans la plupart des bactéries. Les types de cellules de Bacillus subtilis Nous avons concentré nos études sur les interactions microbiennes médiation chimique qui impliquent Bacilsubtilis UGB. Ce n&#39;est pas seulement en raison de son statut de bactérie modèle à Gram positif et les outils génétiques résultantes disponibles pour sa manipulation, mais aussi en raison de sa capacité à se différencier en différents types cellulaires caractérisés. Des exemples comprennent des cellules qui sont: la natation, produisant la matrice extracellulaire qui est requise pour la formation de biofilm robuste; compétentes pour absorber l&#39;ADN à partir de l&#39;environnement, et la sporulation, entre autres deux. Chacun de ces types de cellules exprime un régulon de transcription caractéristique qui les rend physiologiquement et / ou physiquement distinct de leurs frères et sœurs génétiquement identiques. Dans de nombreuses conditions de croissance, plusieurs types de cellules coexistent en tant que sous-populations différentes au sein d&#39;une seule colonie de B. cellules subtilis 3. Bien que de nombreuses espèces de bactéries peuvent présenter analogue type de cellule hétérogénéité, ce phénomène a été particulièrement bien étudié dans B. subtilis. En particulier, les gènes qui sont epuegulated à l&#39;intérieur de chacun de ceux-ci spécifique B. types de cellules subtilis ont été identifiés. L&#39;identification de ces gènes régulés à la hausse est essentiel pour le travail décrit ici parce que beaucoup de ces phénotypes microbiennes d&#39;intérêt sont difficiles ou impossibles à observer directement. Par exemple, nous ne pouvons pas détecter visuellement un trait comme la natation sur de solides (1,5%) des plaques d&#39;agar, même si une sous-population de B. cellules subtilis produisent des flagelles dans ces conditions 3. Un autre exemple est biofilm matrice-production. la production de la matrice peut être visualisée par la morphologie des colonies (comme il en résulte colonies ridées macroscopiquement), mais seulement sur ​​certains milieu de culture, et seulement après plusieurs jours de croissance 4. Cependant, en connaissant les gènes qui sont régulés à la hausse au cours de la différenciation, on peut construire reporters transcriptionnels qui agissent comme des marqueurs de différenciation cellulaire dans ces types cellulaires. constructions Reporter Ces fluorescent transcriptional reporters sont constitués par les promoteurs pour des gènes spécifiques du type cellulaire entraînant la production d&#39;un gène rapporteur, par exemple une protéine fluorescente. Les exemples incluent P hag-YFP (pour la natation cellules), P Tapa-YFP (pour les cellules de la matrice produisant biofilm), et P SSPB-YFP (pour la sporulation des cellules), où P x indique la région du promoteur pour le gène x. Ces constructions rapporteurs sont intégrés dans un locus sur le chromosome neutre (figure 1 et le voir ci-dessous) de sorte que la régulation native du phénotype est laissée intacte. Cependant, maintenant, quand une cellule exprime ce phénotype, il exprime aussi une protéine fluorescente. Ceci permet d&#39;obtenir une lecture facile à visualiser de l&#39;activation du comportement particulier phénotypique, ce qui nous permet de cribler des microbes qui activent cette réponse physiologique. Bien que de tels rapporteurs sont couramment utilisés en microbiologie, ils n&#39;ont pas été largement appliquée dans des écrans à identifinteractions métaboliques entre les microbes y avant cette méthode a été décrite 5. Il ya un certain nombre de considérations importantes dans la conception et la construction de-spécifique de type cellules souches rapporteurs. Nous avons utilisé journalistes fluorescents exclusivement transcription, bien que d&#39;autres types de constructions sont certainement possibles. Nous déconseillons l&#39;utilisation de fusions traductionnelles comme marqueurs de différenciation de type de cellule dans l&#39;écran, cependant, pour deux raisons: 1) le désir de quitter le spécifique de type cellulaire protéine native imperturbable, et 2) la reconnaissance que diffuse, cellulaire large fluorescence sera plus facile à détecter que les points lacrymaux localisée dans les cellules (commun avec fusions traductionnelles). sélection d&#39;un gène rapporteur Après avoir décidé d&#39;utiliser la transcription en-lue, le gène rapporteur doit être sélectionnée (par exemple LacZ, fluorescence, ou la luciférase). LacZ a l&#39;avantage de nécessiter le moins spécialeized matériel de détection, mais il ya un risque beaucoup plus élevé de faux positifs parmi les microbes de l&#39;environnement. Dans nos mains, le niveau du lac organismes + parmi les microbes du sol de fond était prohibitif (&gt;&gt; 10% des microbes du sol étaient bleues (Lac +) sur des plaques X-gal; données non présentées). Il est possible que la concentration en titrant de X-gal dans le milieu, ce qui pourrait être optimisé pour permettre l&#39;utilisation d&#39;un rapporteur X-gal, mais nous n&#39;avons pas cherché ce produit. Luciférase offre une grande sensibilité de détection et est le journaliste le plus orthogonal: il n&#39;y a presque aucune chance de microbes de l&#39;environnement étant intrinsèquement luminescent. Cependant, nous avons constaté qu&#39;il est difficile d&#39;identifier les instruments à notre institution qui permettait la détection de luminescence dans des boîtes de Pétri entières, comme la plupart ont été conçus pour numériser les régions ne localisées dans des plaques multi-puits. Il pourrait également y avoir des complications dans la visualisation des colonies luminescents d&#39;une manière qui a également permis à la physique simultanée estolation des organismes induisant. Tout en utilisant des fiduciaires peut avoir rendu cela possible, nous la place choisi d&#39;utiliser journalistes transcription fluorescentes, qui ont été prouvée à travailler en B. subtilis, à condition sensibilité adéquate des taux de détection et de faux positifs faibles entre les organismes du sol, et autorisés à utiliser des instruments facilement disponibles à la fois pour la visualisation et les procédures d&#39;isolement. sélection de fluorophore Le fluorophore spécifique choisi dépendra de vos espèces bactériennes, le milieu de croissance agar que vous utilisez, et le filtre de fluorescence particulier définit dont vous disposez. Avec nos instruments, nous avons constaté que les deux B. subtilis eux-mêmes et l&#39;agar ils ont été cultivés sur exposé moins de fluorescence de fond quand YFP (protéine fluorescente jaune) filtres ont été utilisés, ce qui rend ce journaliste supérieure à la GFP (protéine fluorescente verte) dans nos mains colonies. L&#39;usage des codons des protéines fluorescentes sontsouvent optimisé pour les eucaryotes, il est donc important de choisir un fluorophore soit connu de la littérature de travailler dans vos espèces bactériennes, ou pour tester explicitement l&#39;aide d&#39;un promoteur constitutif. Un grand nombre de constante évolution variantes de protéines fluorescentes sont actuellement disponibles 6, qui ont été examinés dans un certain nombre de sources 7,8, dont certains prévoient explicitement des conseils sur le choix d&#39;une protéine fluorescente correspondant à votre expérience 9. sélection de promoteur La sélection d&#39;un promoteur dépendra en grande partie sur le type de cellule ou phénotype d&#39;intérêt. Pour les organismes tels que B. subtilis, certains gènes rapporteurs spécifiques du type cellulaire ont été établies dans la littérature. Pour d&#39;autres souches bactériennes, en examinant microarray ou données transcription sera nécessaire de fournir des informations sur les gènes qui sont fortement régulés à la hausse dans les conditions où votre intérêt i cellulaires manifesté. Une étude récente a catalogué la transcription de B. subtilis moins de 104 différentes conditions de croissance à l&#39;aide de puces à ADN de carrelage 10. Ce document fournit des informations complètes sur les gènes sont fortement régulés à la hausse dans des conditions différentes, ce qui est inestimable pour les phénotypes moins bien caractérisés. Plutôt que de cartographier les régions promotrices précises pour chaque gène d&#39;intérêt, nous utilisons généralement tout simplement la séquence 200-500 pb en amont du gène en tant que promoteur. La longueur de la séquence exacte dépend du contexte génomique: les régions plus courtes sont utilisés lorsque cela est nécessaire pour éviter d&#39;inclure des régions codantes en amont du cadre de lecture ouvert voisin. Loci et l&#39;intégration neutre Comment maintenir la construction reporter dans votre souche bactérienne devient la dernière question de la conception d&#39;une souche de transcription rapporteur fluorescent. Chez les bactéries, les gènes d&#39;intérêt sont souvent maintenussur des plasmides à l&#39;aide de la sélection antibiotique. Cependant, il peut ne pas être possible d&#39;utiliser des antibiotiques au cours de la co-culture sans tuer les microbes environnementaux. Si plasmides sont maintenus de façon stable dans vos espèces bactériennes, il peut être possible cultiver vos bactéries contenant un journaliste porté par un plasmide en présence d&#39;antibiotiques pour préparer votre rapporteur pour le dépistage, puis éliminer les antibiotiques au cours de la co-culture elle-même dans l&#39;espoir que le plasmide être maintenue suffisamment pour permettre la fluorescence. Toutefois, si les plasmides sont facilement perdus dans votre bactérie, ou sont perdus dans des conditions de stress, ce ne sera pas une option viable. Dans de nombreux cas, la meilleure solution consiste à intégrer la construction de rapporteur sur le chromosome bactérien, ce qui permet le maintien stable du rapporteur, même en l&#39;absence de sélection. Pour l&#39;intégration de ne pas perturber l&#39;expression normale ou d&#39;un règlement de votre gène d&#39;intérêt, nous vous recommandons d&#39;intégrer dans un site ectopique sur le chromosome que can agir comme un «lieu neutre». Dans B. subtilis ces sites d&#39;intégration sont des gènes qui - lorsqu&#39;ils sont mutés - transmettre un phénotype dans certains médias minimale (permettant intégrants à être identifiés sans sélection antibiotique), mais ne modifient pas la croissance ou le taux de sporulation dans les médias riches, et inclure ces gènes que amyE, lacA, thrC, pyrD, GLTA, et Saca (transport de la capacité à utiliser l&#39;amidon, β-galactosides, la thréonine, l&#39;uracile, le glutamate et le saccharose, respectivement) 11-13. Bien que l&#39;intégration de ces gènes ont été utilisés de manière fiable pendant de nombreuses années à B. subtilis (en particulier au amyE et lacA), la même connaissance peut ne pas être disponible pour des gènes dans de nombreuses autres espèces bactériennes. L&#39;utilisation de sites de fixation du phage sont une bonne alternative pour les sites d&#39;intégration chromosomiques neutres: de nombreuses spécifiques à l&#39;espèce 14 à 16, ainsi que les sites d&#39;intégration généraux, tels que le site de fixation de Tn7 (att) ont Tn7été identifié et utilisé pour les insertions de gènes chez de nombreuses espèces bactériennes 17,18. Microbes de l&#39;environnement Nous utilisons le sol comme une source directe des microbes de l&#39;environnement pour l&#39;écran de co-culture. Le sol contient une grande diversité de microbes, et bon nombre de ces organismes sont riche source de produits naturels. En utilisant des suspensions liquides de sol placés directement sur des plaques avec notre souche rapporteur transcriptionnel fluorescente (sans isolement préalable des bactéries du sol), nous simplifions grandement l&#39;approche expérimentale. Le sol peut être utilisé soit immédiatement après la récolte, ou être congelé à -80 ° C pour une utilisation future. Utilisation immédiate a l&#39;avantage une plus grande diversité de microbes peut potentiellement être cultivé, y compris ceux qui ne survivra pas bien la congélation. Il présente l&#39;inconvénient que la concentration des organismes du sol cultivable partir de ces échantillons est inconnue, ce qui augmente le nombre de plaques d&#39;écran qui doit être utilisé. Delayed utilisation présente l&#39;avantage que les cfu / ml pour chaque source dans le sol peuvent être déterminés à l&#39;avance, ce qui permet un certain nombre de colonies optimisé pour être cultivée sur chaque plaque d&#39;écran. Cependant, elle nécessite que les organismes du sol soient capables de survivre à la congélation. Notez que la diversification de la piscine de l&#39;inducteur en cours d&#39;examen (c&#39;est à dire les sources de sol) semble être plus efficace dans l&#39;identification de nouveaux interspécifiques interactions que le dépistage en profondeur sur le même sol: une plus grande diversité phylogénétique a été observée dans les résultats identifiés dans notre écran matrice induction sources de sol supplémentaires ont été examinées plutôt que le dépistage des mêmes sources plus approfondie du sol (EA queue et R. Kolter, Harvard Medical School, résultats non publiés). Vue d&#39;ensemble L&#39;approche que nous décrivons ici est simple en termes de ses exigences techniques. Il s&#39;agit de: 1) la construction d&#39;une transcription rapporteur fluorescent dans B. subtilis ou uned&#39;autres espèces bactériennes d&#39;intérêt, 2) l&#39;identification des conditions dans lesquelles cette rapporteur n&#39;est pas activé, 3) la préparation d&#39;aliquotes de cette souche rapporteuse et les organismes à cribler (dans notre sol de cas, mais d&#39;autres sources peuvent être utilisées à la place), 4) le mélange de ceux-ci deux ensembles de microbes sur des milieux solides, 5) l&#39;identification et l&#39;isolement des organismes induisant putatif, et 6) qui confirme que ces micro-organismes ne activent en effet ce phénotype dans un écran secondaire. Une fois identifiés, ces organismes et de leurs métabolites nous fournissent des outils chimiques pour moduler le comportement des bactéries, pour étudier la physiologie bactérienne et interactions microbiennes, et d&#39;agir éventuellement en tant que nouveaux échafaudages pour des composés thérapeutiques futures.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth, Lennox</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80017-484</td>
			<td>Alternative media sources may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 3 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26396-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading tips, round</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59060-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions

Dans la nature, les bactéries existent rarement dans l&#39;isolement, ils sont plutôt entourés d&#39;un large éventail d&#39;autres micro-organismes qui modifient l&#39;environnement local en sécrétant des métabolites. Ces métabolites ont le potentiel de moduler la physiologie et la différenciation de leurs voisins et microbiennes sont des facteurs susceptibles importants dans la création et le maintien de communautés microbiennes complexes. Nous avons développé un écran de co-culture à base de fluorescence pour identifier ces interactions microbiennes médiées par voie chimique. L&#39;écran consiste à combiner une souche rapporteur de transcription fluorescent avec des microbes de l&#39;environnement sur milieux solides et en permettant aux colonies de se développer en co-culture. Le rapporteur transcriptionnel fluorescent est conçu de telle sorte que la souche bactérienne choisie est fluorescent lorsqu&#39;il exprime un phénotype particulier d&#39;intérêt (à savoir la formation de biofilms, la sporulation, la production de facteurs de virulence, etc.) Le criblage est réalisée dans des conditions de croissance WHEre ce phénotype n&#39;est pas exprimé (et donc de la souche rapporteuse est typiquement non-fluorescent). Quand un microbe environnement sécrète un métabolite qui active ce phénotype, il diffuse à travers l&#39;agar-agar et active la construction de rapporteur fluorescent. Cela permet au-métabolite produisant induire microbe devant être détectée: ce sont les colonies non fluorescentes plus proximales des colonies fluorescentes. Ainsi, cet écran permet l&#39;identification des microbes de l&#39;environnement qui produisent des métabolites diffusibles qui activent une réponse physiologique particulier dans une souche de journaliste. Cette publication explique comment: a) sélectionner des conditions de dépistage de co-culture appropriées, b) préparer le journaliste et les microbes de l&#39;environnement pour le dépistage, c) effectuer l&#39;écran de co-culture, d) isoler putatif organismes induisant, et e) de confirmer leur activité dans un écran secondaire. Nous avons développé cette méthode pour dépister les organismes du sol qui activent biofilm matrice-production dans Bacillus subtilis </em&gt;, mais nous discutons aussi de considérations pour l&#39;application de cette approche à d&#39;autres bactéries génétiquement dociles.

Cet écran est utilisé pour identifier les organismes du sol sécrétant des composés qui modifient la physiologie de B. subtilis. Les résultats décrits ici sont axées sur le type de cellule-matrice produisant de B. subtilis, qui produit la protéine et des exopolysaccharides qui sont nécessaires pour la formation de biofilm robuste dans cette bactérie. Nous avons choisi le promoteur de l&#39;opéron Tapa-sipW-tasa pour notre construction rapporteur fluorescent (P Tapa-YFP).</e...

Watch this Scientific Journal Video about Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions at JoVE.com

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Les bactéries produisent des composés sécrétés qui ont le potentiel d&#39;affecter la physiologie de leurs voisins microbiennes. Nous décrivons ici un écran de co-culture qui permet la détection de ces médiation chimiquement interspécifiques interactions en mélangeant les microbes du sol avec des souches rapporteurs fluorescents transcription de Bacillus subtilis sur milieu solide.

Utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

using-coculture-to-detect-chemically-mediated-interspecies

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K vues.  University of North Carolina at Chapel Hill.  Les bactéries produisent des composés sécrétés qui ont le potentiel d'affecter la physiologie de leurs voisins microbiennes. Nous décrivons ici un écran de co-culture qui permet la détection de ces médiation chimiquement interspécifiques interactions en mélangeant les microbes du sol avec des souches rapporteurs fluorescents transcription de Bacillus subtilis sur milieu solide. 

Vidéo: Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidiques Co-culture de cellules épithéliales et des bactéries d&#39;enquête sur les Soluble signal médiée par des interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Recherche

Biologie

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analyse de Schwann-astrocytes interactions à l&#39;aide In Vitro Tests

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l&#39;EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Synthèse rapide et le dépistage de facteurs de transcription activés chimiquement avec Reporters base GFP

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Détermination des interactions protéine-ligand à l&#39;aide différentielle à balayage Fluorimétrie

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Utilisation de Caenorhabditis elegans pour dépister les interactions tissulaires spécifiques des chaperons

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using scanning transmission electron microscopy (STEM). Cells of the mammalian breast cancer cell line SKBR3 were grown on silicon microchips with silicon nitride (SiN) windows. Cells were chemically fixed, and HER2 proteins were labeled with quantum dot nanoparticles (QDs), using a two-step biotin-streptavidin binding protocol. The cells were coated with multilayer graphene to maintain a hydrated state, and to protect them from electron beam damage during STEM. To examine the stability of the samples under electron beam irradiation, a dose series experiment was performed. Graphene-coated and non-coated samples were compared. Beam induced damage, in the form of bright artifacts, appeared for some non-coated samples at increased electron dose D, while no artifacts appeared on coated samples.

Presented here is a protocol for labeling membrane proteins in mammalian cells and coating the sample with graphene for liquid-phase scanning transmission electron microscopy. The stability of the samples against the damage caused by radiation can also studied with this protocol.

Enclos de graphène de cellules de mammifères chimiquement fixes pour microscopie électronique en phase liquide

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Méthodes de culture pour étudier les interactions spécifiques aux apicales à l’aide de modèles organoïdes intestinaux

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Bioinformatics Resources for the Study of Glycan-Mediated Protein Interactions

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In particular, it aims at highlighting interactions between glycoproteins (such as cell surface receptors) and carbohydrate-binding proteins mediated by glycans. Here, major resources of the collection are introduced through two illustrative examples centered on the N-glycome of the human Prostate Specific Antigen (PSA) and the O-glycome of human serum proteins. Through different database queries and with the help of visualization tools, this article shows how to explore and compare content in a continuum to gather and correlate otherwise scattered pieces of information. Collected data are destined to feed more elaborate scenarios of glycan function. Glycoinformatics introduced here is, therefore, proposed as a means to either strengthen, shape, or refute assumptions on the specificity of a protein glycome in a given context.

This protocol illustrates how to explore, compare, and interpret human protein glycomes with online resources.

Ressources bioinformatiques pour l’étude des interactions protéiques médiées par le glycane

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In ...