Notre protocole fournit une méthode à haut débit pour le criblage d’un grand nombre d’interactions microbiennes paires en tandem pour identifier les interactions d’intérêt qui peuvent aider la recherche sur le microbiome et la découverte d’antimicrobiens. Cette méthode s’applique facilement à l’étude des interactions microbiennes dans une variété de systèmes, tant que les micro-organismes sont aimables à la culture dans des conditions de laboratoire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux utilisateurs de filtrer un grand nombre d’interactions microbiennes dans un laps de temps relativement court.
Les nouveaux utilisateurs de cette technique devraient prendre du temps, surtout lors de l’inocculation des plaques de bioassay, car il est crucial de faire attention à minimiser la surcroissance ou la contamination. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car l’inocculation des plaques de bioassay exige de la précision pour s’assurer que les organismes ne surcroquent pas les puits et que les co-cultures ne sont pas contaminées. Commencez par préparer des cultures du jour au lendemain.
Utilisez une pipette sérologique pour ajouter trois millilitres de bouillon BHI dans des tubes de culture de 14 millilitres. Ensuite, utilisez une boucle stérile d’inoculation de microlitres pour inoculer une colonie bactérienne dans le bouillon. Faites tourbillonner la boucle pour vous assurer que l’agglutiné se disperse dans le bouillon.
Vortex brièvement les tubes de culture, et les incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius sur un shaker à 250 RPM. Une fois que les cultures bactériennes atteignent un OD 600 au-dessus d’un, vortex pour briser les touffes de cellules. Préparez les supports PHI avec 1,5% d’agar, et stérilisez-le en l’autoclavant.
Ensuite, refroidissez le média à 55 degrés Celsius dans un bain d’eau à température contrôlée, et distribuez trois millilitres de supports BHI fondus dans chacun des 12 puits d’une plaque, en veillant à ce que les puits soient aussi même que possible. Ensuite, laissez l’agar se fixer pendant la nuit. Inoculer l’organisme d’essai sur une plaque de bioassay en insérant une boucle stérile d’inoculation de 10 microlitres dans la culture nocturne, et en striant la gouttelette de culture sur le tiers gauche d’un puits de plaque.
Répéter jusqu’à ce que les 12 puits de la plaque aient été inoculés. Incuber les assiettes à l’envers à la température appropriée pendant sept jours. Si vous couvez à des températures supérieures ou égales à 37 degrés Celsius, ou dans des climats plus secs, conservez les plaques dans un récipient humide pour les empêcher de se dessécher.
Après l’incubation de six jours de la plaque de bioassay, préparez les cultures du jour au lendemain de l’organisme cible comme décrit précédemment. Préparez la plaque cible en remplissant chaque puits d’une plaque vide de 12 puits avec 1,8 millilitres de BHI et 200 microlitres de la culture cible pendant la nuit. Placez un timbre d’inoculation stérile dans la plaque cible.
Faites tourbillonner doucement les cultures autour des puits, en veillant à ce qu’elles ne contaminent pas les puits voisins. Soulevez le timbre d’inoculation et assurez-vous qu’il y a une gouttelette de culture cible diluée sur chaque pointe de timbre. Placez le timbre d’inoculation sur une plaque de bioassay non ininoculée et secouez doucement le timbre de sorte que la gouttelette de culture inocule chaque puits.
Une fois le timbre enlevé, une gouttelette de culture doit être visible dans les puits. Si des puits ne sont pas inoculés avec le timbre d’inoculation, placez trois microlitres de culture diluée pendant la nuit sur les puits à l’aide d’une pipette. Ensuite, inoculer les plaques de bioassay comme décrit précédemment, mais aligner les pointes de timbre avec le côté droit de la plaque de 12 puits, en veillant à ce que le timbre ne communique pas avec la colonie bactérienne existante.
Retirez soigneusement le timbre et placez-le de nouveau dans la plaque cible. Si l’agar s’est solidifié dans les puits de façon inégale, secouez doucement le timbre d’avant en arrière, mais veillez à ne pas déplacer le timbre dans la croissance de l’organisme d’essai. Répétez l’inoculation de chaque plaque de bioassay jusqu’à ce que toutes les plaques soient inoculées, puis incubez les plaques à l’envers à la température appropriée pendant sept jours.
Après avoir co-culture de l’organisme cible pendant une semaine, marquer les interactions en fonction de l’évaluation visuelle. Marquer les puits avec la croissance de l’organisme cible qui montre une croissance indiscernable de la monoculture comme zéro. Marquer les puits avec une croissance diminuée comme un seul, et pas de croissance comme deux.
Les analyses de co-culture décrites ici ont été utilisées pour évaluer l’activité inhibitrice des organismes d’essai d’actinobactéries vers les organismes cibles d’espèces de staphylocoques isolés de la cavité nasale humaine. Un total de 812 combinaisons paires ont été testées. Notamment, corynebacterium propinquum fortement inhibé staphylocoques négatifs coagulase, en particulier par rapport à d’autres Corynebacteria qui soit faiblement inhibé staphylococci négatif coagulase ou n’a eu aucun effet inhibiteur.
Grâce à l’utilisation de la génomique comparative, un groupe de gènes biosynthétiques pour la production de siderophore a été identifié dans le génome de Corynebacterium propinquum. Les analyses d’interaction de co-culture utilisant le milieu standard et fer-complété de BHI ont déterminé que le phénotype d’inhibition entre corynebacterium propinquum et staphylococci négatif de coagulase était en fait fer-dépendant. Il est important d’être prudent lors de l’embouteillement de la plaque.
Vérifiez chaque puits après l’estampage et assurez-vous que le timbre d’inoculation est aligné correctement pour éviter la contamination. Après avoir identifié les interactions d’intérêt, des études subséquentes utilisant la génétique microbienne et la génomique, l’isolement et la caractérisation des produits naturels, ou la spectrométrie de masse d’imagerie peuvent être utilisées pour caractériser les mécanismes sous-jacents à ces interactions. Ce protocole a récemment été utilisé pour découvrir la concurrence siderophore- médiatisée entre le microbiote nasal humain, et a aidé à la découverte d’une nouvelle molécule antifongique appelée cyphomycine.
