Nous remercions Angela Kralemann-Köhler pour un excellent soutien technique. Le travail expérimental décrit ici a été réalisée dans notre laboratoire et a été soutenu par des subventions du Conseil de recherches en allemand (DFG) à CK et BK et une subvention du ministère allemand de la Recherche et de l&#39;Education (BMBF) à BK.

Déclaration éthique Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les règlements de la commission des animaux et l&#39;utilisation des soins gouvernementale, LANUV de l&#39;état Rhénanie du Nord-Westphalie (Düsseldorf, Allemagne). Toutes les expériences animales ont été approuvés par LANUV, Düsseldorf sous le numéro de licence 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance et le nombre d&#39;animaux requis pour l&#39;étude. Une. Protection des animaux et du Logement <ol><li> Tous les animaux utilisés dans les protocoles décrits ici doivent être conservés dans des conditions exemptes d&#39;organismes pathogènes spécifiques, tels que définis par l&#39;Association Fédération européenne des sciences des animaux de laboratoire (FELASA). </li><li> Souris doivent être gardés dans des cages standard pour une température et à l&#39;humidité contrôlée (22 ° C) dans des conditions diurnes chambre (12 h cycle lumière / obscurité) avec filtre HEPA air. </li><li> Aliment normalisé et l&#39;eau doivent être fournis ad libitum. &lt;/ Li&gt; <li> Si IkB / tTA et IkB / - souris de contrôle sont utilisés, le génotypage par PCR devrait être effectué pour chaque animal, tel que décrit dans 7, 18. </li><li> Les mâles avec une différence d&#39;âge de moins de quatre jours devraient à être utilisés pour réduire la variabilité individuelle. </li><li> (OPTION): Pour NF-kB expériences de réactivation, la doxycycline doit être administré dans l&#39;eau potable (2 mg / ml avec 2,5% de saccharose) pendant au moins 14 jours. </li></ol> 2. Motif spatiale séparation-Barnes Maze (SPS-BM) <ol><li> Tous les tests de comportement doit être effectuée conformément aux directives internationales et locales. </li><li> IMPORTANT! Utilisez uniquement des souris mâles avec un âge de six mois ou plus. La différence d&#39;âge entre les animaux d&#39;une série d&#39;essais doit être inférieur à quatre jours. Le test doit être effectué par le même opérateur, pour chaque série. La souris devrait recevoir une alimentation standard avant l&#39;épreuve d&#39;augmenter encore la motivation partiellement entraîné par commeweet récompense alimentaire. </li><li> Mettre en place une plaque blanche circulaire réalisée à partir de plastique dur (diamètre de 120 cm, voir Figure 5A) dans une et à l&#39;humidité ambiante à température contrôlée (22 ° C), éclairé par au moins 4 x 80 W et 3 x 215 lampes fluorescentes W néon . IMPORTANT! Assurer l&#39;éclairage correct est utilisé, comme la motivation des souris pour entrer dans les maisons des aliments est partiellement entraîné par leur aversion pour les endroits lumineux, exposés. </li><li> Mettre en place le système de vidéo-tracking. L&#39;appareil doit être placé 115 cm au-dessus du centre de la plaque (voir figure 5A). </li><li> Fixez multicolores indices extra-labyrinthe (CEM) à un tissu de couleur blanche dans des positions bien visibles pour les animaux, environ 100 cm de la frontière de la plaque (voir figure 5A). </li><li> Nettoyez soigneusement la plaque avec un désinfectant rapide qui peut éliminer toute odeur de l&#39;expérimental. </li><li> Placez sept maisons identiques jaune alimentaires (12 cm x 7 cm x 8 cm, voir la figure 5A </strong&gt;) sur la plaque blanche. Les positions doivent être sans équivoque marqués (voir figure 5A). </li><li> Placez douces récompenses à granulés de nourriture (un trimestre d&#39;une maison de boucle de Froot / alimentaire de l `Kellogs) à l&#39;intérieur toutes les maisons de nourriture sur des positions définies (voir figure 5A) avec une seule maison de la nourriture défini étant librement accessible à l&#39;animal (lieu F, voir la figure 5A ). Fermer les maisons alimentaires non ciblés avec une feuille transparente. </li><li> Avant l&#39;essai, effectuer accoutumance (un jour avant de commencer la tâche). Faire toutes les maisons alimentaires librement accessibles et permettent aux souris pour explorer le labyrinthe librement et de récupérer une récompense de boulette de nourriture (10 min / animal). </li><li> Mettez l&#39;ordinateur et l&#39;appareil photo et lancer le logiciel de système de vidéo-tracking. </li><li> Commencer l&#39;enregistrement. </li><li> Placez l&#39;animal au point de départ défini sur la plaque circulaire (figure 5A, S: position de départ) et de permettre aux souris de rechercher la maison de la nourriture cible pendant 10 min. </li><li> Stop la vidéo de suivi. </li><li> IMPORTANT! Nettoyez la plaque circulaire et les maisons de nourriture après chaque essai avec un désinfectant rapide. </li><li> Répétez le test par jour pendant sept jours consécutifs (pour chaque animal). </li><li> Analyser les résultats (temps de latence, la distance parcourue et erreurs) en utilisant un logiciel de statistiques appropriées. Définir des erreurs que l&#39;on approche de la maison et / ou contact avec la boîte appropriée sans entrer et récupérer la récompense de boulette de nourriture aliments mal. Pour une analyse groupée utiliser deux ANOVA avec test de Bonferroni post-hoc. </li><li> (OPTION) Sacrifiez les souris et analyser l&#39;hippocampe comme décrit ci-dessous. </li></ol> 3. BrdU Labeling <ol><li> Injecter par voie intrapéritonéale de 50 mg / kg ip BrdU une fois par jour pendant 3 jours (analyse de la différenciation et l&#39;intégration) ou 200 mg / kg ip pour une seule injection (analyse de la prolifération). </li><li> Sacrifier les animaux, disséquer l&#39;hippocampe et préparer 40 sections um comme décrit ci-dessous. </li><li> Dénaturer l&#39;des sections avec du HCl 2 M pendant 10 min et incuber dans 0,1 M de tampon de borate pendant 10 min. </li><li> Étiqueter une série unique en douze sections um 40 (240 um d&#39;intervalle) de chaque animal par immunohistochimie, comme décrit ci-dessous en utilisant des anticorps dirigés contre BrdU. </li><li> Quantifier les cellules marquées par une analyse par microscopie confocale dans toute la mesure rostrocaudal de la couche de cellules granulaires et la zone sous-granulaire. Multiplier les chiffres obtenus par 12 pour obtenir le nombre total estimé de cellules marquées à la BrdU par l&#39;hippocampe et diviser par deux pour obtenir le nombre total de cellules marquées par la DG. </li></ol> 4. Retrait des cerveaux et préparation de cryosections de non perfusés Animaux <ol><li> Respecter les procédures approuvées localement pour euthanasier les animaux. Les souris peuvent être directement euthanasiés par luxation du rachis cervical. </li><li> (Facultatif) Les animaux peuvent être anesthésiés avant l&#39;euthanasie conformément aux directives locales et internationales, par exemple en Inje intrapéritonéalection de 0,8 ml Avertin pour 33 g de souris (fraîchement préparé en mélangeant 150 ml de solution d&#39;achat d&#39;actions en 2,2 mg 2,2,2-tribromoéthanol dans 1 ml d&#39;isoamyle éthanol avec 1,85 ml d&#39;une solution saline ou un tampon physiologique). </li><li> Stériliser la tête à la Bétadine (10% de povidone-iode)-gaze imbibée et écouvillon ensuite avec de la gaze trempé dans 70% d&#39;éthanol. </li><li> Décapiter l&#39;animal à l&#39;aide des ciseaux chirurgicaux appropriés et tirer la peau de côté. </li><li> (Facultatif) fixateurs peuvent être appliquées pour éviter repliement de la peau retardée. </li><li> Faire une incision médiane dans le crâne et tirez délicatement les fragments de crâne de côté. </li><li> Retirez délicatement l&#39;ensemble du cerveau à l&#39;aide d&#39;un instrument chirurgical approprié (par exemple la Moria cuillère). </li><li> Pré-refroidissement 25 ml de 2-méthylbutane dans un bécher de 50 (par exemple Schott Duran) à -30 à -40 ° C sur de la glace sèche. Remarque: Pour la coloration flottant de sections «épais» qui sont parfaitement adaptés pour la microscopie confocale à balayage laser, retirez cerveau, laver 3fois dans du tampon et stocker à 4 ° C dans un tampon phosphate la solution de saccharose à 30% dans 50 ml tube jusqu&#39;à ce que le cerveau a coulé vers le bas vers le bas (typiquement durant la nuit). </li><li> Placez délicatement le cerveau sur un morceau de Nescofilm (Parafilm) et couvrir avec un grand quantité de composé TissueTek PTOM geler sur Nescofilm en 2-méthylbutane, conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. Remarque: Pour un entreposage de longue date à -20 ° C magasin dans 9% de saccharose, 7 mM de MgCl2, 50 mM de tampon phosphate, 44% de glycérol. </li><li> Couper le cerveau en 10-12 sections um d&#39;épaisseur sur cryomicrotome approprié. Remarque: Pour les sections flottantes épaisses, geler cerveau sur cryotome stade de cryotome approprié (par exemple Reichert Jung, Frigomobil.) Et couper 40 um sections horizontales de -20 ° à - 25 ° C. Recueillir sections de couteau avec une brosse fine et collecter dans un tampon ou de garder dans une solution de stockage (étape 4.9) à -20 ° C pour le stockage à long terme. </li><li> Monter soigneusement deux tranches sur des lames de microscope simples. Le nouse de diapositives Superfrost Ultraplus est fortement recommandée afin de maximiser l&#39;adhérence des sections. </li><li> Sécher les lames pendant 5 min à température ambiante. Lames peuvent être stockées à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 5. Préparation des sections de perfusé Animaux <ol><li> Anesthésier les animaux décrits ci-dessus (étape 4.2). </li><li> Perfuser soigneusement l&#39;animal transcardiaque avec du tampon phosphate salin (PBS) contenant de l&#39;héparine (0,025 g/100 ml de PBS) et la procaine (0,5 g/100 ml de PBS) pendant 2 à 4 min, suivi par du paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 10 à 15 min . La perfusion est réalisée de façon optimale par perfusion via le ventricule gauche et l&#39;orifice de l&#39;oreillette droite en utilisant une pression hydrostatique de l&#39;ordre de 1.2 à 1.4 m ou en utilisant une pompe péristaltique fixé à environ 15 ml / min. Résultats de la perfusion optimales dans un cerveau blanc pâle avec pas de vaisseaux sanguins rouges sont visibles. </li><li> Disséquer et post-fixer le cerveau dans du paraformaldéhyde 4% à 4 ° C pendant 24 heures. </li><li> Cryoprotéger le cerveau en saccharose à 30% dans du PBS à 4 ° C pendant au moins 24 h. </li><li> Geler le cerveau sur la scène cryotome. </li><li> Préparer 40 um sections horizontales de forebrains entiers en utilisant un cryotome approprié. </li><li> Les lames peuvent être stockées dans une solution de cryoprotecteur (0,1 M de tampon phosphate, 50% de glycerol, 0,14% de MgCl2, 8,6% de saccharose) à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 6. Immunohistochimie de cerveau Sections de non perfusés Animaux <ol><li> Post-fixer les coupes cryogéniques, préparés comme décrit ci-dessus, en utilisant du méthanol à -20 ° C pendant 10 minutes à froid. </li><li> Bloquer avec 5% de sérum normal contenant 0,3% de Triton-X (à partir de l&#39;espèce qui a été utilisé pour élever l&#39;anticorps secondaire) pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Rincer 3 fois avec PBS 1x et incuber avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Rincer 3 fois avec PBS 1x et incuber avec des anticorps secondaires à température ambiante pendant une heure. </li><li> Rincer 3 fois avec PBS 1x </li><li> Counterstain la section de l&#39;ADN en utilisant vert SYTOX, ou DAPI (ou un colorant de l&#39;ADN de remplacement). </li><li> Rincer 3 fois avec PBS 1x </li><li> Incluez les sections dans un milieu aqueux intégration. </li><li> Que le milieu d&#39;inclusion polymériser pendant au moins 48 heures. </li></ol> 7. Immunohistochimie de cerveau articles de perfusé Animaux <ol><li> Bloc tel que décrit dans l&#39;étape 6.2 et incuber les coupes de cerveau fixées dans une solution d&#39;anticorps primaire dilué dans du PBS contenant 0,3% de Triton-X (flottant) pendant une nuit à 4 ° C par la suite </li><li> Rincer trois fois avec PBS 1x et incuber dans une solution d&#39;anticorps secondaire dilué dans du PBS contenant 0,3% de Triton-X (flottant librement) à la température ambiante pendant 3 heures. </li><li> Rincer 3 fois avec PBS 1x </li><li> Contre-colorer la section de l&#39;ADN en utilisant SYTOX vert ou DAPI (ou un colorant de l&#39;ADN de remplacement). </li><li> Rincer trois fois avec PBS 1x </li><li> Incluez les sections dans un milieu aqueux intégration. </li><li> Que le milieu d&#39;inclusion polymériser pour unt moins 48 heures. </li></ol> 8. Enquête sur les projections Mossy fibre <ol><li> Sacrifier les animaux, préparer 40 um coupes coronales comme décrit ci-dessus et tacher la section de l&#39;hippocampe en utilisant un anticorps pour neurofilaments M. </li><li> Parcourez les sections à la longueur d&#39;onde appropriée à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal à balayage laser microscope pour visualiser les fibres moussues et les noyaux. Démarrez le balayage à faible grossissement. </li><li> Utilisez les images à faible grossissement d&#39;orientation et de cibler l&#39;hippocampe avec des projections de fibres moussues. </li><li> Parcourez les sections (z) sectionnement à haute résolution et fort grossissement. </li><li> Analyser l&#39;aspect morphologique et la connectivité des fibres moussues visualisées par coloration de NF-M. </li><li> (OPTION) Analyser la taille et le volume de l&#39;hippocampe lames. Utiliser le signal d&#39;ADN pour les mesures. </li></ol> 9. Fluoro-Jade C Assay (mort cellulaire neuronale) <ol><li> Sacrifier les animaux, disséquer le hippocAmpus, et préparer 12 sections um comme décrit ci-dessus. </li><li> Laissez les sections sécher pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Fixer les sections à 4% de PFA pendant 40 min à température ambiante. </li><li> Laver rapidement les sections 3x avec le trou DDH 2 O. </li><li> Incuber les sections avec 0,06% de permanganate de potassium (KMnO 4) pendant 10 min sous continu, agitant doucement. </li><li> Lavez les sections 3x avec le trou DDH 2 O. </li><li> Incuber les sections avec une solution C Fluoro-Jade 0,002% pendant 20 min à température ambiante. </li><li> (En option) pour colorations nucléaires simultanées, solution 0,002% Fluoro-Jade C peut être complétée avec 10 pg / ml DAPI. </li><li> Laver rapidement les sections 3x avec le trou DDH 2 O. </li><li> Laissez les sections sécher pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Incuber les sections avec du xylene (1 min) </li><li> Montez les sections en utilisant un milieu de montage à base de xylène (DPX). </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont pas de conflit d&#39;intérêt.

Neurogenèse adulte, et la possibilité de sa manipulation par l&#39;inhibition de NF-kB dans les neurones, et sa réactivation plus tard par la doxycycline, propose un système fascinant pour les enquêtes sur les nouveaux neurones dans le cerveau adulte, ainsi que dans des neurones de-et re-génération . La beauté de ce système est que le NF-kB voie de signalisation inhibition des neurones non seulement entraîne des changements dans la mort des cellules neuronales, la prolifération des progéniteurs et la migrati...

Ontologiquement, l&#39;hippocampe est l&#39;une des plus anciennes structures cérébrales anatomiques connues. Il est responsable de diverses tâches complexes, telles que les fonctions pivots dans la régulation de la mémoire à long terme, l&#39;orientation spatiale, et la formation et la consolidation de la mémoire respective. Anatomiquement, l&#39;hippocampe est constitué de couches de cellules pyramidales (stratum pyramidale), y compris la corne d&#39;Ammon (CA1, CA2, CA3 et CA4) régions et le gyrus denté (gyrus dentatus), qui contient des cellules granulaires et quelques progéniteurs neuronaux dans sa zone sous-granulaire . Les cellules granulaires projettent vers la région CA3 via les fibres moussues dits (axones des cellules granulaires). Jusqu&#39;à la fin du siècle dernier, le cerveau des mammifères adultes a été considéré comme un organe statique manque plasticité cellulaire et la neurogenèse. Cependant, au cours des deux dernières décennies, un nombre croissant de preuves démontre clairement la neurogenèse adulte qui aura lieu dans au moinsdeux régions du cerveau, la zone sous-ventriculaire (SVZ) et la zone sous-granulaire de l&#39;hippocampe. Nos études antérieures, et ceux d&#39;autres groupes, ont montré que le facteur de transcription NF-kB est un des régulateurs moléculaires essentiels de la neurogenèse adulte, et que ses résultats de-régulation dans de graves anomalies de l&#39;hippocampe structurelles et des déficiences cognitives 1-6. NF-kB est le nom générique d&#39;un facteur de transcription inductible composé de différentes combinaisons dimères de cinq sous-unités de liaison à l&#39;ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, et p65 (RelA), les trois derniers qui ont des domaines de transactivation. Dans le cerveau, la forme la plus abondant trouvé dans le cytoplasme est un hétérodimère de p50 et p65, qui est maintenu sous une forme inactive par inhibiteur de kappa B (IkB)-protéines. D&#39;étudier et de manipuler directement la neurogenèse NF-kB-entraîné, nous utilisons des modèles de souris transgéniques pour permettre simples inhibition de tous les subun NF-kBson, en particulier dans le cerveau antérieur 7 (voir la figure 1). À cette fin, nous Croisé les lignées de souris transgéniques suivantes, IKB / - et -/tTA. Le IKB transgénique / - ligne a été généré en utilisant un mutant négatif trans-dominant de NF-kB inhibiteur IκBa (super-répresseur IκBa-AA1) 8. Contrairement à la IKBa de type sauvage, IKBa-AA1 a deux des résidus de sérine mutés en alanines (V32 et V36), qui empêchent la phosphorylation et la dégradation par le protéasome ultérieure de l&#39;inhibiteur. Pour cerveau antérieur expression spécifique des neurones de la IκBa-AA1-transgène, IkB / - souris ont été croisées avec des souris hébergeant une kinase calcium-calmoduline-dépendante IIa (CAMKIIα)-promoteur qui peut être entraîné par trans-activateur tétracycline (TTA) 9. souris knock-out p65 ont un phénotype létal embryonnaire, en raison de l&#39;apoptose massif du foie 10, si l&#39;approche présentée ici fournit une méthode éléganted&#39;enquêter sur le rôle de NF-kB dans postnatale et la neurogenèse adulte. Le test de comportement classique pour étudier l&#39;apprentissage spatial et la mémoire a été décrit dans les années 1980 par Richard Morris, un test connu sous le nom d&#39;eau de Morris (MWM) 11. Dans ce champ ouvert eau-labyrinthe, les animaux apprennent à sortir de l&#39;eau opaque sur une plate-forme cachée fondée sur l&#39;orientation et extra-labyrinthe repères. Une variante sec de MWM est le labyrinthe Barnes dite (BM) 12. Ce test utilise une plaque circulaire de 20 trous circulaires disposés à la frontière d&#39;une plaque, avec un trou défini comme une boîte d&#39;échappement, et des repères visuels extra-labyrinthe d&#39;orientation. Les deux paradigmes expérimentaux reposent sur le comportement de vol induite par un rongeur de l `aversion pour l&#39;eau, ou des espaces ouverts, illuminées. Les deux tests permettent une enquête de l&#39;orientation spatiale, et la performance de mémoire liée. Bien que l&#39;hippocampe joue un rôle essentiel et en général la formation de la mémoire spatiale, l&#39;hippocampe rÉGIONS impliqués diffèrent selon le critère appliqué. La mémoire testé en BM découle de l&#39;activité neuronale entre le cortex enthorinal (CE) et les neurones pyramidaux situés dans la région CA1-de l&#39;hippocampe sans contribution de la DG 13-16. En particulier, la BM classique repose principalement sur ​​la navigation par la voie temporo-ammonique monosynaptic de CE III CA1 à CE V. Surtout, la DG est cruciale impliquée dans la configuration dite reconnaissance spatiale 17, ce qui implique non seulement le traitement des l&#39;information visuelle et spatiale, mais aussi la transformation des représentations ou des souvenirs similaires dans différents, les représentations ne se chevauchent pas. Cette tâche requiert un circuit tri-synaptique fonctionnelle du CE II DG de CA3 de CA1 et CE VI, qui ne peuvent être testés dans le BM 15. Pour relever ces défis, nous avons conçu SPS-BM comme un test de comportement pour tester spécifiquement denté performances cognitives gyrus dépendant en coanimaux ntrol, et dans le modèle super-répresseur IKB / TTA suite à l&#39;inhibition de NF-kB. Néanmoins, contrairement à la MWM ou la BM, le SPS-BM peut révéler des déficits comportementaux subtils résultant de la dépréciation de la neurogenèse. Depuis spatiale motif de séparation est strictement dépendante d&#39;un circuit fonctionnel entre la CE II et la DG et CA3 et CA1 et CE VI, ce test est très sensible aux changements potentiels dans la neurogénèse, les modifications de la voie des fibres moussues ou altérations de l&#39;homéostasie tissulaire au sein de la DG. Techniquement, la mise en place de notre test est basé sur l&#39;étude de Clelland et al., Dans lequel le motif de la séparation spatiale a été testé en utilisant un bois 8-bras bras labyrinthe radial (RAM) 19. Dans notre set-up modifié, les huit bras ont été remplacés par sept maisons jaunes alimentaires identiques. En résumé, les méthodes présentées ici, y compris l&#39;analyse de (DCX +) des cellules de doublecortine exprimant dans l&#39;hippocampe, les projections de fibres moussues, neuronale cellule death et en particulier le SPS-BM présenté ici, peut être appliquée à des enquêtes sur d&#39;autres modèles de souris comportant des transgènes qui ont un impact sur la neurogenèse adulte. D&#39;autres applications peuvent inclure l&#39;étude des agents pharmacologiques et mesurer leur impact sur le modèle de séparation DG et spatiale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Moria MC17 Perforated Spoon&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td style="width:132px;">10370-18</td>
			<td style="width:167px;">removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi SV8</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>14381-43</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">SuperFrost Slides</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td align="right">1879</td>
			<td>slides for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">TissueTek OCT compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:132px;">1004200018</td>
			<td>embedding of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">005-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">Normal Rabbit Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">011-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">017-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Neurofilament-M antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>2H3</td>
			<td>IHC, Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-doublecortin&#160;antibody</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>IHC, Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">anti-GFP antibody</td>
			<td>ab290</td>
			<td>abcam</td>
			<td>IHC, Dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">anti-BrdU antibody</td>
			<td>OBT0030G</td>
			<td>Accurate Chemicals</td>
			<td>IHC, Dilution 1:2000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Fluoro Jade-C</td>
			<td>FJ-C</td>
			<td>HistoChem</td>
			<td>Determination of neuronal cell death</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Betadine</td>
			<td style="width:127px;">&#160;MUNDIPHARMA</td>
			<td>D08AG02&#160;</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td>preparation of brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">H3393</td>
			<td>perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)</td>
			<td style="width:127px;">lab made</td>
			<td style="width:132px;">none</td>
			<td>plate for SPS-BM, diameter 120cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buraton rapid disinfectant&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sch&#252;lke &#38; Mayr</td>
			<td style="width:132px;">113 911</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2</td>
			<td>tse systems</td>
			<td style="width:132px;">302050-SW-KIT</td>
			<td>tracking and analysis of SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>permeabilisation/IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">cryotome</td>
			<td style="width:127px;">Reichert&#160; Jung/Leica</td>
			<td style="width:132px;">Frigomobil 1206</td>
			<td>preparation of 40&#181;m brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth&#160;</td>
			<td>Art.-Nr. 0713</td>
			<td>embedding of the slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">SYTOX green</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Food pellets (Kellog`s Froot Loops)</td>
			<td>Kellog`s</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:447px;">Prism, Version 3.0</td>
			<td style="width:127px;">Graph Pad Software, San Diego, USA&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>Statistical evaluation of SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Zen 2008 or Zen 2011 Software</td>
			<td style="width:127px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>Software (Confocal microscope)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">D.P.X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">317616</td>
			<td>mounting medium for Fluoro Jade C staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the modulation and analysis of nf-&#954;b-dependent adult neurogenesis

L&#39;hippocampe joue un rôle essentiel dans la formation et la consolidation de la mémoire épisodique, et dans l&#39;orientation spatiale. Historiquement, l&#39;hippocampe adulte a été considérée comme une région anatomique très statique du cerveau des mammifères. Cependant, des études récentes ont démontré que le gyrus denté de l&#39;hippocampe est une zone de très grande plasticité chez les adultes, impliquant non seulement les modifications de circuits neuronaux existants, mais aussi la neurogenèse adulte. Cette plasticité est régulée par des réseaux complexes de transcription, dans lequel le facteur de transcription NF-kB joue un rôle de premier plan. Pour étudier et de manipuler la neurogenèse adulte, un modèle de souris transgénique pour l&#39;inhibition neuronale spécifique du cerveau antérieur de l&#39;activité de NF-kB peut être utilisé. Dans cette étude, des méthodes sont décrites pour l&#39;analyse de la neurogenèse NF-kB-dépendante, y compris ses aspects structuraux, et l&#39;apoptose neuronale progénitrice, la prolifération et la signification cognitive, which a été spécifiquement évaluée par un gyrus denté (la DG) dépendant test de comportement, la répartition spatiale séparation Barnes labyrinthe (SPS-BM). Le protocole SPS-BM pourrait être simplement adaptée pour une utilisation avec d&#39;autres modèles animaux transgéniques destinés à évaluer l&#39;influence de certains gènes sur la neurogenèse hippocampique adulte. En outre, SPS-BM pourrait être utilisé dans d&#39;autres contextes expérimentaux visant à étudier et manipuler l&#39;apprentissage DG-dépendante, par exemple, l&#39;utilisation d&#39;agents pharmacologiques.

Le croisement des IkB / - lignées de souris transgéniques et tTA mène à l&#39;inhibition de l&#39;activité de NF conditionnel-kB dans l&#39;hippocampe. Pour étudier l&#39;expression de la IKBa-AA1-transgène dans la double transgénique souris (figure 1A), les cerveaux ont été isolés, cryosectioned et colorées en utilisant un anticorps contre la GFP (protéine fluorescente verte). La microscopie confocale à balayage laser a révélé une forte exp...

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Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Des méthodes pour la manipulation et l&#39;analyse des NF-kB-dépendante de l&#39;hippocampe de la neurogenèse adulte sont décrits. Un protocole détaillé est présenté pour un test de comportement gyrus denté-dépendant (appelé le modèle spatial séparation Barnes labyrinthe) pour l&#39;étude des résultats cognitifs chez la souris. Cette technique devrait également aider à permettre des enquêtes dans d&#39;autres contextes expérimentaux.

Des procédés pour la modulation et de l&#39;analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

methods-for-modulation-analysis-nf-b-dependent-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

14.2K vues.  University of Bielefeld.  Des méthodes pour la manipulation et l'analyse des NF-kB-dépendante de l'hippocampe de la neurogenèse adulte sont décrits. Un protocole détaillé est présenté pour un test de comportement gyrus denté-dépendant (appelé le modèle spatial séparation Barnes labyrinthe) pour l'étude des résultats cognitifs chez la souris. Cette technique devrait également aider à permettre des enquêtes dans d'autres contextes expérimentaux. 

Vidéo: Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Moulage cérébrovasculaire de la souris adulte pour l&#39;imagerie 3D et l&#39;analyse morphologique

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Recherche

Neurosciences

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogation fonctionnelle des adultes hypothalamique neurogenèse avec Focal radiologique inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

La chaleur induite par un antigène de récupération: une méthode efficace pour détecter et identifier les types de cellules progénitrices adultes au cours de l&#39;hippocampe neurogenèse

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab blessures plaies du poisson zèbre adulte Télencéphale: Une méthode pour étudier le cerveau des vertébrés neurogenèse et régénération

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Évaluation de la neurogenèse primaire en<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryons Utilisation de immunocoloration

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analyse Synaptic Modulation de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

Le rhombencéphale de souris comme un modèle pour étudier la neurogenèse embryonnaire

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analyse métabolique des larves de Drosophila melanogaster et un cerveau adulte

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...