The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).

NOTE: Toutes les procédures impliquant des animaux vivants ont été effectuées conformément à la directive CE 86/609 / CEE des lignes directrices sur le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par le comité d&#39;éthique local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz). 1. Injection par voie intrapéritonéale analogues de la thymidine <ol><li> Peser les animaux le jour avant l&#39;injection. Calculez le montant de la thymidine analogique requise pour toutes les injections prévues le lendemain ainsi que les volumes d&#39;injection individuels poids ajusté d&#39;un / ml solution stock de 10 mg. </li><li> Préparer / ml thymidine solution mère à 10 mg. (ATTENTION! Analogues de la thymidine sont toxiques. Suivez les fiches spécifiques de données de sécurité (FDS) fournies par les fournisseurs, ce est à dire, porter une blouse de laboratoire et des gants, utiliser une hotte chimique). <ol><li> Prenez thymidine analogique du congélateur et l&#39;amener à RT, env. 21 ° C. Peser 10 mg et ajouterune solution saline stérile (pour BrdU et CldU) ou N NaOH 0,04 (dans une solution saline stérile, car UDI), vortex. Placez au moins 10 à 15 min dans un bain tourbillon et 50 ° l&#39;eau tous les 2 à 3 min pour dissoudre la poudre. REMARQUE: Utilisez des solutions pour un maximum de 24 heures se il est entreposé à température ambiante et pendant plusieurs semaines à -20 ° C. Protéger solutions de la lumière (couvrir de papier d&#39;aluminium). Toujours vérifier précipités et re-dissoudre si nécessaire. </li></ol></li><li> Retenez la souris par la peau et par voie intrapéritonéale injecter un volume approprié, ajustée au poids de la solution mère (à température ambiante) en utilisant une seringue de dosage de précision avec une aiguille 30 G. NOTE: En cas CldU et IdU doivent être administrés de façon séquentielle dans le même animal, considèrent injecter des concentrations équimolaires (par exemple, 42,5 mg / kg et 57,5 CldU mg / kg IdU, ce qui correspond à 50 mg / kg BrdU). Par conséquent, ajuster le volume d&#39;injection des solutions à 10 mg / ml actions en conséquence. </li></ol> 2. Préparation des tissus <ol><li> Prepare 4% de formaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate pH 7,4 le jour avant la perfusion. Conserver à 4 ° C. </li><li> Perfuser transcardiaque les souris profondément anesthésiés (3,5% de l&#39;isoflurane) via le ventricule gauche avec du PBS 10 ml glacée, puis avec 40 ml glacée formaldéhyde (débit de 5 ml / min). On dissèque le cerveau et la post-correction dans le même fixatif pendant 24 heures à 4 ° C. </li><li> Transférer les cerveaux consécutivement dans 10% (24 h à 4 ° C) et 30% de saccharose (jusqu&#39;à ce que les puits du cerveau, env. 48 h). Pour la congélation, plonger lentement dans les cerveaux cryoprotégés -25 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;aucune bulle isopentane émergent du tissu. Stocker à -80 ° C. </li><li> Couper des coupes coronales de 40 pm d&#39;épaisseur sur un microtome de congélation (température du bloc à -25 et -16 ° C). sections de transfert de manière séquentielle dans une solution d&#39;antigel contenant des puits d&#39;une plaque de culture cellulaire à 24 puits (voir Figure 1). Stocker à -20 ° C. </li></ol><img aLT = &quot;Figure 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1. Représentation schématique de transférer tranches microtome dans une plaque de 24 puits. Commencez à A1 et placez les tranches ultérieures dans la ligne A, après A6 aller jusqu&#39;à la ligne B et ainsi de suite. En arrivant à D6, revenir à A1 et continuer. Cet agencement permet de tranches pour la quantification de chaque n-ième partie de l&#39;ensemble d&#39;un cerveau. Pour la quantification des cellules nés prendre toutes les 6 e section du cerveau (l&#39;équivalent du contenu d&#39;une colonne), par immunofluorescence phénotypage prendre chaque section 12 e (équivalent au contenu de deux lignes alternées d&#39;une colonne). 3. Immunocoloration NOTE: Les sections sont traitées flottement libre, généralement dans des plaques 6 puits équipés d&#39;une plaque de support et Mesh. Par exception, le blocage, incubations d&#39;anticorps et la réaction ABC sont faites dans 12 ou 24 puits plaques sans inserts en mesh (0,5 à 1 ml par well est suffisante, en fonction du nombre de tranches qui doivent être colorées). Au cours de ces étapes, transférer sections avec l&#39;aide d&#39;un pinceau (rincer à chaque nouvelle solution). Toutes les incubations sont faites avec agitation continue (max 150 rpm). <ol><li> Immunohistochimie (méthode ABC) <ol><li> Transfert sections de l&#39;antigel dans le SCT et bien rincer (une fois O / N à 4 ° C, 5 fois à température ambiante pendant 10 min chacun) pour supprimer complètement l&#39;antigel. </li><li> Incuber pendant 30 min dans 1,5% de H 2 O 2 dans du TBS-T pour étancher une activité de peroxydase endogène. Faites attention à bulles et re-plonger sections si nécessaire. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Facultatif: Pendant ce temps, préchauffer une enceinte de chauffage et du HCl 2 N à 37 ° C. Incuber les coupes pendant 30 min à 37 ° C dans du HCl 2 N pour dénaturer l&#39;ADN. Gently sections distinctes à l&#39;aide d&#39;une brosse. </li><li> Facultatif: Neutraliser sections pendant 10 min dans 0,1 M tampon borate pH8,5, la température ambiante. Pendant le transfert, tamponner brièvement les inserts en mesh contenant les sections sur une serviette en papier pour enlever restes HCl. Rincer deux fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Incuber dans TBSplus pour perméabiliser le tissu et de bloquer les sites de liaison d&#39;anticorps non spécifiques, une heure à température ambiante. </li><li> Incuber dans anticorps primaire dilué dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Incuber dans anticorps secondaire biotinylé dilué dans TBSplus, 3 heures à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. Pendant ce temps ... </li><li> Préparer complexe ABC selon le protocole du fabricant (A + 1% 1% de B dans du TBS-T). Laisser reposer pendant 30 min à température ambiante avant utilisation. Incuber sections réactif AB pendant 1 heure à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Préparer 50 ml 0,5 mg / ml DAB dans du TBS-T par 6 ou 12 puits plaque, divisé en deux moitiés et pipette 4 ml ou 2 ml par puits, respectivement. sections de transfert en solution DAB (ATTENTION! DAB est toxique. Suivez les spécific FDS fournies par le fournisseur, ce est à dire, de porter une blouse de laboratoire et des gants, utilisent une hotte chimique). </li><li> Ajouter 0,5 ml 1% H 2 O 2 à 25 ml de solution de DAB restant, mélanger et volumes pipette équivalentes comme ci-dessus à chaque puits pour démarrer la réaction peroxydase. Incuber pendant 12 min. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Sections de montage aux diapositives de la gélatine, l&#39;air sec O / N. Lamelle avec un milieu de montage permanent. </li><li> Facultatif: Counterstain avant de placer la lamelle (voir section 3.5). NOTE: Si le rapport signal-bruit est faible en raison de bruit de fond élevé, répéter le traitement H 2 O 2 après l&#39;incubation avec le réactif AB (étape 3.1.8). </li></ol></li><li> Multiple-immunofluorescence <ol><li> Immunofluorescence multiple unique ou simultanée <ol><li> Transfert sections de l&#39;antigel dans le SCT et bien rincer (une fois O / N à 4 ° C, 5 fois à température ambiante pendant 10 min chacun) pour supprimer complètement unetifreeze. </li><li> En option: que les étapes 3.1.3 - 3.1.4. </li><li> Incuber dans TBSplus pour perméabiliser le tissu et de bloquer les sites de liaison d&#39;anticorps non spécifiques, une heure à température ambiante. </li><li> Incuber dans un cocktail d&#39;anticorps primaire (par exemple, α-BrdU rats, porcs Guinée α-DCX, chèvre α-GFP) dilués dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Incuber dans cocktail d&#39;anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome (par exemple, la rhodamine Rouge α-rat, Alexa-647 α-Guinée porc, Alexa-488 α-chèvre; tous dérivés dans âne) dilué dans TBSplus, 3 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C. A partir de maintenant protéger les sections de la lumière. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Sections de montage aux diapositives de la gélatine, l&#39;air sec O / N. Lamelle avec un milieu de montage aqueux. </li></ol></li><li> Immunofluorescence multiple séquentielle avec des anticorps primaires de même espèce hôte <ol><li> Comme les étapes 3.2.1.1 - 3.2.1.3. </li><li> Incuber dans fipremier anticorps primaire (par exemple, le lapin α-antigène A), O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber en premier anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome (par exemple, Rhodamine Red-conj. Âne α-lapin), 3 heures TA. A partir de maintenant protéger les sections de la lumière. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber à 10% de sérum normal même hôte que l&#39;anticorps primaire (par exemple, du sérum de lapin) pendant 3 heures à RT saturer paratopes ouvertes sur le premier anticorps secondaire. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber dans TBSplus avec 50 ug / ml monovalents non conjugué de fragments Fab dirigé contre l&#39;hôte des anticorps primaires (par exemple, α-lapin IgG (H + L)) pour couvrir épitopes qui pourraient être reconnus par le deuxième anticorps secondaire, O / N à 4 ° C. </li><li> Rincer au moins 3 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. Pendant le transfert, swa brièvementb les inserts en mesh contenant les sections sur une serviette en papier pour enlever les restes Fab. </li><li> Incuber dans secondes anticorps primaire (par exemple, le lapin α-antigène B), O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber en second anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome (par exemple, Alexa-488-conj. Âne α-lapin), 3 heures TA. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus. NOTE: Pour étiqueter antigènes avec des anticorps de différentes espèces hôtes les ajouter à l&#39;étape 3.2.2.2 et les anticorps secondaires respectifs à l&#39;étape 3.2.2.3. </li></ol></li><li> L&#39;un des anticorps secondaires de même espèce que l&#39;un des anticorps primaires NOTE: Ce protocole est adapté pour quadruple coloration contre BrdU ou Ki67 avec GFAP, nestine-GFP et DCX. <ol><li> Suivre strictement les étapes protocole 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Jusqu&#39;à ce point ne utiliser que du sérum âne dans TBSplus. </li><li> Incuber dans TBSplus contenant du sérum de chèvre à 3% pendant 1 heure à température ambiante. Ce couvre paratopes ouvertes sur l&#39;anticorps secondaire α-chèvre. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber dans AMCA-conj. α-lapin de chèvre dilué à TBSplus, RT 3 h ou O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus. </li></ol></li><li> CldU, IdU co-coloration <ol><li> Rincer, dénaturer et de neutraliser sections comme décrit dans la section 3.2.1 (étapes 3.2.1.1 - 3.2.1.2). </li><li> Incuber à 20 pg / ml de fragments Fab non conjugués α-IgG de souris (H + L) dans TBSplus, 1 heure à température ambiante. Rincer 4 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber dans un cocktail d&#39;anticorps primaire contenant α-BrdU rat (1: 400; purifié IgG2) et α-BrdU souris (1: 350) dilués dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber dans un cocktail d&#39;anticorps secondaire biotinylé contenant âne α-rat (1: 500) et FITC-conj. âne α-souris fragments Fab (1: 100). Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber dans la rhodamine-Rouge conj. Streptavidine, 2 heures à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus. </li></ol></li><li> L&#39;amplification du signal de fluorescence dans des souris nestine-GFP <ol><li> Ajouter chèvre α-GFP au cocktail d&#39;anticorps primaire. </li><li> Ajouter un anticorps secondaire conjugué fluorochrome avec des propriétés spectrales similaires à la GFP (comme Alexa 488 conj. Âne α-chèvre) au cocktail d&#39;anticorps secondaire. </li></ol></li></ol></li><li> épitope <ol><li> Effectuer épitope après rinçage à l&#39;antigel. Préchauffer vapeur avec 6 ou 12 puits des plaques contenant 0,1 M de tampon citrate pH compris entre 6,0 95 à 99 ° C (environ 25 min). </li><li> Transférez les sections dans le tampon citrate chaude et la vapeur pendant 30 min (couvrir les plaques avec du papier d&#39;aluminium que le plastique lidentifiants ne sont pas résistant à la chaleur). </li><li> Immédiatement placer les plaques dans un bain de glace pour refroidir. Cela permet de protéger la morphologie du tissu, ce qui est particulièrement important lorsque l&#39;on travaille avec des coupes de cerveau des animaux post-natales. </li><li> Rincer trois fois dans TBS pendant 10 minutes chacun pour rincer et neutraliser le citrate et continuer coloration. </li></ol></li><li> Souris anticorps sur des tissus de la souris <ol><li> Ajouter / ml de fragments Fab monovalents 20 ug de α-souris IgG (H + L; mêmes espèces d&#39;hôtes que l&#39;anticorps secondaire) à la première étape de blocage (par exemple, l&#39;étape 3.1.5 ou 3.2.1.3). </li><li> Rincer 4 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 min chacun, et procéder avec protocole respective. </li></ol></li><li> Le violet de crésyl contre-coloration <ol><li> Préchauffer solution crésyl violet à 60 ° C (en pot de verre). Incuber les lames dans la solution chaude pendant 3 min. </li><li> Rincer à l&#39;aq. dest. déshydrater et deux fois pendant 1 minute chaque à 70%, 96% et 100% d&#39;isopropanol. </li&gt; <li> Ciel de 5-6 min dans du xylène ou un substitut du xylène et lamelle avec un milieu de montage permanent compatible. </li></ol></li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Compter les cellules nés peroxydase colorées dans chaque section 6 e sur toute la mesure rostrocaudal du gyrus denté. Utilisez un microscope optique à un grossissement de 400X. </li><li> Multiplier les nombres de cellules résultant de l&#39;intervalle d&#39;intersection pour obtenir une estimation du nombre total de cellules-nés. </li><li> L&#39;image de la fluorescence sections marqué avec un microscope confocal laser équipé de lasers appropriés et des systèmes de filtrage. Prendre piles d&#39;images à des positions aléatoires le long de la totalité de l&#39;étendue du gyrus denté à un grossissement de 400X et analyser au moins 50 cellules d&#39;intérêt sélectionnés au hasard par hémisphère pour co-marquage avec d&#39;autres marqueurs. </li><li> Multiplier les pourcentages résultant de cellules co-marqué (% / 100) avec le nombre total de cellules nés pour calculer absoluenombre de populations spécifiques de cellules nouveau-nés. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Quantification et identification des sous-populations de cellules nouveau-nés est une question centrale dans la recherche de la neurogenèse adulte. Combinant marqueurs de prolifération et des anticorps contre les protéines exprimées au cours des étapes spécifiques de la neurogenèse adulte permet la détection immunohistochimique de ces sous-populations. Certains des anticorps ou des combinaisons d&#39;anticorps de coloration nécessitent des conditions particulières. Étiquetage des...

Deux régions du cerveau de manière constitutive générer de nouveaux neurones tout au long de la vie, la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire (SGZ) du gyrus denté de l&#39;hippocampe (DG). Les nouveaux neurones dérivent de cellules progénitrices neurales et passent par différents stades de développement morphologique et physiologique avant d&#39;atteindre la maturité 1,2. A partir d&#39;une cellule souche radiale divisant lentement glie-like (type 1) étages consécutifs de transit amplification de cellules progénitrices intermédiaires se présentent. Les sous-types plus indifférenciées (type 2a et 2b) de type ont une forme irrégulière avec de courtes, les processus tangentielles. Ils génèrent des neuroblastes (type 3) qui sortent graduellement du cycle cellulaire pour devenir neurones immatures (avec dendrites étendus vers la couche moléculaire) et finalement se intégrer dans le réseau de l&#39;hippocampe des cellules granulaires comme matures. En raison de leurs caractéristiques physiologiques particulières ces cellules fournissent les circuits améliorés avec la plasticité 3 suggesTing un rôle unique dans la fonction hippocampique. En fait, les études de la dernière décennie ont généré des preuves substantielles que la neurogenèse adulte contribue à la mémoire spatiale, la séparation de modèle et le comportement émotionnel 4,5. Neurogenèse adulte peut être étudiée en utilisant des approches différentes. analogues de la thymidine intègrent dans l&#39;ADN au cours de la phase S du cycle cellulaire et permettent la naissance datant, la quantification et le destin analyse des cellules nés 6-8. L&#39;application séquentielle des différents analogues de la thymidine (par exemple, CldU, EdU ou UDI) peut être utilisée pour étudier le renouvellement cellulaire ou populations de cellules nés à différents moments au cours d&#39;une expérience 9. Une alternative, le marqueur endogène pour la prolifération cellulaire est Ki67. Il est exprimé dans les cellules en division au cours de toutes les phases du cycle cellulaire (G1, S, G2, M) à l&#39;exception de la phase de repos (G0) et le début de G1 10,11. Afin d&#39;analyser le phénotype des populations de cellules-nés chez l&#39;adulte dentate gyrus plusieurs marqueurs moléculaires spécifiques de stade peuvent être utilisés tels que GFAP, nestine, DCX et NeuN 1,6. GFAP est un marqueur des astrocytes matures, mais est également exprimé dans les cellules gliales radiales comme dans le cerveau antérieur des adultes. Nestin est un filament intermédiaire spécifique des cellules gliales radiales ressemblant et les cellules progénitrices intermédiaires début. DCX est une protéine associée aux microtubules exprimée dans les progéniteurs intermédiaires, les neuroblastes et les neurones immatures. Basé sur le (co) expression de ces trois marqueurs et les caractéristiques morphologiques des cellules marquées quatre sous-types de cellules souches distinctes peuvent être identifiés: le type 1 (GFAP +, nestine +, DCX -), le type 2a (GFAP -, nestine + , DCX -), le type 2b (GFAP -, nestine +, DCX +) et le type 3 (GFAP -, nestine -, DCX +) 1. Co-marquage de DCX avec NeuN, qui est exprimé dans les neurones post-mitotiques, permet la différenciation des immature (DCX +, NeuN +) et matures (DCX -, NeuN +) neurones granulaires. Les marqueurs mentionnés ci-dessus sont fréquemment utilisés pour co-marquage immunofluorescent et microscopie confocale ultérieur pour analyser le nombre et l&#39;identité des cellules de nouveau-nés. Cela nécessite habituellement des anticorps de différentes espèces hôtes anticorps pour empêcher une réactivité croisée indésirable. Cependant, la majorité des anticorps primaires appropriés pour la recherche de la neurogenèse sont élevés soit chez le lapin ou souris (par exemple, souris α-BrdU, souris α-NeuN, lapin α-Ki67, lapin α-GFAP). Cela conduit à de sérieuses limitations dans le nombre et la combinaison des antigènes qui peuvent être évalués en une seule tranche. Ceci à son tour augmente non seulement l&#39;effort de coloration, selon colorations multiples doivent être effectuées, mais peut aussi compromettre la fiabilité des résultats. De plus, certains antigènes sont sensibles à la formaline épitope induite par masquage de fixation (par exemple, Ki67, La nestine). Nous décrivons ici modifications des protocoles de immunomarquage simples et multiples classiques (par exemple, la récupération de l&#39;épitope, immunocoloration séquentielle multiples, utilisation de la nestine-GFP souris transgéniques 12) à surmonter bon nombre de ces questions. En particulier, le protocole d&#39;immunofluorescence multiple séquentielle permet coloration contre un maximum de quatre antigènes différents même si une partie des anticorps est dérivé du même hôte. Ceci permet la détection simultanée de type 1, type 2a, 2b et le type des cellules progénitrices de type 3, ainsi que leur activité proliferative dans une seule section.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:277px;">Name</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:131px;">Comments &#38; Dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="13">
			<td height="13" style="height:13px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine analog administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td rowspan="4" style="width:131px;">toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6891</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2105478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine, IdU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100357</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane-Actavis</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>700211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Riedel-De H&#228;en</td>
			<td>16005</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Perfusion pump PD5206</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>523-52060-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Masterflex Tygon lab tubing, &#216; 0.8 mm&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>06409-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezing microtome Microm HM 400</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">24 Well Cell Culture Multiwell Plates</td>
			<td style="width:147px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefal Vitacuisine Steamer</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>VS 4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectastain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">DAB (3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5637</td>
			<td style="width:131px;">carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">rabbit IgG1 &#945;-Ki67</td>
			<td style="width:147px;">Novocastra/ Leica Biosystems</td>
			<td>NCL-L-Ki67MM1</td>
			<td style="width:131px;">DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit &#945;-GFAP, AS-3-GF</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>173 002</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat IgG (H+L) &#945;-GFP</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1091P</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">mouse IgG1 &#945;-nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6142</td>
			<td style="width:131px;">1:200; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">guinea pig IgG (H+L) &#945;-Doublecortin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (ascites)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030CX</td>
			<td style="width:131px;">for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (purified)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">mouse IgG1&#312; &#945;-BrdU</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td style="width:131px;">for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse IgG1 &#945;-NeuN</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-065-152</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-065-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat &#945;-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-097-003</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-605-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-605-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-295-150</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-295-152</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-296-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-Rhodamine Red-X&#160;</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>016-290-084</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat &#945;-rabbit IgG (H+L)-AMCA</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-155-144</td>
			<td style="width:131px;">1:250, works only with rabbit &#945;-GFAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal donkey serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal rabbit serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>011-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal goat serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>005-000-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Cresyl violett</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Clear</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109843</td>
			<td style="width:131px;">non-toxic xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Mount</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109016</td>
			<td style="width:131px;">permanent mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Axioskop 2</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis

Neurogenèse adulte est un processus très réglementé multi-étape dans laquelle de nouveaux neurones sont générés à partir d&#39;une cellule souche neurale activé par de plus en plus engagés sous-types de souches intermédiaires. Chacun de ces sous-types exprime un ensemble de marqueurs moléculaires spécifiques qui, avec des critères morphologiques spécifiques, peuvent être utilisés pour leur identification. Typiquement, les techniques d&#39;immunofluorescence sont appliqués impliquant des anticorps spécifiques du sous-type en combinaison avec des marqueurs de prolifération exo ou endogènes. Nous décrivons ici immunomarquage méthodes pour la détection et la quantification de tous les stades de la neurogenèse hippocampique adulte. Celles-ci comprennent l&#39;application d&#39;analogues de la thymidine, perfusion transcardial, traitement des tissus, épitope par la chaleur, ABC immunohistochimie, immunofluorescence indirecte multiple, microscopie confocale et de quantification des cellules. En outre, nous présentons un protocole d&#39;immunofluorescence multiple séquentielle qui contourne les problèmes usually découlant de la nécessité d&#39;utiliser des anticorps primaires soulevées dans les mêmes espèces hôtes. Il permet une identification précise de tous les sous-types de souches de l&#39;hippocampe avec un marqueur de prolifération dans une seule section. Ces techniques sont un outil puissant pour étudier la régulation de différents sous-types de souches en parallèle, leur implication dans les pathologies du cerveau et de leur rôle dans les fonctions spécifiques du cerveau.

Nous avons appliqué les méthodes décrites ci-dessus pour quantifier et caractériser les cellules de nouveau-nés dans les postnatales et adultes hippocampe. Par conséquent, nous avons utilisé de type sauvage et la neurogenèse déficientes cycline D2 knock out (KO) Ccnd2 souris logées dans des conditions connues pour affecter le taux de la neurogenèse (ie, l&#39;environnement enrichi, EE) 13,14. DAB coloration immunohistochimique soit contre Ki67, BrdU, CldU ou IdU toujours révélé...

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Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K vues.  Jena University Hospital. This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Vidéo: Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Recherche

Neurosciences

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogation fonctionnelle des adultes hypothalamique neurogenèse avec Focal radiologique inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

La chaleur induite par un antigène de récupération: une méthode efficace pour détecter et identifier les types de cellules progénitrices adultes au cours de l&#39;hippocampe neurogenèse

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potentiel de membrane Dye Imaging de ventromédian hypothalamus neurones de souris adulte à étudier Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

Des procédés pour la modulation et de l&#39;analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine à l&#39;âge adulte de poisson zèbre avec des colorants fluorescents

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomal Biocytin étiquetage pour étudier la structure-fonction de relation corticale individuelle neurones

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab blessures plaies du poisson zèbre adulte Télencéphale: Une méthode pour étudier le cerveau des vertébrés neurogenèse et régénération

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Évaluation de la neurogenèse primaire en<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryons Utilisation de immunocoloration

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.