Ce travail a été financé en partie par la fondation PhRMA et un prix de recherche et d’érudition de l’Université du Maryland, College Park. Nous remercions le Professeur Darrell Irvine pour son soutien aux travaux initiaux menés dans le cadre de l’achèvement de « l’ingénieriein situ du microenvironnement ganglionnaire par injection intranodale de particules polymères libérant des adjuvants ». 5

Toutes les études sur les animaux dans ce protocole ont été réalisées conformément aux directives fédérales, étatiques et locales, et en utilisant des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Maryland.
1. Synthèse de microparticules et de nanoparticules stabilisées en lipides
<ol><li>Dans un flacon en verre de 7 ml, combiner les lipides DOPC, DSPE-PEG et DOTAP à un rapport molaire de 60:20:20 pour préparer un mélange lipidique maître.<ol>
<li>Pour synthétiser un seul échantillon : Transférer respectivement 242,9 μl, 287,4 μl et 71,9 μl de DOPC, DSPE-PEG et DOTAP dans le flacon à l’aide de pipettes sérologiques en verre de 2 ml.</li>
		<li>Pour synthétiser plusieurs échantillons : Multipliez chaque volume lipidique ci-dessus par le nombre d’échantillons et combinez-les en un seul flacon, puis transférez des aliquotes égales de ce mélange lipidique dans des flacons correspondant à chaque échantillon à préparer.</li>
		<li>Sécher les lipides sous un doux flux d’azote gazeux pendant 10 min, ou les placer dans un four à vide pendant la nuit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dans un seul flacon en verre vide de 20 ml, dissoudre 80 mg de PLGA dans 5 ml de dichlorométhane pour chaque échantillon de particules afin de générer une solution mère de polymère à 16 mg/ml.</li>
	<li>Ajouter 5 ml de solution polymère au(s) flacon(s) contenant les lipides, le capuchon et le vortex séchés pendant 30 secondes.</li>
	<li>Pour synthétiser des microparticules :<ol>
<li>Commencez à soniquer la phase organique contenant le polymère, les lipides et d’autres cargaisons insolubles dans l’eau sur la glace à 12 W à l’aide d’un sonicateur.</li>
		<li>Créer l’émulsion eau dans huile (p/o) à l’aide d’une pipette pour ajouter 500 μl deH2O distillé, ouH2O contenant 1 mg de peptide, de protéines ou d’autre cargaison soluble dans l’eau.</li>
		<li>Continuez à soniquer pendant 30 secondes à 12 W sur la glace, en berçant doucement le flacon de haut en bas et d’un côté à l’autre autour de la pointe du sonicateur pour assurer une émulsification complète.</li>
		<li>Créer l’émulsion eau-dans-huile-dans-eau (p/o/p) en versant l’émulsion p/o dans 40 ml deH2O dans un bécher de 150 ml.</li>
		<li>Homogénéiser pendant 3 min à 16 000 tr/min à l’aide d’un homogénéisateur numérique.</li>
		<li>Ajouter une barre d’agitation magnétique, transférer le bécher sur une plaque d’agitation et laisser l’émulsion p/s/p remuer pendant la nuit pour éliminer l’excès de solvant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour synthétiser des nanoparticules :<ol>
<li>Commencer à soniquer la phase organique contenant le polymère, les lipides et d’autres cargaisons insolubles dans l’eau sur la glace à 14 W.</li>
		<li>Créez l’émulsion w/o à l’aide d’une pipette pour ajouter 500 μl deH2O distillé, ouH2O contenant 1 mg de peptide, de protéines ou d’autres cargaisons solubles dans l’eau.</li>
		<li>Continuer à soniquer pendant 30 sec à 14 W sur la glace.</li>
		<li>Créer l’émulsion p/o/p en versant l’émulsion p/o à 40 ml deH2O dans un bécher de 150 ml et en soniquetant pendant 5 min à 16 W sur de la glace. Basculez doucement le flacon de haut en bas et d’un côté à l’autre autour de la pointe du sonicateur pour assurer une émulsification complète.</li>
		<li>Ajouter une barre d’agitation magnétique, transférer le ballon sur une plaque d’agitation et laisser l’émulsion p/s/p remuer pendant une nuit pour éliminer l’excès de solvant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le lendemain matin, lavez et collectez les particules:<ol>
<li>Verser l’émulsion à travers une passoire de cellule à mailles de nylon de 40 μm dans un tube conique de 50 ml.</li>
		<li>Particules centrifuges pendant 5 min à 5 000 x g pour les microparticules ou 5 min à 24 000 x g pour les nanoparticules.</li>
		<li>Décantant le surnageant et lavage des particules par remise en suspension dans 1 ml deH2O.</li>
		<li>Transférer les particules en suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.</li>
		<li>Centrifuger pendant 5 min à 5 000 x g pour les microparticules ou 5 min à 24 500 x g pour les nanoparticules.</li>
		<li>Laver les particules deux fois de plus en enlevant le surnageant, en les ressuscitant dans 1 mlH2O,et en centrifugant comme à l’étape 1.6.5. Après le lavage, suspendre les particules dans 1 mlH2O pour une utilisation immédiate, ou lyophiliser pour un stockage prolongé.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mesure du rendement de synthèse
<ol><li>Pré-pondez un flacon en verre vide de 20 ml. Ajouter 100 μl de suspension de particules au flacon pré-pesé après avoir pipeté de haut en bas avec une micropipette à mélanger.</li>
	<li>Lyophiliser les particules ou sécher sous un doux jet d’azote.</li>
	<li>Peser le flacon contenant le polymère séché. Déterminer le rendement en particules dans le flacon en soustrayant le poids d’origine du flacon de la masse du flacon contenant les particules séchées.</li>
	<li>Déterminer le rendement global des particules en multipliant la masse de particules dans le flacon par le facteur de dilution. Pour déterminer le rendement en pourcentage, divisez la masse de particules par la masse d’entrée théorique maximale et multipliez par 100 %.</li>
</ol>3. Détermination de la taille des particules
<ol><li>Nettoyez la cellule de fraction de verre de style cuvette fournie en la remplissant d’eau désionisée et en essuyant avec un écouvillon à bout de coton. Transférer 10 ml deH2Odistillé dans la cellule de faction nettoyée, ajouter une micro-barre d’agitation magnétique et charger la cellule de fraction dans le support cellulaire de l’analyseur de granulométrie.</li>
	<li>Ajustez la vitesse d’agitation magnétique dans l’analyseur de particules pour obtenir un mélange complet dans la cellule de fraction et fermez la porte du compartiment.</li>
	<li>Alignez les lasers sur la cellule de fraction à l’aide de l’interface du logiciel de l’instrument.</li>
	<li>Utilisez l’interface du logiciel de l’instrument pour enregistrer une lecture de ligne de base avec la cellule de fraction ne contenant que duH2Odistillé.</li>
	<li>Pipettez la suspension de particules d’origine de haut en bas avec une micropipette à mélanger.</li>
	<li>Pipetter 10 μl de suspension de particules (généralement environ 0,5 mg) dans la cellule de fraction. Assurez-vous que le volume d’échantillon de particules ajouté à la cellule est suffisant pour générer l’intensité du signal dans la plage appropriée, comme indiqué sur l’interface du logiciel de l’instrument. La masse réelle de particules requise dépend du rendement en pourcentage et des propriétés optiques de l’échantillon de particules.</li>
	<li>Fermez la porte du compartiment de l’analyseur de granulométrie et mesurez la taille des particules à l’aide d’un indice de réfraction de 1,60 pour le PLGA.</li>
	<li>Utilisez l’interface logicielle pour calculer le diamètre des particules à l’aide d’un nombre.</li>
</ol>4. Visualisation des particules
<ol><li>Pipette suspension de particules de haut en bas avec micropipette à mélanger. Diluer la suspension de particules à 1 mg/ml dans de l’eau désionisée.</li>
	<li>Préparez une lame de microscope en ajoutant 3 μl de suspension de particules diluées et en montant une lame de couverture à un angle de 45 ° pour éviter la formation de bulles. Placez la lame sur l’étage du microscope et l’image à l’aide des ensembles de filtres appropriés pour chaque cargaison fluorescente.</li>
</ol>5. Préparation de souris pour i.LN. injection
<ol><li>Préparer une solution de colorant traceur:<ol>
<li>Préparer une solution à 0,1 % (p/v) de colorant traceur en dissolvant 10 mg de poudre de colorant avec 10 ml de H2O distillé.</li>
		<li>Stériliser la solution de colorant dans un flacon en verre à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Un jour avant l’injection, anesthésier la souris à l’aide d’isoflurane selon un protocole animal approuvé par l’IACUC. Pour évaluer la profondeur de l’anesthésie, effectuez un test réflexe de pincement des pincements et surveillez la fréquence respiratoire pour assurer une fréquence respiratoire d’environ 100 à 140 respirations par minute.</li>
	<li>Rasez les cheveux à la base de la queue et du quartier arrière à l’aide de tondeuses pendant que la souris est anesthésiée. Retirez les poils de la face ventrale de l’animal et latéralement autour de la face dorsale juste au-dessus de l’articulation de la jambe postérieure (hanche).</li>
	<li>Injecter un colorant traceur.<ol>
<li>Pour chaque injection de colorant, utilisez une micropipette pour transférer 10 μl de solution de colorant dans un tube de microcentrifugation et aspirez la totalité des 10 μl dans une aiguille 31G fixée à une seringue de 1 ml.</li>
		<li>Injecter 10 μl de solution de colorant par voie sous-cutanée de chaque côté de la base de la queue où les cheveux ont été coupés, rechargeant entre les injections.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enlevez les poils restants en appliquant une crème dépilatoire douce via des cotons-tiges. Assurez-vous d’enrober la zone entre la cuisse postérieure et l’abdomen.</li>
	<li>Laisser la crème dépilatoire incuber sur la peau pendant 3 min. Après l’incubation, main gantée humide avecH2Ochaud et frottez doucement la crème dépilatoire dans la peau.</li>
	<li>Retirez immédiatement la crème dépilatoire en mouillant la main gantée avec H2O chaud et en frottant la base de la queue et le quartier arrière. Répétez jusqu’à ce que l’excès dépilatoire soit enlevé, en vous assurant de garder la main mouillée pour éviter l’irritation.</li>
	<li>Retirez l’épilation résiduelle de la souris en mouillant un chiffon doux ou une serviette en papier avec H2Ochaud et en un seul mouvement, en essuyant la partie inférieure de la souris. Évitez un mouvement de frottement pour éviter l’abrasion ou les dommages à la peau de la souris.</li>
	<li>Laissez la souris récupérer sous une lampe chauffante et revenez à la tenue.</li>
</ol>6. i.LN. Injection de particules
<ol><li>Le lendemain, anesthésiez la souris à l’aide d’isoflurane conformément à un protocole animal approuvé par l’IACUC.</li>
	<li>Examinez la souris pour confirmer le drainage du colorant traceur dans chaque ganglion lymphatique inguinal. Le ganglion lymphatique doit être visible sous la forme d’une tache sombre près de la cuisse postérieure et de l’abdomen.</li>
	<li>Préparer une solution injectable de particules:<ol>
<li>Ressusciter les particules dansH2O distillé à la concentration d’injection désirée. Pour chaque injection, utilisez une micropipette pour transférer 10 μl de solution de particules dans un tube de microcentrifugation.</li>
		<li>Aspirer la totalité des 10 μl dans une aiguille à insuline 31G fixée à une seringue de 1 ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecter la dose de particules:<ol>
<li>Après avoir visualisé le LN, serrez la peau autour du LN à l’aide du pouce, de l’index et du majeur pour tirer la peau et permettre le placement contrôlé du volume d’injection.</li>
		<li>Approchez le LN avec l’aiguille à un angle de 90° par rapport à la peau et pénétrez dans la peau au-dessus du LN teint jusqu’à une profondeur de 1 mm.</li>
		<li>Injectez lentement tout le volume. Pendant l’injection, observez le volume du LN à travers la peau pour confirmer l’injection par l’élargissement visible du LN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laissez la souris récupérer sous une lampe chauffante et revenez à la tenue ou effectuez des tests supplémentaires.</li>
</ol>Pour les techniques d’analyse pertinentes(par exemple, histologie, cytométrie en flux), voir les articles JoVE 265, 1743 et 3054 et les protocoles actuels en immunologie,chapitres 5 et 2115-22.

<ol>
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Les coûts de production et les frais d’accès pour ces articles ont été partiellement parrainés par HORIBA, Ltd.

La technique décrite dans ce protocole permet l’administration contrôlée des vaccins aux LN et aux cellules présentatrices d’antigène ln-résidentes. La cargaison encapsulée de biomatériaux peut être localisée dans le réseau local, ce qui permet de manipuler les doses d’un ou de plusieurs types de cargaisons livrées au microenvironnement du réseau local. Il a été démontré que la localisation et la libération contrôlée des particules de polymère génèrent une puissante réponse immunitaire cellulaire et humorale à des doses significativement plus faibles que les approches conventionnelles. De plus, grâce à la manipulation de la taille du support de biomatériaux, le mode primaire de traitement cellulaire peut être modulé entre l’absorption directe de nanoparticules ou la libération de cargaison extracellulaire à partir de microparticules plus grandes5. Ces résultats établissent la faisabilité de l’administration de biomatériaux i.LN. en tant que plate-forme pour l’administration de vaccins thérapeutiques.
La synthèse de particules PLGA par émulsion/évaporation de solvant a été largement utilisée dans les applications d’administration de médicaments23,24. Ainsi, les défis potentiels associés à cette technique sont principalement liés à l’identification et au dépôt réussis des vaccins dans le site cible du nouveau-n°c. Bien que l’utilisation du colorant traceur facilite la visualisation des LN inguinaux ciblés, la taille et la profondeur de la cible sous la peau sont petites. Ainsi, les auteurs recommandent d’allouer du temps et des souris pour pratiquer la préparation et les injections de souris. Pendant la préparation de l’animal(c’est-à-dire le rasage et l’application d’un dépilatoire), il faut veiller à ne pas couper les souris sur la face ventrale de l’animal où l’angle de la jambe avec l’abdomen rend la peau plus sujette aux blessures causées par les tondeuses. De plus, tous les dépilatoires doivent être enlevés avec de l’eau tiède pour empêcher les animaux d’ingérer la crème pendant le comportement normal de toilettage. Pour pratiquer les injections de LN, une concentration plus élevée de colorant traceur peut être administrée et les animaux de pratique peuvent être euthanasiés, puis injectés plusieurs fois. Après l’injection, les souris peuvent être nécropsiées et la taille des LN provenant d’animaux injectés peut être comparée à celle d’un LN témoin non injecté. Une limitation de cette technique est la limite physique du volume d’injection qui peut être chargé dans la structure LN. Notre protocole suggère un volume d’injection de 10 μl chez la souris, bien que d’autres études aient rapporté des volumes d’injection plus importants au moins aussi élevés que 20 μl.13 Cependant, l’administration directe de vaccins par injection i.LN. permet une réduction spectaculaire de la dose, de sorte que la fonction de ces vaccins ne devrait généralement pas être limitée par des contraintes de volume.
Comme nous l’avons mentionné, la modification de la propriété physique des particules(c.-à-d. la taille) est un mécanisme efficace pour modifier la voie ou les résultats induits par les biomatériaux et les cargaisons encapsulées dans le tissu LN. Le protocole d’évaporation émulsion/solvant peut facilement être modifié pour modifier les propriétés physiques ou chimiques telles que la charge ou la fonctionnalité de surface, et le taux de biodégradation/libération de la cargaison23,24. Par exemple, la cinétique de libération peut être réglée par des compositions polymères alternatives, et la fonction de surface peut être modifiée à l’aide de compositions lipidiques modifiées ou de poly(alcool vinylique). La cargaison chargée en particules peut être facilement manipulée pour contenir différents antigènes ou adjuvants pour les agents pathogènes cibles. L’avantage de cette approche est obtenu grâce à la combinaison de la livraison i.LN. avec la mainlevée locale et contrôlée de la cargaison à partir de biomatériaux. Cette synergie établit une plate-forme qui peut être exploitée pour générer efficacement des réponses immunitaires adaptatives à l’aide de doses infimes et avec des effets secondaires non spécifiques / systémiques réduits.

Les ganglions lymphatiques (LN) sont les centres de commandement du système immunitaire. À ce site immunologique, les cellules présentatrices d’antigènes amorcent les lymphocytes naïfs contre les antigènes étrangers spécifiques pour activer les réponses immunitaires cellulaires et humorales. Les LN sont ainsi devenus une cible attrayante pour l’administration de vaccins et d’immunothérapies. Malheureusement, la plupart des stratégies vaccinales entraînent une administration inefficace et transitoire d’antigènes et d’adjuvants au tissu lymphoïde1. Les approches qui améliorent le ciblage et la rétention des composants du vaccin dans les IAA pourraient donc avoir un impact significatif sur la puissance et l’efficacité des nouveaux vaccins.
Une stratégie pour contourner le défi du ciblage des LN qui a démontré un grand intérêt pour les nouveaux essais cliniques est l’injection directe, intra-LN (i.LN.)2-4. Ces essais ont utilisé des conseils échographiques pour administrer des vaccins aux LN en tant que simple procédure ambulatoire. Par rapport aux voies d’injection périphériques traditionnelles, cette approche a permis d’épargner considérablement la dose et d’améliorer l’efficacité dans des contextes thérapeutiques, y compris les allergies et le cancer2-4. Ces études ont utilisé l’injection i.LN. de vaccins solubles(c’est-à-dire sans biomatériaux) qui ont été rapidement nettoyés par drainage lymphatique. Par conséquent, des injections multiples- ou des cycles d’injections multiples- ont été administrés pour réaliser ces effets thérapeutiques impressionnants. Une meilleure rétention dans le LN pourrait améliorer l’interaction entre l’antigène et/ou l’adjuvant et les cellules immunitaires, améliorant davantage la puissance de l’amorçage des cellules immunitaires. Ce potentiel est soutenu par des études récentes qui montrent que la cinétique de l’antigène et de l’administration adjuvante joue un rôle essentiel dans la détermination de la réponse immunitaire spécifique générée5-7. De plus, la localisation et la réduction au minimum des doses de médicaments et de vaccins pourraient réduire ou éliminer les effets systémiques, comme l’inflammation chronique.
Les biomatériaux ont fait l’objet d’études approfondies pour améliorer la puissance et l’efficacité des vaccins1,8,9. L’encapsulation ou l’adsorption sur les supports de biomatériaux peut protéger physiquement la cargaison de la dégradation et surmonter les limites de solubilité. Une autre caractéristique notable des transporteurs de biomatériaux, tels que les microparticules ou nanoparticules polymères, est la capacité de cocharger plusieurs classes de cargaison et, par la suite, de libérer ces cargaisons à intervalles contrôlés. Cependant, une limitation importante qui continue d’entraver les vaccins contre les biomatériaux et les immunothérapies in vivo est le ciblage inefficace des cellules immunitaires et le trafic limité vers les ganglions lymphatiques. Par exemple, l’injection périphérique de vaccins contre les biomatériaux par des voies conventionnelles(par exemple intradermiques, intramusculaires) présente généralement un mauvais ciblage du LN, avec jusqu’à 99% du matériel injecté restant au site d’injection4,10. Plus récemment, la taille des porteurs de vaccins biomatériaux a été réglée pour améliorer le trafic préférentiel ou le drainage de ces vaccins vers les LN par le flux interstitiel8,10. Ces progrès ont permis d’améliorer les réponses immunitaires cellulaires et humorales, soulignant l’importance de cibler et d’ingénierie l’environnement du LN pour de nouveaux vaccins.
Cet article présente un protocole de vaccination qui combine des particules de polymère stabilisées aux lipides et l’administration d’i.LN. pour générer des dépôts de vaccins à libération contrôlée5,11. S’appuyant sur des études récentes utilisant des techniques chirurgicales pour i.LN. chez la souris6,7,12,13, nous avons développé une stratégie rapide et non surgicale pour l’injection de vaccins biomatériaux chez les petits animaux5. La combinaison de l’administration i.LN. avec des porteurs de vaccins biomatériaux a puissamment amélioré la réponse des lymphocytes T CD8 dans les 7 jours suivant une seule injection de dépôts de vaccins à libération contrôlée5. Une réponse humorale forte(c.-à-d. titres d’anticorps) a été également générée ; ces deux améliorations étaient liées à une rétention accrue des composants du vaccin dans les ganglions lymphatiques qui était médiée par la libération contrôlée des porteurs de biomatériaux. Fait intéressant, la taille des particules vaccinales a modifié le devenir de ces matériaux une fois dans les LN: les particules à l’échelle nanométrique ont montré une absorption directe accrue par les cellules, tandis que les microparticules plus grosses sont restées dans l’environnement LN extracellulaire et ont libéré une cargaison(par exemple adjuvant) qui a été absorbée par l’antigène résident du LN présentant des cellules5. Ces données suggèrent deux voies qui pourraient être exploitées pour de nouveaux vaccins en contrôlant la taille des biomatériaux injectés i.LN.
Dans cet article, les particules polymères biodégradables stabilisées en lipides (micro- et nano-échelle) sont synthétisées à l’aide d’une stratégie de double émulsion modifiée5,11. Les propriétés des particules sont caractérisées par la diffraction laser et la microscopie. Ces particules sont ensuite injectées directement dans les LN inguinaux identifiés nonchirurgicalement à l’aide d’un colorant traceur commun et non toxique14. L’analyse post-injection des LN par histologie ou cytométrie de flux peut être utilisée pour vérifier la distribution des particules dans l’environnement LN, ainsi que pour surveiller l’absorption cellulaire et la rétention des particules au fil du temps. Pour les protocoles détaillant le traitement histologique et la cytométrie en flux, les lecteurs sont renvoyés aux articles récents de JoVE et aux rapports de revue15-22. Les résultats typiques démontrent le ciblage local de ces dépôts par LN qui pourraient être exploités pour obtenir des réponses immunitaires puissantes et efficaces ou pour adapter l’immunité aux agents pathogènes cibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850375</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880128</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polylactic-co-glycolic acid (PLGA)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2191</td>
			<td style="width:167px;">Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dichloromethane (DCM)</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH1113</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:71px;">Vetone</td>
			<td style="width:119px;">502017</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair</td>
			<td style="width:71px;">Nair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Evans blue tracer dye</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">AAA16774-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD328418</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305167</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD309628</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-949</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vybrant DiD Cell-Labeling Solution</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17149</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17156</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ovalbumin, Purified</td>
			<td style="width:71px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LS003056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125</td>
			<td style="width:71px;">Qsonica</td>
			<td style="width:119px;">Q125</td>
			<td style="width:167px;">1/8 in diameter microtip probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">YO-04739-22</td>
			<td style="width:167px;">10 G dispersing element</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX-83</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer</td>
			<td style="width:71px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">LA-950</td>
			<td style="width:167px;">Including provided cuvette-style glass fraction cell</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Professional 8685 Peanut Classic Clippers</td>
			<td style="width:71px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-lymph node injection of biodegradable polymer particles

La génération de la réponse immunitaire adaptative repose sur le drainage efficace ou le trafic de l’antigène aux ganglions lymphatiques pour le traitement et la présentation de ces molécules étrangères aux lymphocytes T et B. Les ganglions lymphatiques sont ainsi devenus des cibles critiques pour les nouveaux vaccins et immunothérapies. Une stratégie récente pour cibler ces tissus est l’injection directe des ganglions lymphatiques des composants solubles du vaccin, et les essais cliniques impliquant cette technique ont été prometteurs. Plusieurs stratégies de biomatériaux ont également été étudiées pour améliorer le ciblage des ganglions lymphatiques, par exemple, en accordant la taille des particules pour un drainage optimal des particules vaccinales de biomatériaux. Dans cet article, nous présentons une nouvelle méthode qui combine l’injection directe des ganglions lymphatiques avec des particules de polymère biodégradables qui peuvent être chargées d’antigène, d’adjuvant ou d’autres composants vaccinaux. Dans ce procédé, les microparticules polymères ou nanoparticules sont synthétisées par un protocole d’émulsion double modifié intégrant des stabilisants lipidiques. Les propriétés des particules(p. ex. taille, charge de la cargaison) sont confirmées par diffraction laser et microscopie fluorescente, respectivement. Les ganglions lymphatiques de souris sont ensuite identifiés par l’injection périphérique d’un colorant traceur non toxique qui permet la visualisation du site d’injection cible et le dépôt ultérieur de particules de polymère dans les ganglions lymphatiques. Cette technique permet un contrôle direct des doses et des combinaisons de biomatériaux et de composants vaccinaux administrés aux ganglions lymphatiques et pourrait être mise au point dans le développement de nouveaux vaccins à base de biomatériaux.

Les résultats attendus pour les protocoles présentés dans ce manuscrit peuvent être divisés en trois catégories : la synthèse de particules, la préparation animale et l’injection de particules.
La figure 1 illustre la synthèse et la caractérisation de particules polymères biodégradables, stabilisées par des lipides amphiphiles. Les résultats du protocole de synthèse par évaporation émulsion/solvant(figure 1A)peuvent être évalués qualitativement par inspection visuelle des émulsions finales générées; les lots de particules doivent être des émulsions homogènes et stables à l’aspect opaque. Les complications comprennent des émulsions qui crèment ou floculent, souvent en raison d’un stockage inapproprié des stabilisants lipidiques. Pour éviter cette instabilité, les lipides doivent être conservés à -80 °C à l’état déshydraté ou dans un flacon scellé purgé avec de l’azote. L’évaluation quantitative de la synthèse des particules peut être effectuée à l’aide de la diffraction laser ou de la diffusion dynamique de la lumière pour analyser la distribution de la taille(Figure 1B). Les résultats attendus comprennent des tailles de particules monomodales étroitement réparties, indiquant une population uniforme de particules. Les paramètres de synthèse décrits dans ce manuscrit génèrent des distributions moyennes centrées sur environ 100 nm ou 3 μm pour les nanoparticules et les microparticules, respectivement. Une évaluation qualitative plus poussée de la synthèse des particules peut être réalisée en modifiant le protocole ci-dessus pour incorporer plusieurs classes de cargaison fluorescente. Sur la figure 1C,des images de microscopie de microparticules chargées d’un peptide fluorescent (FITC, vert), d’un colorant lipophile (DiD, rouge), et d’une image de superposition (jaune) confirment la création de particules dans la gamme de taille souhaitée et l’encapsulation de peptide dans le volume de la particule.
Les deux premiers panneaux de la figure 2 résument les résultats attendus de la préparation des animaux pour la stratégie d’injection i.LN. décrite dans le présent document. La méthodologie consiste à marquer les LN inguinaux par injection périphérique d’un traceur non toxique afin d’identifier l’emplacement de l’injection ultérieure de particules i.LN. (figure 2A)5. Comme nous l’avons mentionné, le drainage du colorant traceur après injection sous-cutanée à la base de la queue permettra la visualisation des LN inguinaux (Figure 2B)5. L’ingestion de crèmes dépilatoires approuvées peut présenter des dangers pour les souris. Ainsi, il faut prendre soin d’enlever soigneusement toute la crème appliquée, en accordant une attention particulière aux pattes et à la face ventrale des souris. L’épilation doit être enlevée à l’aide d’un chiffon humide et doux ou d’une serviette en papier humide dans un seul mouvement lisse. Évitez de frotter pour enlever la crème, car cela peut entraîner des abrasions sur la peau exposée des souris.
La confirmation du local de la livraison au LN inguinal peut être évaluée par l’observation ou l’histologie. Le volume LN peut être surveillé visuellement pendant l’injection comme un indicateur de l’injection réussie. Les résultats attendus comprennent une distribution efficace de la cargaison dans toute la structure du LN, sans fuite importante vers les tissus ou les cellules adjacents. De plus, comme le liquide injecté déplace/dilue le traceur dans le LN, la concentration/coloration du colorant devrait devenir moins intense après l’injection. L’observation du tissu devrait indiquer un LN intact, mais agrandi dû à l’injection liquide. Les défis potentiels incluent l’injection trop rapidement ou l’absence du LN, qui peuvent tous deux causer l’élution du volume dans le tissu sous-cutané environnant. Ces résultats indésirables peuvent être confirmés par l’autopsie ou l’histologie, où la suspension de particules sera observée se propageant aux cellules et aux tissus éloignés des nœuds ciblés pour l’injection. En revanche, un résultat attendu serait l’identification d’un LN inguinal agrandi en raison du confinement des particules dans la structure LN. Le traitement histologique des LN excisés peut confirmer définitivement la livraison de la cargaison au tissu lymphoïde, comme le montrent les figures 2C et 2D. Notez que les particules de la figure 2 incorporent une cargaison fluorescente pour permettre la visualisation de la cargaison pendant l’injection, ainsi que pendant le traitement histologique et la microscopie fluorescente.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig1.jpg" width="600px"> Figure 1. Synthèse et caractérisation des particules stabilisées lipidiques. A) Schéma de schéma décrivant la synthèse de particules stabilisées en lipides préparées par évaporation émulsion/solvant. B) Distributions granuriques des microparticules (ligne continue, diamètre = 2,8 μm) et des nanoparticules (ligne pointillée, diamètre = 113 nm). C) Images de microscopie fluorescente de particules chargées d’un peptide marqué par fluorescence et d’un colorant à particules fluorescentes. Étiquettes: peptide (vert) et particule (rouge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig2.jpg" width="600px"> Figure 2. i.LN. Injection and Distribution of Biodegradable Particles within LN. A)Méthodologie pour l’injection i.LN. B) Visualisation des LN chez une souris à travers la peau (image supérieure) et après l’autopsie (image inférieure)5. C) Coloration histologique d’un LN confirmant le dépôt et la distribution de microparticules polymères marqués par fluorescence (particules, vertes; Lymphocytes T, rouges; Cellules B, bleu). D) Nanoparticules marqués par fluorescence (50 nm, image de gauche) et microparticules (6 μm, image de droite) dans les LN 24 heures après injection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.

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Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

Les ganglions lymphatiques sont les tissus immunologiques qui orchestrent la réponse immunitaire et constituent une cible critique pour les vaccins. Des biomatériaux ont été utilisés pour mieux cibler les ganglions lymphatiques et contrôler l’administration d’antigènes ou d’adjuvants. Cet article décrit une technique combinant ces idées pour injecter des particules de polymère biocompatibles dans les ganglions lymphatiques.

Injection intra-lymphatique de particules de polymère biodégradables

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

intra-lymph-node-injection-of-biodegradable-polymer-particles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.3K vues.  University of Maryland, College Park. Les ganglions lymphatiques sont les tissus immunologiques qui orchestrent la réponse immunitaire et constituent une cible critique pour les vaccins. Des biomatériaux ont été utilisés pour mieux cibler les ganglions lymphatiques et contrôler l’administration d’antigènes ou d’adjuvants. Cet article décrit une technique combinant ces idées pour injecter des particules de polymère biocompatibles dans les ganglions lymphatiques.

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A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Un piège hydrodynamique microfluidique à base de particules uniques

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

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Bio-ingénierie

A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures can act as a nidus for infection and in many procedures are unable to effect wound repair or interfere with functional tissue regeneration.1 Surgical glues and adhesives, such as those based on fibrin and cyanoacrylates, have been developed as alternatives to sutures for the repair of such wounds. However, current commercial adhesives also have significant disadvantages, ranging from viral and prion transfer and a lack of repair strength as with the fibrin glues, to tissue toxicity and a lack of biocompatibility for the cyanoacrylate based adhesives. Furthermore, currently available surgical adhesives tend to be gel-based and can have extended curing times which limit their application.2 Similarly, the use of UV lasers to facilitate cross-linking mechanisms in protein-based or albumin 'solders' can lead to DNA damage while laser tissue welding (LTW) predisposes thermal damage to tissues.3 Despite their disadvantages, adhesives and LTW have captured approximately 30% of the wound closure market reported to be in excess of US $5 billion per annum, a significant testament to the need for sutureless technology.4
In the pursuit of sutureless technology we have utilized chitosan as a biomaterial for the development of a flexible, thin film, laser-activated surgical adhesive termed 'SurgiLux'. This novel bioadhesive uses a unique combination of biomaterials and photonics that are FDA approved and successfully used in a variety of biomedical applications and products. SurgiLux overcomes all the disadvantages associated with sutures and current surgical adhesives (see Table 1).
In this presentation we report the relatively simple protocol for the fabrication of SurgiLux and demonstrate its laser activation and tissue weld strength. SurgiLux films adhere to collagenous tissue without chemical modification such as cross-linking and through irradiation using a comparatively low-powered (120 mW) infrared laser instead of UV light. Chitosan films have a natural but weak adhesive attraction to collagen (~3 KPa), laser activation of the chitosan based SurgiLux films emphasizes the strength of this adhesion through polymer chain interactions as a consequence of transient thermal expansion.5 Without this 'activation' process, SurgiLux films are readily removed.6-9 SurgiLux has been tested both in vitro and in vivo on a variety of tissues including nerve, intestine, dura mater and cornea. In all cases it demonstrated good biocompatibility and negligible thermal damage as a consequence of irradiation.6-10

A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, &#039;SurgiLux&#039;: Preparation and Demonstration

The fabrication of a novel, flexible thin film surgical adhesive from FDA approved ingredients, chitosan and indocyanine green is described. Bonding of this adhesive to collagenous tissue through a simple activation process with a low-powered infra-red laser is demonstrated.

Un Based Chitosan, Laser adhésif activé Thin Film chirurgicaux, «SurgiLux &#39;: Préparation et démonstration

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Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polymères pour la découverte à haut débit des biomatériaux

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protocole pour l&#39;évaluation hydrodynamique relative de Vannes polymères tri-leaflet

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Les cellules souches de programmation pour angiogenèse thérapeutique utilisant polymère biodégradable nanoparticules

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Manufacturing Of Robust Natural Fiber Preforms Utilizing Bacterial Cellulose as Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose and short sisal fibers are dispersed into a water suspension containing bacterial cellulose. The fiber and nanocellulose suspension is then filtered (using vacuum or gravity) and the wet filter cake pressed to squeeze out any excess water, followed by a drying step. This will result in the hornification of the bacterial cellulose network, holding the loose natural fibers together.
Our method is specially suited for the manufacturing of rigid and robust preforms of hydrophilic fibers. The porous and hydrophilic nature of such fibers results in significant water uptake, drawing in the bacterial cellulose dispersed in the suspension. The bacterial cellulose will then be filtered against the surface of these fibers, forming a bacterial cellulose coating. When the loose fiber-bacterial cellulose suspension is filtered and dried, the adjacent bacterial cellulose forms a network and hornified to hold the otherwise loose fibers together.
The introduction of bacterial cellulose into the preform resulted in a significant increase of the mechanical properties of the fiber preforms. This can be attributed to the high stiffness and strength of the bacterial cellulose network. With this preform, renewable high performance hierarchical composites can also be manufactured by using conventional composite production methods, such as resin film infusion (RFI) or resin transfer molding (RTM). Here, we also describe the manufacturing of renewable hierarchical composites using double bag vacuum assisted resin infusion.

We present a novel method of manufacturing rigid and robust short natural fiber preforms using a papermaking process. Bacterial cellulose acts simultaneously as the binder for the loose fibers and provides rigidity to the fiber preforms. These preforms can be infused with a resin to produce truly green hierarchical composites.

Fabrication robuste préformes à fibres naturelles Utilisant bactérienne Cellulose Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant adhesion strength than commercial tissue adhesives. Medical adhesives have attracted great attention as potential alternative tools to sutures and staples due to their convenience in usage with minimal invasiveness. Although there are several protocols for developing tissue adhesives including those commercially available such as fibrin glues and cyanoacrylate-based materials, mostly they require a series of chemical syntheses of organic molecules, or complicated protein-purification methods, in the case of bio-driven materials (i.e., fibrin glue). Also, the development of surgical glues exhibiting high adhesive properties while maintaining biodegradability is still a challenge due to difficulties in achieving good performance in the wet environment of the body. We illustrate a new method to prepare a medical glue, known as TAPE, by the weight-based separation of a water-immiscible supramolecular aggregate formed after a physical mixing of a plant-derived, wet-resistant adhesive molecule,&#160;Tannic Acid (TA), and a well-known biopolymer, Poly(Ethylene) glycol (PEG). With our approach, TAPE shows high adhesion strength, which is 2.5-fold more than commercial fibrin glue in the presence of water. Furthermore, TAPE is biodegradable in physiological conditions and can be used as a potent hemostatic glue against tissue bleeding. We expect the widespread use of TAPE in a variety of medical settings and drug delivery applications, such as polymers for muco-adhesion, drug depots, and others.

We describe the simplest protocol to prepare biodegradable medical glue that has an effective hemostatic ability. TAPE is a water-immiscible supramolecular aggregate prepared by mixing of tannic acid, a ubiquitous compound found in plants, and poly(ethylene) glycol, yielding a 2.5 times greater water-resistant adhesion compared with commercial fibrin glue.

TAPE: A Biodégradable hémostatique Glue Inspiré par un composé ubiquitaire dans les plantes pour l&#39;application chirurgicale

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Sustained Administration of &amp;#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets &lt;em&gt;Ex Vivo&lt;/em&gt; Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Administration soutenue de mitogenes β-cellules à Intact Islets souris<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Utilisation Biodegradable poly (acide lactique-co-glycolique) Microsphères

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.