Les auteurs tiennent à remercier l&#39;American Heart Association nationale de subvention au développement scientifique (10SDG2600001), X Bio-programme Stanford interdisciplinaire Initiative, et de recherche de Stanford chercheurs médicaux de financement.

Une. Polymer Synthesis <ol><li> Dans une hotte, peser 3,523 mg de diacrylate de butanediol (C) et de les transférer dans un flacon à scintillation en verre contenant un barreau d&#39;agitation. </li><li> Préchauffer le 5-amino-1-pentanol (32) à 90 ° C pour solubiliser le sel, puis dans une hotte de laboratoire, peser 1,533 mg 32 et l&#39;ajouter dans le flacon de scintillation contenant C. Cette méthode se traduira par un rapport molaire C: 32 = 1:1,2. </li><li> Placer immédiatement la fiole contenant à la fois des solutions sur une plaque d&#39;agitation. Réglez la vitesse d&#39;agitation à 600 tours par minute. </li><li> Transférer le flacon à scintillation à un four réglé à 90 ° C. Réglez la vitesse d&#39;agitation à 1000 rpm pendant 4 heures. Si la barre d&#39;agitation se coince, réduire la vitesse. Après 4 h, la vitesse inférieure à 300 tours par minute et maintenir à 90 ° C pendant 12 à 16 une autre heure. </li><li> Ajouter 5 g de C32 à 10 ml de tétrahydrofuranne (THF) anhydre dans un flacon à scintillation en verre contenant un barreau d&#39;agitation. Envelopper dans du papier d&#39;aluminium et vortex en haut jusqu&#39;à dissolution complète. </li><li> Dans un flacon en verre scintillation conta séparéeining une barre d&#39;agitation, ajouter 10 mM de Tetraethyleneglycoldiamine (122). Ajouter 40 ml de THF. </li><li> Placer les deux flacons (C32 et 122) sur une plaque d&#39;agitation pendant 5 min, puis combinent ensemble. Couvrir d&#39;une feuille et laisser à température ambiante sous agitation à 400 tours par minute pendant 24 heures. Le produit final est appelé C32-122. </li><li> Peser 5 x 50 ml tubes Falcon pour chaque lot de 5 g C32-122. Noter la masse de chaque tube dans un cahier. </li><li> Transférer 30 ml d&#39;éther diéthylique anhydre à chaque tube Falcon de 50 ml. </li><li> Transférer 10 ml de C32-122 à chaque tube Falcon de 50 ml. </li><li> Tubes Vortex Falcon vigoureusement puis centrifuger à 2500 rpm pendant 2 min. Remarque: Le polymère extrait recueillera, à la base du tube. </li><li> Jeter la solution supérieure et répétez les étapes 1.9 et 1.11 deux fois de plus. </li><li> Placer les tubes ouverts contenant le C32-122 extrait dans le dessiccateur et vide pendant une nuit. S&#39;assurer que tous les tubes sont protégés de la lumière. </li><li> Peser tous les tubes contenant du C32-122 pour déterminer la masse finale de l&#39;polymère extrait. </li><li> Dissoudre le polymère extrait dans du DMSO anhydre à une concentration de 100 mg / ml. </li><li> Rangez le polymère dissous à -20 ° C à l&#39;abri de la lumière et de l&#39;humidité. </li></ol> 2. Cellule de semis <ol><li> Pré-couche de la base d&#39;un ballon de culture de tissu T-150 à 0,1% (poids / volume) de gélatine. La gélatine doit rester dans la fiole pendant 30 à 45 min. Le revêtement de la gélatine permet l&#39;adhérence de ADSC. </li><li> Aspirer la gélatine du flacon T-150 pré-enduit. </li><li> Ajouter 4 x 10 6 ADSC (≤ 3), passage dans le ballon dans 20 ml de DMEM contenant 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine et 10 ng / ml de bFGF. </li><li> Placer la fiole T-150 dans l&#39;incubateur à 37 ° C, 5% de CO2 pendant une nuit. </li><li> Début de la procédure de transfection, le jour suivant. </li></ol> 3. Préparation de nanoparticules et transfection <ol><li> La procédure suivante concerne la préparation de nanoparticules contenant de l&#39;ADN de plasmide de 16,1 ug par1,0 x 10 6 cellules à un polymère de plasmide rapport en poids de 30:1. </li><li> Diluer l&#39;ADN plasmidique (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) à une concentration finale de 120 pg / ml dans de l&#39;acétate de sodium (25 mM) dans un tube Falcon de 15 ml. </li><li> Diluer C32-122 (100 mg / ml) jusqu&#39;à une concentration finale de 3,6 mg / ml dans de l&#39;acétate de sodium (25 mM) dans 15 ml d&#39;un deuxième tube Falcon. </li><li> Mélanger le contenu de chaque tube Falcon dans un seul tube de 15 ml de faucon et vortex immédiatement en haut pendant 10 secondes. </li><li> Laissez le tube reposer à température ambiante pendant 10 min pour la formation des nanoparticules à se produire. </li><li> Alors que l&#39;incubation, remplacer moyenne flacon de culture tissulaire avec du DMEM 7,8 ml entièrement complété par 1,0 x 10 6 cellules transfectées. </li><li> Transférer la solution de nanoparticules dans le flacon de culture de tissus et basculer vers l&#39;avant et vers l&#39;arrière pour répartir uniformément. </li><li> Placer le ballon de culture tissulaire dans l&#39;incubateur à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 4 heures. </li><li> Après 2 h, remplacer le nanoparticle contenant médias avec du DMEM. </li><li> Après une nouvelle incubation de 2 h à 37 ° C, 5% CO2, les cellules sont prêtes pour l&#39;injection in vivo. </li></ol> 4. Des membres postérieurs procédure ischémie <ol><li> Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec les soins et l&#39;utilisation des animaux Directives du Comité de l&#39;Université de Stanford et protocoles APLAC approuvés. Générer le modèle murin de la patte arrière ischémie est réalisée comme décrit précédemment. 8 S&#39;il vous plaît se référer à la référence pour des instructions détaillées. Une brève description est fournie ci-dessous. </li><li> Placer la souris sous anesthésie avec 1-3% d&#39;isoflurane dosage par inhalation et le débit d&#39;oxygène de 1 L / min. Assurer profondeur de l&#39;anesthésie par pincement de l&#39;orteil, la réduction de la fréquence respiratoire, et la léthargie. </li><li> Enlever les poils de la région abdominale et les deux zones de la patte arrière de la souris avec de la crème à raser. </li><li> Faire une incision au centre de la médiane de la cuisse vers la ligne médiane, puis couper à travers recouvrant coussinet adipeux à l&#39;exposer l&#39;artère fémorale. </li><li> Ligaturer l&#39;artère à deux sites: le site distale (près du genou) et le site proximal (juste en aval du ligament inguinal). </li><li> Pour créer les ligatures, séparer l&#39;artère de la veine et enfiler une suture en soie 5-0 autour de l&#39;artère. Nouez l&#39;artère avec deux noeuds de faire la ligature. </li><li> Retirer l&#39;artère entre les deux points de ligature. </li><li> Laver la zone chirurgicale avec de la PBS, puis suturer l&#39;incision fermée. </li><li> L&#39;anesthésie peut être retiré. Garder au chaud de la souris jusqu&#39;à ce que re-réveil. Pour les soins post-opératoires, 2-4 mg / kg de lidocaïne peut être injecté par voie sous cutanée au site d&#39;incision avant de re-réveil. Gestion plus de la douleur peut inclure administration sous-cutanée de 0,05-0,1 mg / kg buprénorphine à 12 et 24 h. Surveillance de l&#39;état de santé des souris une fois par jour pendant sept jours en observant les changements dans le modèle de la respiration, de la douleur ou de détresse manifeste, et la couleur de la peau. </li><li> Confirmez membres postérieurs ischémie par laser Doppler imagerie de perfusion.</li></ol> 5. Les injections de cellules <ol><li> Lorsque les cellules transfectées et les souris sont prêts, laver les cellules transfectées avec PBS, trypsiniser, centrifugeuse, puis compter. </li><li> Remettre en suspension les cellules à une densité de 10 x 10 6 cellules par ml dans du PBS. </li><li> Les suspensions cellulaires doivent être séparés dans des tubes Eppendorf distinctes en un volume de 110 ul. Cela permettra d&#39;assurer que chaque souris reçoit une quantité égale de cellules. </li><li> Placer chaque souris sous anesthésie (isoflurane à 2,5%, débit de 1 L / min d&#39;oxygène). </li><li> Nettoyez le site d&#39;injection avec des lingettes alcoolisées. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une seringue à tuberculine de 27 G, tirer les cellules vers le haut et vers le bas dans la seringue pour assurer une suspension homogène. Dresser 100 ul de volume de suspension de cellules dans la seringue. </li><li> Injecter la moitié de la suspension cellulaire dans la région du muscle adducteur, puis injecter l&#39;autre moitié dans la région des muscles du mollet. Après l&#39;injection, laissez la seringue en place pendant au moins 15-30 secondes pourempêcher la fuite de la suspension de cellules. </li><li> Des contrôles appropriés pour l&#39;étude des animaux comprennent: 1) des cellules transfectées avec un plasmide non codante (par exemple, plasmide sans aucune activité biologique), 2) les cellules seules, et 3) PBS. </li><li> Quand injections sont terminées, retirez la souris de l&#39;anesthésie et garder au chaud jusqu&#39;à ce que les re-se réveille de souris. </li></ol> 6. Bioluminescence Imaging <ol><li> Pour débuter l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI), anesthésier les souris comme décrit ci-dessus. </li><li> Nettoyez le site d&#39;injection avec des lingettes alcoolisées. </li><li> En utilisant une seringue à insuline, charge de 100 ul de 15 mg / ml D-luciférine (substrat pour la luciférase de luciole). Gardez substrat abri de la lumière. </li><li> Pour effectuer des injections intra-péritonéales, maintenez la souris par la peau du dos pour tirer leur peau tendue antérieure. Insérez l&#39;aiguille par voie intrapéritonéale dans la région abdominale et injecter 100 ul de substrat. </li><li> Placer la souris dans la chambre d&#39;imagerie IVIS de la luciférase sous anesthésie. </li><li&gt; l&#39;image de la souris avec un temps d&#39;exposition de 1,0 min. Lorsque les paramètres sont définis, de commencer à acquérir des images. </li><li> Lorsque l&#39;image est acquise, marquer la zone d&#39;intérêt de mesurer le signal de la luciférase. Dans ce cas, marquer le membre ischémique au site cellulaire injection. </li><li> Continuer à mesurer le signal de la luciférase chaque 3-5 min jusqu&#39;à ce que le signal atteint un pic et commence à décliner. C&#39;est la valeur utilisée pour la comparaison entre les souris et sur plusieurs points dans le temps. </li><li> Lorsque vous avez terminé, retirez les souris de la chambre et de l&#39;anesthésie. Gardez la souris chaude jusqu&#39;à ce que re-réveil. </li></ol> 7. Perfusion Laser Doppler Imaging <ol><li> Laser Doppler imagerie de perfusion est réalisée comme décrit précédemment. 8 La procédure est décrite brièvement ici. </li><li> Avant imagerie Doppler de la souris doit être rasé dans les zones recouvrant les deux membres postérieurs et la région abdominale pour éviter artefact dû à cheveux. </li><li> Lorsqu&#39;il est préparé à l&#39;image Doppler, le mousoi doit être anesthésiée comme décrit ci-dessus. </li><li> Réchauffer la souris à 36 ° C sur une plaque chauffante tout en surveillant la température du corps par un thermomètre rectal. </li><li> Placez la souris sur une surface noire non réfléchissante et garder anesthésié par cône. La souris doit être placée sur la face dorsale de ses membres exposés uniformément. </li><li> Positionner le détecteur laser Doppler à environ 15 cm au-dessus de la souris et de diriger le pointeur laser du capteur vers la région de l&#39;aine de la souris. </li><li> Lorsque la souris et le capteur de Doppler sont en position, les images peuvent être prises en utilisant le logiciel LDPIwin en appuyant sur le bouton Démarrer. </li><li> Mesures de perfusion relatifs pourraient être prises par les deux membres postérieurs indiquant (ischémiques et non ischémiques) comme région d&#39;intérêts (ROI). Le rapport de perfusion moyenne du membre postérieur ischémique de la non-ischémique indiquera perfusion relative. </li></ol> 8. Tissu procédure de récolte <ol><li> Lorsqu&#39;il est préparé à tis récolte de la sourispoursuivre pour l&#39;histologie et / ou la transformation biochimique, la souris devrait être euthanasié. Ici, la souris est euthanasié en exposant à 5% d&#39;isoflurane pendant 3-5 min, puis euthanasier la souris par dislocation cervicale. </li><li> Coupez la peau recouvrant entourant la circonférence des membres postérieurs à la région abdominale distale et proximale de la patte arrière. La peau est découpé à partir de la face ventrale de la surface dorsale, de sorte que la peau peut être tiré vers l&#39;arrière au-dessus de la patte arrière pour le pied. </li><li> Sur tirant la peau du dos, la branche pourrait être amputé en utilisant des ciseaux de dissection à couper à l&#39;articulation pelvienne et du fémur. </li><li> Deux principaux tissus sont prélevés pour analyse: les muscles adducteurs médianes et les muscles jumeaux. </li><li> Pour l&#39;histologie, incorporer un ou deux tissus de la température de coupe optimale (OCT) pour cryosectioning. </li><li> Pour l&#39;analyse biochimique, recueillir une ou des deux tissus dans un Eppendorf de 1,5 ml et immerger dans un bain d&#39;azote liquide pendant au moins 2 min. Les échantillons peuvent êtrestockés à -80 ° C pour traitement ultérieur. </li></ol>

<ol>
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Med. 10, 858-864 (2004).</li><li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+of+mesenchymal+stem+cell+tropism+for+tumor+and+wounding+microenvironments+using+in+vivo+bioluminescent+imaging.">Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging.</a> Stem Cells. 27, 2614-2623 (2009).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+end-groups+of+linear+polymer+determine+cell-type+gene-delivery+efficacy.">Small-molecule end-groups of linear polymer determine cell-type gene-delivery efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947-4951 (2009).</li><li>Sunshine, J. C., Akanda, M. I., Li, D., Kozielski, K. L., Green, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+molecular+weight+of+amine+end-modified+poly(beta-amino+ester)s+on+gene+delivery+efficiency+and+toxicity.">Effect of molecular weight of amine end-modified poly(beta-amino ester)s on gene delivery efficiency and toxicity.</a> Biomaterials. 33, 3594-3603 (2012).</li><li>Glover, D. J., Lipps, H. J., Jans, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+safe,+non-viral+therapeutic+gene+expression+in+humans.">Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 299-310 (2005).</li><li>Dave, U. P., Jenkins, N. A., Copeland, N. 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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous rapportons ici une méthode pour programmer des cellules souches adultes pour surexprimer facteurs thérapeutiques utilisant non viraux, des nanoparticules biodégradables. Cette plate-forme est particulièrement utile pour le traitement de maladies où les cellules souches peuvent naturellement à la maison, tels que l&#39;ischémie et du cancer. 10.9 En outre, le non-viral plate-forme de délivrance de gène permet la surexpression transitoire de facteurs thérapeutiques, ce qui convient pour la plupar...

L&#39;objectif global de cette technique est de promouvoir l&#39;angiogenèse thérapeutique utilisant des cellules souches non-virale programmées surexprimant facteurs thérapeutiques au site de l&#39;ischémie. Les cellules souches ont été modifiées ex vivo en utilisant d&#39;abord des nanoparticules biodégradables synthétisés dans le laboratoire, et ensuite transplantées dans un modèle murin de la patte arrière ischémie pour valider leur potentiel de développement de l&#39;angiogenèse et de sauvetage de tissu. La croissance vasculaire contrôlée, est un composant important de la régénération des tissus succès, ainsi que pour le traitement de diverses maladies ischémiques telles que l&#39;accident vasculaire cérébral, une ischémie des membres, et l&#39;infarctus du myocarde. Plusieurs stratégies ont été développées pour favoriser la croissance vasculaire, y compris la fourniture d&#39;un facteur de croissance et de la thérapie à base de cellules. Une Malgré l&#39;efficacité observée dans les modèles de maladies animales, ces procédés font toujours face à des limitations telles que la nécessité de doses supra-physiologiques pour la livraison d&#39;un facteur de croissance, ou insuffisante paracrinelibérer de cellules seules. Une stratégie possible pour surmonter les limitations ci-dessus est de combiner la thérapie des cellules souches et la thérapie génique, par laquelle les cellules souches sont programmés génétiquement ex vivo avant la transplantation de surexprimer facteurs thérapeutiques souhaitables. Cette approche a été démontrée dans divers modèles de maladies, y compris des membres postérieurs ischémie 2, les maladies du cœur 3, la cicatrisation osseuse 4 et 5 lésion neurologique, etc. Cependant, la plupart des techniques de thérapie génique s&#39;appuient sur des vecteurs viraux, qui sont associés à des problèmes de sécurité tels que l&#39;immunogénicité potentielle et la mutagenèse insertionnelle. Biomatériaux médiation livraison de gène non viral peuvent surmonter ces limitations, mais souffrent souvent de faible efficacité de la transfection. Pour accélérer la découverte de nouveaux biomatériaux pour la livraison de gène non viral efficace, des études récentes ont utilisé la chimie combinatoire et de l&#39;approche de criblage à haut débit. Bibliothèques de polymères biodégradables tels que le poly (es β-aminotres) (PBAE) ont été développés et masquées, ce qui a conduit à la découverte des principaux polymères avec nettement amélioré l&#39;efficacité de la transfection par rapport aux produits traditionnels de vecteurs polymères. 6-7 Nous décrivons ici la synthèse de PBAE et la vérification de leur aptitude à transfecter des cellules souches du tissu adipeux (ADSC) in vitro, suivie d&#39;une greffe ultérieure de ADSC génétiquement modifiées surexprimant le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) dans un modèle murin de membre postérieur ischémie . Les résultats ont été évalués par le suivi le destin des cellules en utilisant l&#39;imagerie par bioluminescence, l&#39;évaluation de la reperfusion tissulaire en utilisant laser Doppler imagerie de perfusion (LDPI), et la détermination de l&#39;angiogenèse et de tissus de récupération par l&#39;histologie.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
				Name of the Reagent</td>
			<td>
				Company</td>
			<td>
				Catalogue Number</td>
			<td>
				Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				DMEM</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				11965</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Fetal Bovine Serum</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				10082</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				15070</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>
				Peprotech</td>
			<td>
				100-18B</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				1,4-Butanediol Diacrylate (90%)</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				411744</td>
			<td>
				Acronym: C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				5-amino-1-pentanol (97%)</td>
			<td>
				Alfa Aesar</td>
			<td>
				2508-29-4</td>
			<td>
				Acronym: 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Tetraethyleneglycoldiamine &gt;99%)</td>
			<td>
				Molecular Biosciences</td>
			<td>
				17774</td>
			<td>
				Acronym: 122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Sodium Acetate</td>
			<td>
				G-Biosciences</td>
			<td>
				R010</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				14190-144</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Tetrahyofuran Anhydrous (&gt;99.9%)</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				401757</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Diethyl Ether Anhydrous (&gt;99%)</td>
			<td>
				Fisher Scientific</td>
			<td>
				E138-4</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				DMSO Anhydrous (&gt;99.9%)</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				276855</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Gelatin</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				G9391</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Trypsin-EDTA</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				25200</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				D-luciferin</td>
			<td>
				GoldBio</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Optimal Cutting Temperature (O.C.T)</td>
			<td>
				Tissue-Tek</td>
			<td>
				4583</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Rat anti-Mouse CD31</td>
			<td>
				BD Pharmingen</td>
			<td>
				550274</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Alexa Fluor 594 anti-rat IgG</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				A11007</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

	&nbsp;

programming stem cells for therapeutic angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles

La croissance vasculaire contrôlée, est critique pour la régénération des tissus et la cicatrisation des plaies avec succès, ainsi que pour le traitement de maladies ischémiques telles que l&#39;accident vasculaire cérébral, infarctus du myocarde ou les maladies artérielles périphériques. La livraison directe des facteurs de croissance angiogéniques a le potentiel de stimuler la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins, mais est souvent associée à des limitations telles que le manque de ciblage et la courte demi-vie in vivo. La thérapie génique offre une approche alternative par la délivrance de gènes codant pour des facteurs angiogéniques, mais nécessite souvent l&#39;aide de virus, et est limitée par des préoccupations de sécurité. Nous décrivons ici une stratégie récemment mis au point pour la stimulation de la croissance vasculaire par les cellules souches de programmation pour surexprimer des facteurs angiogéniques in situ en utilisant des nanoparticules polymériques biodégradables. Plus précisément notre stratégie utilisée cellules souches comme des véhicules de délivrance, en profitant de leur capacité à migrer vers les tissus ischémiques in vivo. En utilisant les vecteurs polymères optimisés, adipeux dérivésLes cellules souches ont été modifiées pour surexprimer un gène codant pour le facteur angiogénique de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Nous avons décrit les procédés pour la synthèse du polymère, la formation des nanoparticules, la transfection de cellules souches in vitro, ainsi que des procédés pour la validation de l&#39;efficacité des cellules souches exprimant VEGF pour la promotion de l&#39;angiogenèse dans un modèle d&#39;ischémie des membres postérieurs de souris.

Lors du mélange ensemble, le polymère chargé positivement (C32-122) et de l&#39;ADN plasmide s&#39;auto-assemble chargés négativement dans des nanoparticules. la formation de nanoparticules peut être confirmée par analyse par électrophorèse dire la complexation entre C32-122 et l&#39;ADN plasmidique permettra d&#39;éviter la mobilisation de l&#39;ADN lors de l&#39;électrophorèse. Le polymère sert de réactif de transfection pour faciliter l&#39;absorption accrue de l&#39;ADN dans les cellules cible...

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Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Nous décrivons la méthode des cellules souches de programmation pour surexprimer des facteurs thérapeutiques pour l&#39;angiogenèse en utilisant des nanoparticules polymériques biodégradables. Les procédés décrits comprennent la synthèse du polymère, la transfection de cellules souches du tissu adipeux in vitro, et de valider l&#39;efficacité des cellules souches programmées pour favoriser l&#39;angiogenèse dans un modèle d&#39;ischémie des membres postérieurs de souris.

Les cellules souches de programmation pour angiogenèse thérapeutique utilisant polymère biodégradable nanoparticules

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.0K vues.  Stanford University.  Nous décrivons la méthode des cellules souches de programmation pour surexprimer des facteurs thérapeutiques pour l'angiogenèse en utilisant des nanoparticules polymériques biodégradables. Les procédés décrits comprennent la synthèse du polymère, la transfection de cellules souches du tissu adipeux in vitro, et de valider l'efficacité des cellules souches programmées pour favoriser l'angiogenèse dans un modèle d'ischémie des membr...

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Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

Formulation de nanoparticules polymériques dibloc par la technique nanoprécipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Recherche

Bio-ingénierie

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Livraison de gènes et transfection de cellules humaines de cancer du pancréas en utilisant facteur de croissance épidermique ciblant les récepteurs des base de gélatine nanovecteurs Conçu

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Commande de cellules simples et simple Embryons en 3D Confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymère Microneedle tableau Fabrication par photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Superhydrophobes fabrication de matériaux polymères pour des applications biomédicales

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash Nanoprécipitation pour l’Encapsulation des composés hydrophobes et hydrophiles en nanoparticules polymériques

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Absorption de nouvelles nanoparticules lipides enduit contenant Falcarindiol par des cellules souches mésenchymateuses humaines

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...