Tous les auteurs ont contribué à la création et la validation de l&#39;essai présenté et le projet du manuscrit.

Tous les animaux des procédures expérimentales dans le protocole suivent les directives de protection des animaux de la Technische Universität München, Allemagne. 1. Médias / Préparation Extrait <ol><li> homogénéisation tissulaire La qualité de l&#39;homogénéisation du tissu est essentielle à la détection ultérieure d&#39;altérations neuroplastiques dans les neurones en culture. Ici, il est recommandé un homogénéisateur qui permet la dissociation des tissus sans augmentation importante de la température du tissu. <ol><li> Transférer 5 mm x 5 mm x 5 mm cubes de tissu pancréatique directement à partir de -80 ° C à l&#39;azote liquide et le placer dans une phase solide dans la homogenator tissulaire. Le homogenator idéal serait de dissocier le tissu assez vite, sans lui permettre de défiger. </li><li> Immédiatement après la dissociation, de remettre en suspension le, homogénat de poudre solide analogue à de 300 à 500 pi de 0,1 x tampon phosphate salin (PBS). Ici, ne pas utiliser de tampon de lyse (comme RIPA) car cela peut lyser les neurones.</li><li> Centrifuger les homogénats pendant au moins 15 min à la vitesse maximale du centrifugeuse de paillasse (par exemple de 21 130 xg). Recueillir le surnageant clair qui représente l&#39;extrait de tissu. </li></ol></li><li> Les surnageants de la lignée cellulaire <ol><li> Laisser les cellules d&#39;intérêt atteignent au moins 70 à 80% de confluence dans du milieu de croissance normal. </li><li> Habituellement, ces médias contiennent des composants sériques et peuvent exercer des effets incontrôlables sur la croissance neuronale. Par conséquent, après avoir atteint la densité cellulaire souhaitée, lavez-vous les cellules au moins 3x avec le grade de culture cellulaire PBS et les placer dans un milieu sans sérum (SFM) pour un maximum de 48 heures. Note: Ici, considèrent que certaines cellules (comme les cellules étoilées du pancréas) peuvent avoir besoin de sérum dans leur milieu de croissance afin de maintenir leur état ​​normal et la structure. Dans ce cas, effectuer des dilutions de sérum en série dans le milieu de la cellule d&#39;intérêt afin de trouver le contenu de sérum plus bas possible nécessaire pour foncti cellulaire intacten. </li><li> Mesurer la concentration en protéines de l&#39;homogénat de tissu ou de surnageants de cellules par l&#39;intermédiaire de dosage de protéine de Bradford. Bien que ces valeurs varient en fonction du type de tissu et de cellule, pour les extraits de tissus pancréatiques, on pourrait s&#39;attendre à une plage de concentration comprise entre 5 à 12 pg / pl, et de surnageants de lignées cellulaires entre 8.3 ug / ul. </li></ol></li></ol> 2. Aliquotes Extraits et surnageants cellulaires En fonction de la concentration pour être utilisée dans le dosage, la concentration finale de l&#39;extrait ou du surnageant dans le milieu neuronal devrait être de 100 pg / ml 5,8. Remarque: Pour un essai avec des neurones en croissance dans 500 ul de milieu dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits, on a besoin de 50 pg de protéine de l&#39;extrait ou du surnageant par puits. A une concentration typique de l&#39;extrait de l&#39;ordre de 10 pg / pl, il faudrait 5 ul de l&#39;extrait / surnageant de chaque puits. Dans tous les Réglagesg effectuée en trois exemplaires, cela correspondrait à 15 ul d&#39;extrait / surnageant. Pour les types de tissus ou de cellules différentes, effectuer des dilutions successives de l&#39;extrait final ou de la concentration de surnageant et de comparer les effets neurotrophiques observées entre les différentes concentrations d&#39;extrait / surnageant. 3. Isolement des neurones Une fois la collecte extrait / surnageant est terminée, continuer avec l&#39;isolement des neurones. <ol><li> Pour les neurones de DRG, de recueillir le col de l&#39;utérus à lombaire DRG de rats nouveau-nés entre le jour postnatal (P) 2-12 après la décapitation et la dissection stéréomicroscopique de DRG (figure 1A). Afin d&#39;avoir les neurones de DRG suffisantes pour une plaque de 24 puits, recueillir toutes cervicale lombaire DRG de rat nouveau-né un (égalant 52 DRG) par plaque. <ol><li> Coupez le périphérique (neurones) et les projections centrales (racines) de DRG au moyen d&#39;microciseaux. Laissant les projections en place empêche trituration et augmente til risque de contamination de la culture par les fibroblastes. </li></ol></li><li> Pour les neurones MP, couper le mésentère de l&#39;intestin grêle et manuellement et avec précaution dépouiller la couche séromusculaire de l&#39;intestin grêle (pour un protocole détaillé sur MP isolement, reportez-vous à Schäfer et al. 9, figure 1B). Pour le député, recueillir le plexus de deux rats par 24 plaques à puits. Remarque: Essayez d&#39;être aussi doux que possible afin d&#39;éviter les déchirures dans la couche séromusculaire car ils entravent sa séparation réussie de l&#39;intestin grêle. </li><li> Recueillir le DRG et séromusculaire couche dans un milieu essentiel minimal glacée (MEM) alimenté avec de la gentamicine (20 mg dans du milieu 500 ml) et de métronidazole (2,5 mg dans 500 ml de milieu). </li><li> Après la collecte de DRG, les incuber dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) alimentée avec de la collagénase de type II de 20 à 30 min. Pour le député isolement, incuber dans la collagénase de type entre 1-3 heures, en fonction de l&#39;âgede l&#39;animal (Figure 1C). </li><li> Pour le député, de recueillir les pièces en forme de filet MP sous binoculaire et transfert à l&#39;glacée MEM. </li><li> Puis triturer le DRG et MP par seringues avec la diminution de diamètre. Remarque: la trituration excessive peut détruire les neurones, mais moins les cellules gliales. </li><li> Une fois le milieu contenant le DRG ou MP est devenu nuageux, centrifuger la suspension à 93,9 g pendant 5 min, jeter le milieu et remettre en suspension dans un milieu Neurobasal (complété avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 0,5 mM L-glutamine et 2% de B-27). </li><li> Compter le nombre total de cellules (à savoir les neurones et les cellules gliales) au moyen d&#39;un hémocytomètre. Note: Le nombre de cellules nécessaires dépend du paramètre de mesure. Pour la quantification de la densité des neurites, on a besoin de cultures plus denses, et donc un plus grand nombre de cellules que pour la mesure de la croissance des neurites, la taille perikaryonalet patron de ramification des neurones individuels. Pour les mesures de densité de neurites, utiliser par exemple 10 000 cellules (neurones + gliales) / puits ou 1500 neurones / puits. Pour morphométrie sur les neurones individuels, bref (1 minute-long) trypsination des cellules et l&#39;ensemencement de 2500 cellules / puits ou 400 neurones / bien est recommandée. Le rendement typique de cellules obtenues à partir d&#39;un rat est d&#39;environ 300,000-500,000 cellules. </li><li> Ensemencer les cellules sur des lamelles de 13 mm qui ont été revêtus de la nuit avant et le haut des puits avec un milieu Neurobasal (supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 0,5 mM de L-glutamine et 2% B-27) (Figure 1D). Note: L&#39;utilisation de poly-D-lysine (40 mg / m 2) ou de l&#39;ornithine et la couverture des bordereaux de laminine (1 mg / ml chacun) enduit. Cellules attachent à la poly-D-lysine extrêmement rapide, ce qui rend approprié pour des expériences dans lesquelles de nombreuses cellules sont nécessaires (à savoir les mesures de densité de neurites). Attachement à la laminine est un généralce plus faible, mais la laminine est un ardent promoteur de la croissance des neurites. Par conséquent, pour les mesures sur ramification neuronale et la longueur des neurites, préférer ornithine / laminine-revêtement. </li><li> Autoriser les cellules attachent aux puits pendant la nuit. Le jour suivant, la préparation des milieux d&#39;extrait supplémenté (à une concentration finale d&#39;extrait / surnageant de 100 ug / ml). </li><li> Aspirer le milieu d&#39;ensemencement, et d&#39;effectuer un lavage en option, très doux avec du PBS, puis la pipette lentement le répertoire / media surnageant additionné extrait (figure 1E). </li><li> Laissez les cellules se développent pendant 48 heures. Aspirer les médias et fixer dans du paraformaldéhyde 4% pour immunomarquage (figure 1F). </li><li> Effectuer une double coloration par immunofluorescence en utilisant spécifiques des neurones (par exemple bêta-tubuline III) et les cellules gliales spécifiques (par exemple des cellules gliales fibriallary protéine acide / GFAP) marqueurs (figure 1G). </li><li> Pour morphométrie, utiliser un microscope optique inversé équipé d&#39;une caméra CCD en combinaison with logiciel automatisé qui permet de mesurer la densité des neurites (voir le tableau). </li><li> La densité des neurites des cultures de neurones est mesurée sur 4-5 microphotographies représentatives à 200x grossissement de quatre régions différentes de la plus dense croissance sur chaque lamelle couvre-objet en superposant un 50 um x 50 grille um et en comptant la densité des fibres par mètre carré mesurée dans les fibres qui se croisent. La croissance des neurites, le nombre de branches par neurone signifie, la durée moyenne de la branche et de la taille perikaryonal peuvent être mesurées à partir choisis au hasard 30 neurones solitaires de chaque lamelle en marquant les neurites et péricaryons (figure 1H). </li></ol>

<ol>
	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt concurrentes et aucune divulgation financière.

Le présent protocole est destiné à illustrer la méthodologie derrière le dosage de la neuroplasticité du pancréas in vitro qui a été récemment développée par notre groupe pour étudier les mécanismes de la plasticité synaptique dans CaP et CP 5. Le protocole implique une procédure de trois jours qui peut facilement être appliqué une fois l&#39;artiste a acquis une expérience suffisante dans l&#39;isolement et la culture de neurones DRG et MP. En outre, il représente un outil préci...

Altérations de la gastro-intestinale (GI) morphologie de nerf et de la densité ont attiré l&#39;attention des gastro-entérologues et les médecins depuis longtemps, mais leur pertinence pour la physiopathologie de maladies gastro-intestinales reste inconnue 1-3. En effet, plusieurs troubles digestifs très courantes telles que la gastrite, oesophagite par reflux, la colite, la diverticulite, l&#39;appendicite et sont associés à une augmentation de densité d&#39;innervation dans les zones de tissu enflammés 1. Cependant, aucune véritable attention a jusqu&#39;ici été accordée aux mécanismes et la signification de la neuroplasticité dans le tractus gastro-intestinal. Ne nerfs GI morphologiquement modifiées diffèrent des nerfs GI normales, c&#39;est à dire l&#39;état normal du système nerveux entérique, en termes de leur fonction? Quelles sont les implications de contenu modifié neuropeptide / neurotransmetteur dans les nerfs entériques plastique? Est-ce que la neuroplasticité périphérique n&#39;entraîne toujours signalisation modifié pour le système nerveux central? Et où sont les projections centrales de extri plastiqueNSIC voies gastro-neurones? Une longue série de ces questions clés peut être facilement généré lors de la recherche à la rareté de nos connaissances sur les aspects fonctionnels de la GI neuroplasticité. L&#39;étude de GI neuroplasticité au niveau fonctionnel nécessite des modèles expérimentaux valides, reproductibles et encore facilement applicables. Dans l&#39;ère de la popularité et l&#39;acceptation de modèles génétiquement modifiés de souris conditionnelles (GECoMM), comme dans les milieux in vivo portent le potentiel pour élucider facettes jusque-là inconnues de GI neuroplasticité dans un mode réaliste 1. Cependant, la conception et la production de GECoMM reste coûteuse, main-d&#39;œuvre et, surtout, beaucoup de temps. De plus, ils nécessitent la sélection a priori de la cible à condition modulée chez la souris génétiquement modifiée (par exemple, de la surexpression transgénique de facteur de croissance nerveuse / NGF dans les cellules épithéliales intestinales). Ainsi, pour le DESign d&#39;un GECoMM succès, les chercheurs ont besoin de certains indicateurs (par exemple, les données expérimentales précédentes) d&#39;une cible valable, à savoir que la molécule d&#39;intérêt (ici NGF) peut au moins s&#39;attendre à exercer certains effets biologiques pertinents sur les nerfs de GI. De tels indicateurs peuvent facilement être obtenus à partir adéquate des modèles in vitro, dans lequel les sous-types de cellules isolées à partir du micro-environnement complexe d&#39;un système in vivo peuvent être co-cultivées de façon sélective d&#39;une manière hétérotypique 7.4. La modulation de cibles moléculaires dans un tel contexte de culture hétérotypique est en moyenne techniquement moins lourde, plus rapide, et peut donc aider à la pré-filtrage des cibles intéressantes pour la vérification dans les études in vivo. Récemment, nous avons présenté un test in vitro de la plasticité synaptique dans lequel a été conçu pour simuler la densité neuronale accrue et une hypertrophie de ne intrapancréatiquerves dans le cancer pancréatique humaine (cancer de la prostate) et pancréatite chronique (PC) tissus. Ici, les neurones dérivés de nouveau-né dorsale de rat ganglions de la racine (DRG) ou plexus myentérique (MP) ont été exposées à des extraits de tissus de cancer de la prostate subi une résection chirurgicale ou CP tissus spécimens et comparées à celles cultivées dans du pancréas humain normal (NP) des extraits de tissu 5. Au lieu d&#39;extraits de tissus, on peut aussi utiliser surnageants de lignées cellulaires pour étudier l&#39;impact de différents types de cellules sélectionnées sur la neuroplasticité. Lorsqu&#39;il est combiné avec une mesure morphométrique normalisé, le dosage de la neuroplasticité présentée permet une évaluation valide et reproductible de la plasticité neuronale en réponse à différents micro-environnements du pancréas. En particulier, elle permet la simulation d&#39;une) neuroplasticité morphologique, c&#39;est à dire l&#39;évolution de la croissance des neurites, motif de ramification et de la taille des neurones, et 2) la plasticité synaptique fonctionnelle, c&#39;est à dire des altérations de l&#39;excitabilité des neurones périphériques. En outre, non seulement périphérique (c.-à- </em&gt; Entérique), mais aussi central (par exemple la moelle DRG ou second ordre) des neurones peut être inclus dans le présent dosage pour évaluer leur réaction morphologique et fonctionnelle à des contenus différents de tissu gastro-intestinal. Dans le tutoriel vidéo présente, nous démontrons le protocole technique pour la réalisation de ce test et de discuter de ses avantages et ses faiblesses. En outre, nous attirons l&#39;attention sur l&#39;applicabilité de la notion de base de cette analyse à l&#39;étude de la plasticité synaptique dans n&#39;importe quel organe de GI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P1149</td>
			<td style="width:328px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ornithine/laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2533/L4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13mm coverslips</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>For use in 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dismembranator S</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Beta-III-tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1637</td>
			<td>1:200 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP-antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0761</td>
			<td>1:400 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RIPA buffer + protease inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin/Metronidazol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimal essential medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>31095-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>24020133</td>
			<td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>Obtain lots with at least 200U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA 0,25%</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analySIS docu software</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

Neuroplasticité est une caractéristique inhérente du système et gastro-intestinal (GI) innervation nerveux entérique dans des conditions pathologiques. Cependant, le rôle physiopathologique de la neuroplasticité dans les troubles gastro-intestinaux reste inconnue. Modèles expérimentaux nouveaux qui permettent la simulation et la modulation de GI neuroplasticité peuvent permettre une meilleure appréciation de la contribution de la neuroplasticité en particulier les maladies gastro-intestinales telles que le cancer du pancréas (CaP) et pancréatite chronique (PC). Ici, nous présentons un protocole pour la simulation de la neuroplasticité du pancréas dans des conditions in vitro utilisant des nouveau-nés dorsale de rat ganglions de la racine (DRG) et plexus myentérique (MP) neurones. Cette double approche permet non seulement neurone suivi de deux neuroplasticité organe intrinsèque et extrinsèque, mais représente également un outil précieux pour évaluer la morphologie des neurones et des cellules gliales et l&#39;électrophysiologie. De plus, il permet la modulation fonctionnelle des matières microenvironnement fournis pour l&#39;étude de leur impact sur la neuroplasticité. Une fois établi, le dosage de la neuroplasticité porte présente le potentiel d&#39;être applicable à l&#39;étude de la plasticité synaptique dans un organe digestif.

Neuroplasticité morphologique Dans l&#39;intervalle indiqué par âge de rats nouveau-nés (P2-12) et les densités de semis, les neurones MP et DRG construisent déjà des réseaux neuronaux denses après 48 heures (figure 2A). Comparaison de la densité des neurites entre les neurones cultivés en PCa, CP, et des extraits NP révèle une plus grande densité des neurites des neurones DRG en PCa ou extraits de CP dans des extraits de NP (Figure 2A)</strong...

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Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Plasticité neuronale est une caractéristique de plus en plus reconnue, mais mal compris de la gastro-intestinal (GI). Ici, dans l&#39;exemple de troubles pancréatiques humaines, nous présentons un dosage in vitro de la plasticité synaptique pour l&#39;étude de la plasticité neuronale dans le tractus gastro-intestinal à la fois au niveau morphologique et fonctionnelle.

Simulation pancréatique neuroplasticité:<em&gt; In Vitro</em&gt; Double-neurone Plasticité Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

simulating-pancreatic-neuroplasticity-vitro-dual-neuron-plasticity

Research

JoVE Journal

Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

9.7K vues.  Technische Universität München.  Plasticité neuronale est une caractéristique de plus en plus reconnue, mais mal compris de la gastro-intestinal (GI). Ici, dans l'exemple de troubles pancréatiques humaines, nous présentons un dosage in vitro de la plasticité synaptique pour l'étude de la plasticité neuronale dans le tractus gastro-intestinal à la fois au niveau morphologique et fonctionnelle. 

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In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

Test in vitro avec dégagement mésothéliales que les modèles les étapes précoces de métastases du cancer de l&#39;ovaire

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

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Médecine

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio based cues and set within the context of a video game metaphor, users gather relevant spatial information regarding a building's layout. This allows the user to develop an accurate spatial cognitive map of a large-scale three-dimensional space that can be manipulated for the purposes of a real indoor navigation task. After game play, participants are then assessed on their ability to navigate within the target physical building represented in the game. Preliminary results suggest that early blind users were able to acquire relevant information regarding the spatial layout of a previously unfamiliar building as indexed by their performance on a series of navigation tasks. These tasks included path finding through the virtual and physical building, as well as a series of drop off tasks. We find that the immersive and highly interactive nature of the AbES software appears to greatly engage the blind user to actively explore the virtual environment. Applications of this approach may extend to larger populations of visually impaired individuals.

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind.

Développement d&#39;un environnement Audio-based jeux virtuels pour aider avec des compétences de navigation dans les aveugles

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

Un modèle murin de la moelle épinière cervicale blessures à étude post-lésionnelle respiratoire neuroplasticité

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-réseau d&#39;électrodes enregistrements des droits de l&#39;épilepsie post-opératoire corticale tissus

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Évaluation de l&#39;encéphalopathie spongiforme transmissible barrières d&#39;espèces avec une<em&gt; In Vitro</em&gt; Test Prion de conversion des protéines

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &amp;#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

Un haut contenu<em&gt; In vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cellulaire Plateforme de découverte de la réplication

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of pancreatic body. With technological development, the robotic surgical system has shown its advantage in minimally invasive surgery and been increasingly applied in central pancreatectomy. However, reconstruction of the continuity of pancreas with end-to-end anastomosis after robotic central pancreatectomy has not been applied. In this study, we report surgical techniques for robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis. The pancreas is reconstructed by duct-to-duct anastomosis of the pancreatic duct with a pancreatic stent inserted in the two stumps of pancreatic duct, and by end-to-end anastomosis of the pancreatic parenchyma. Compared with traditional central pancreatectomy with pancreaticoenteric anastomosis, this approach decreases the operative injury to the patient, and also conserves the integrity and continuity of the digestive duct and pancreatic duct. The robotic surgical system integrated with multiple instruments with flexible and precise movement is particularly suitable for the dissection and reconstruction of the pancreatic duct. We found that robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is safe and feasible, and we need more experience to evaluate its best indications and long-term outcomes.

The robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is feasible and safe for tumor in the pancreatic neck and proximal portion of pancreatic body. The operative techniques of this operation are presented.

Demande d’une anastomose bout à bout en robotique pancréatectomie centrale

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraporte Transplantation d’îlots pancréatiques dans le modèle murin

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...