We thank John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O'Brien and Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) and Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) for assistance with tissue acquisition. We also thank the Wisconsin State Laboratory of Hygiene for diagnostic testing services, and Dr. Tonie Rocke and her staff (USGS National Wildlife Health Center) for use of equipment. Any use of trade, product, or firm names is for descriptive purposes only and does not imply endorsement by the U.S. Government.

travaux animale menée à la National Wildlife Health Center USGS a été réalisée en conformité avec l&#39;Office de lignes directrices NIH Laboratoire bien-être animal et sous protection des animaux et le comité de l&#39;utilisation protocole # EP080716. Tissus d&#39;animaux de chasseurs-récoltés étaient des cadeaux du Wisconsin ou du Michigan ministères des Ressources naturelles. 1. Solution Préparation REMARQUE: Les solutions énumérées ci-dessous sont nécessaires pour la préparation du substrat de dosage de CER dans la section 2 ci-dessous. Préparer chacune de ces solutions de concentration des solutions d&#39;achat d&#39;actions plus élevés; concentrations recommandées pour les solutions d&#39;achat d&#39;actions seront indiqués entre parenthèses après chaque nom chimique respective énumérés. Préparer toutes les solutions fraîches lors de la préparation du substrat et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. <ol><li> Pour tampon de lyse, préparer une solution de la suivante dans Tris 10 mM, pH 7,5 (Tris 1 M, pH 7,5 solution stock recommandé): 100 mm schlorure de odium (NaCl, 1 M solution mère), l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique 10 mM (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 solution mère), 0,5% de NP-40 (solution à 10% d&#39;actions), 0,5% de désoxycholate (DOC, 10% solution stock ). </li><li> Pour mémoire tampon de conversion, préparer une solution de dodécylsulfate de sodium à 0,05% (SDS, solution à 10% d&#39;actions) et 0,5% de Triton X-100 (10% de solution de stock) dans une solution saline tamponnée phosphate (PBS, 10, pH 7,4 solution mère). </li><li> Pour les solutions chaotropiques, préparer deux solutions 3 M de chlorhydrate de guanidine (GdnHCl, 8 M stock) en 1x PBS (solution 10x de stock). Ajuster le pH de l&#39;une des solutions à 3,5 ± 0,05 avec de l&#39;acide chlorhydrique concentré (HCl). Vérifier que le pH de la deuxième solution se maintient à un pH de 7,4 ± 0,05 et ajuster en utilisant du HCl concentré ou d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH), si nécessaire. </li></ol> 2. Préparer Paires CER Assay Substrate <ol><li> Obtenir le tissu cérébral sain, non-TSE-infecté à partir d&#39;espèces d&#39;intérêt et de préparer un volume poids par 10%(P / v) dans du tampon d&#39;homogénat de lyse en utilisant l&#39;une des méthodes suivantes: Dounce, broyeur à billes, ou homogénéisation mortier et un pilon. Affiner plus loin homogénats résultant en les soumettant à seringue-aiguille et l&#39;homogénéisation à l&#39;aide d&#39;aiguilles de calibre croissant jusqu&#39;à ce que le substrat peut être aspiré et expulsé avec facilité par une aiguille G 27 de la seringue. <ol><li> Pour les substrats préparés à partir de rongeurs et autres petits mammifères, homogénéiser cerveau (s) ensemble; pour les substrats préparés à partir de grands mammifères, utiliser obex (tronc cérébral) tissus pour préparer homogénats. Lors de la sélection de la quantité d&#39;homogénat de cerveau, la préparation ne dépassant pas 50% de la capacité de la centrifugeuse utilisée pour la précipitation des protéines à l&#39;étape 2.6. </li><li> Si la qualité du tissu cérébral acquis est discutable, évaluer les niveaux PrP C par SDS-PAGE 16 et 17 immunoblot avant substrat préparation. </li></ol></li><li> Divisez homogénat de cerveau en deux volumes égaux dans des tubes coniques distincts étiquetés plastique. Ajouter GdnHCl (3 M dans une solution PBS) à pH 3,5, soit 7,4 ou de chaque tube dans un rapport 1: 1 en volume d&#39;homogénat de cerveau. </li><li> Vérifiez les valeurs de pH des deux solutions. Ajuster le pH du substrat pH 3,5 à pH 0,05 ± utilisant du HCl concentré. Se assurer que le pH de l&#39;autre substrat reste à un pH de 7,4 ± 0,05 et ajuster le pH si nécessaire avec de l&#39;HCl ou de NaOH selon les besoins. Évitez dépassement des valeurs de pH par addition judicieuse d&#39;acide ou de base. </li><li> Tournez solutions sur un mélangeur à tambour-end à la température ambiante (RT) pendant 5 heures. </li><li> Précipiter la protéine en ajoutant quatre volumes de méthanol à la solution de substrat dans chaque tube conique, vortex pour bien mélanger et incuber à 20 ° C pendant 16-18 h. </li><li> Les échantillons de sédiments par centrifugation à 13 000 g pendant 30 min à 4 ° C. Décanter avec soin et jeter le surnageant et laisser se évaporer le methanol à partir des pastilles. Utilisation des applicateurs en coton-tige pour aider à l&#39;absorption du methanol est attachée à l&#39;intérieur du tube. Ne pas permettre à plus de pellets-dry methanol et une fois ne est plus visible, passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Pastilles de protéines remettre en suspension dans un tampon de conversion. Utilisation d&#39;une quantité de tampon de conversion égal à la quantité de matériau de départ d&#39;homogénat cérébral distribué dans chaque tube à l&#39;étape 2.2. NOTE: Il est essentiel que le tampon de conversion utilisé pour remettre en suspension les granulés de protéines à la fois un pH de 3,5 et de préparations de substrat 7,4-traités est la solution définie à l&#39;étape 1.2 ci-dessus (qui contient de faibles niveaux de détergents et un pH physiologique). </li><li> Brièvement soniquées solutions de substrat dans un sonicateur à cuphorn (10 sec à ~ 30% puissance maximale), portion dans 0,5 à 1,0 ml par étiquetés 1,5 ml microtubes. Effectuer un immunoblot de contrôle de qualité (étape 2.9) sur une partie aliquote de chaque substrat. Stocker d&#39;autres aliquotes à -80 ° C jusqu&#39;au moment d&#39;effectuer dosage de CER (section 4). </li><li> Effectuer un contrôle de qualité sur les paires de substrat de CER avant de les utiliser (figure 2). Ces étapes se assurer que les substrats de CER seront provide des résultats optimaux dans les études de conversion. <ol><li> Assurer des quantités comparables de PrP C dans les deux substrats. Comparer les niveaux de PrP en 10-25 ul de chaque substrat par 16 SDS-PAGE et immunotransfert 17. Si les niveaux de protéine dans le pH 7,4 et 3,5 substrats sont dans ~ 10% de l&#39;autre, les paires de substrat sont appropriés pour une utilisation dans des études de CER. REMARQUE: Les immunoblots PrP ne devraient pas montrer des preuves de la dégradation importante PrP C. L&#39;immunoréactivité PrP devrait être essentiellement&gt; 20 kDa. Bandes moins de cette masse moléculaire peuvent être produits de dégradation. Modèles baguage devraient être à peu près équivalente entre les paires de substrat. </li><li> Comme la PrP C dans les deux substrats devrait être PK sensibles, traiter 10-25 ul de chaque substrat avec PK à une concentration finale de 100 pg / ml et digérer des échantillons à 1000 rpm à 37 ° C pendant 1 heure dans le thermo-agitateur. Évaluer tout signal PrP reste par SDS-PAGE 16 et 17 immunotransfert.Substrats avec PrP res ne sont pas appropriés pour une utilisation dans les études de CER. </li></ol></li></ol> 3. Préparer agent de l&#39;EST Seeds <ol><li> Obtenir tissu cérébral TSE-infectés par des espèces d&#39;intérêt et de préparer un 10% (p / v) dans homogénat 1x PBS pH 7,4 en utilisant les méthodes énumérées à l&#39;étape 2.1 ci-dessus. NOTE: Semences pourraient également être produits à partir d&#39;autres tissus TSE-infectés en dehors du système nerveux central, cependant, l&#39;efficacité de la conversion de substrats dérivé du cerveau par des graines provenant de tissus périphériques TSE-infectées n&#39;a pas encore été évalué expérimentalement dans la littérature publiée. </li><li> Aliquote homogénat (s) en 100 résultant - 300 volumes ul dans 0,5 ml microtubes et conserver à -80 ° C jusqu&#39;au moment d&#39;effectuer le test de CER. </li></ol> 4. CER Assay NOTE: Le test de CER implique plus d&#39;une quantité relativement faible de PrP TSE (fourni dans la «semence») d&#39;une espècedans un excès relatif de PrP C (fourni dans le cerveau non infecté &quot;substrat&quot;) d&#39;une autre espèce qui a été partiellement dénaturées soit à pH 3,5 ou 7,4. Après une période d&#39;incubation secouant étendu, la conversion du modèle mécanique de PrP C par PrP EST dans chaque réaction est évaluée par le signal densitométrique de la PrP res restant après digestion avec PK et la détection de immunoblot. La comparaison des niveaux de PrPres dans les substrats précédemment dénaturés à un pH de 3,5 par rapport à 7,4 donne une mesure de la barrière des espèces. Une vue d&#39;ensemble expérimental de cette procédure de test est fourni à la figure 1. <ol><li> Décongeler lentement non infectées paires de substrat de CER (dosage nécessite des volumes égaux de substrats préalablement dénaturé à la fois à 3,5 pH et 7,4) et des solutions de semences TSE-infectés en les plaçant sur le dessus d&#39;un lit de glace (environ 1 heure de temps de dégel). </li><li> Une fois complètement décongelé, aspirer puis expulser chaque solution de substrat à travers une27 G aiguille de la seringue à plusieurs reprises pour re-homogénéiser. Brièvement soniquer chaque solution de semences TSE-infectées pendant 10 secondes à ~ 30% de la puissance maximale. Gardez toutes les solutions sur la glace lors de la préparation des réactions de conversion. </li><li> Label 5 tubes individuels faibles contraignantes, à paroi mince PCR par agent de l&#39;EST à l&#39;essai. </li><li> Préparer les réactions de conversion dans ces tubes en ajoutant 5 ul de solution de semences infectés par l&#39;EST 10% à 95 ul de (a) substrat CER préparés à pH 7,4 et (b) de substrat CER préparé à pH 3,5. <ol><li> Pour chaque échantillon expérimental, préparer réactions parallèles en paires de substrat CER préalablement dénaturé à la fois à pH 3,5 et 7,4. </li><li> Optimiser ratios de TSE semences d&#39;agent pour substrat de cerveau infecté par la détermination empirique. Semences communes: ratios de substrat employé de maintenir un volume de réaction total de 100 pi et pi comprennent 1:99, 2:98 et 5:95 ul ul. Pour la plupart des applications, la graine 5:95 ul: rapport de volume de substrat est approprié et ce qui est est présenté dans eest le protocole. </li></ol></li><li> Préparer trois échantillons de contrôle par agent de l&#39;EST à l&#39;essai comme suit: (a) ajouter 5 pi de solution de semences TSE-infecté 10% à tampon de conversion de 95 pi de contrôle pour entrée PrPres; ajouter un tampon de conversion de 5 ul à 95 ul de substrat préparé en (b) pH 3,5 et (c) à pH 7,4 en tant que témoins pour la conversion non-basé sur un modèle non spécifique. </li><li> Vortex brièvement chaque échantillon dans son tube de PCR fermé de mélanger les semences et le substrat ainsi. Suivi par une impulsion momentanée d&#39;une faible vitesse de paillasse mini-centrifugeuse pour éliminer tout le volume du mélange réactionnel piégé dans le couvercle de tube de PCR. </li><li> Charger les échantillons dans des tubes PCR individuellement marqués dans une paillasse thermo-agitateur équipé d&#39;accepter tubes PCR. Secouez échantillons à 1000 rpm à 37 ° C pendant 24 heures. </li><li> Suite à agitation, ajouter Sarkosyl à une concentration finale de 2% (p / v) et PK à une concentration finale de 100 ug / ml. Échantillons Digest à 1000 rpm à 37 ° C pendant 1 heure dans le thermo-agitateur. NOTE: Ajout de sarkosyl à des échantillons d&#39;aides post-conversion en PK digestion de PrP C. Signaux faux positifs dans des échantillons non ensemencés (étape 4.5) sont pratiquement éliminés par addition de sarkosyl. </li><li> Ajouter du tampon d&#39;échantillon SDS-PAGE, les échantillons de chaleur à 95 ° C pendant 5 minutes et résoudre PrP res restants dans chaque échantillon par SDS-PAGE suivie d&#39;un immunotransfert 16 17. REMARQUE: Après addition de tampon d&#39;échantillon et le chauffage, les échantillons peuvent être traités immédiatement ou les échantillons peuvent être stockés à -20 ° C ou -80 ° C avant l&#39;immunotransfert. Toutes les données présentées ici ont été générés en utilisant du gel et des systèmes d&#39;échange Novex NuPAGE. Des échantillons individuels de l&#39;essai de RGC ont été traitées avec un tampon d&#39;échantillon et l&#39;agent réducteur selon les instructions du fabricant. Les échantillons ont été ensuite chauffés à 95 ° C pendant 5 min et 30 ul de chaque échantillon ont été chargés dans un 12% de Bis-Tris gels préfabriqués. </li><li> Calculer le rapport de rendement de conversion (CER) comme une mesurede barrière des espèces. Mesurer les niveaux de PrPres par densitométrie 17 et divisent la densité totale de l&#39;échantillon pH 7,4 par celle du pH 3,5 échantillon. Multiplier par 100 pour produire un pourcentage. </li><li> Compiler les données de répétitions expérimentales indépendantes pour générer une moyenne ± écart-type CER pour une espèce avec un agent de l&#39;EST donné. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Pour la réussite de ce protocole, l&#39;attention devrait être accordée aux niveaux PrP C dans le tissu cérébral infecté utilisé pour la préparation du substrat (étape 2.1.2) et la semence au substrat ratio pour les réactions de conversion (étape 4.4.2). Dans notre expérience, le cerveau peuvent être extraites pour une utilisation comme substrat de CER après un post-mortem de longue période, aussi longtemps que la PrP C est présent par immunoblot (Figure 4). En fait...

Encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST, maladies à prions) sont un groupe de maladies neurodégénératives fatales avec des périodes d&#39;incubation prolongées qui touchent une variété d&#39;animaux et les humains. L&#39;agent étiologique présumé des EST est constitué d&#39;un isomère mal repliée de la protéine prion hôte (PrP), qui est capable d&#39;auto-propagation par conversion du modèle mécanique de la forme cellulaire normale de la PrP (PrPc) en un infectieuse, associée aux maladies forme (PrP EST) qui se accumule dans les tissus du système nerveux central de l&#39;hôte infecté 1. Prions de mammifères infectieuses transmettent généralement de l&#39;hôte à hôte d&#39;une manière spécifique à l&#39;espèce, qui a donné naissance au concept de la «TSE espèces barrière» limitant événements de transmission inter-espèces 2. Les déterminants biologiques de la barrière des espèces de prion ne sont pas bien comprises. similarité de séquence d&#39;acides aminés entre la PrP infectieux des EST et l&#39;hôte PrP C cUne influence fortement si la conversion a lieu 3-5, mais reste insuffisante pour expliquer tous les événements de transmission du prion observés in vivo 6,7. Ainsi, la caractérisation des barrières d&#39;espèces TSE se est largement appuyée sur des études de provocation des animaux: exposer les animaux naïfs d&#39;une espèce donnée aux prions de l&#39;autre et la mesure du temps d&#39;incubation résultant d&#39;apparition de la maladie et le taux d&#39;attaque comme indicateurs de l&#39;efficacité de la transmission. Souris exprimant la PrP C à partir d&#39;espèces hétérologues sont également utilisés pour ce type d&#39;étude 8. Les coûts associés à la production de souris transgéniques et des essais biologiques à prions prolongées, ainsi que des considérations éthiques de l&#39;utilisation des animaux, sont des obstacles à une enquête expérimentale de TSE barrières d&#39;espèces. Évaluation de la barrière d&#39;espèce humaine aux EST se appuie sur des souris modifiées pour exprimer humaine PrP C. Ces souris exigent longues périodes d&#39;incubation de succomber aux EST ou des modifications à T humainsil molécule humaine PrP C pour la maladie rapide apparition 9. La période d&#39;incubation des EST non humain chez ces souris peuvent se étendre au-delà de la durée de vie de souris normale rend l&#39;interprétation des résultats négatifs difficiles. Les primates non humains ont également été utilisés comme procurations pour étudier les barrières d&#39;espèces humaines, mais ces études souffrent avec les mêmes défis que les autres types de l&#39;expérimentation animale et les primates non humains ne peut pas résumer précisément la maladie car elle procède de l&#39;hôte humain. essais biologiques des animaux restent la méthode «étalon-or» pour mesurer la sensibilité d&#39;une espèce à une EST, mais les obstacles, les coûts et l&#39;éthique de ces études d&#39;animaux vivants ont contraint enquête sur des solutions de rechange. Un certain nombre d&#39;essais in vitro, fondées sur l&#39;évaluation de la conversion de l&#39;hôte PrP C à une protéinase K (PK) de l&#39;Etat, résistante (de PrPres) lorsque ensemencée par PrP TSE, ont été développées et utilisées pour étudier TSE spECIES barrières 10-12. Des exemples de tests in vitro comprennent analyses sans cellules conversion, mauvais repliement des protéines amplification cyclique (PMCA), et le taux de rendement de conversion (CER) de dosage 10-14. Bien qu&#39;aucun de ces tests prennent en compte des facteurs périphériques impliqués dans les barrières d&#39;espèces après l&#39;infection naturelle, tout le monde peut être utile pour identifier les hôtes potentiellement sensibles pour les EST. Ici, nous présentons le protocole pour l&#39;essai de CER, dans lequel deux substrats dénaturées PrP C dérivés de homogénats de cerveau normales sont utilisées dans paillasse réactions de conversion du prion (figure 1) 13. PrP C dans le substrat dénaturée à pH 7,4 ne peut être converti en PrPres par PrP EST ensemencées dans la réaction en l&#39;absence d&#39;une barrière de 14 espèces. En revanche, la dénaturation de la PrP C dans l&#39;autre substrat à pH 3,5 permet d&#39;être converti en une incubation de PrP suivantavec PrP EST provenant de toute espèce et sert de contrôle pour la conversion. Le rapport de conversion de la PrPc en PrPres à pH 7,4 substrat par rapport à celui du substrat pH 3,5 donne une mesure de la barrière des espèces. Nous avons trouvé que le dosage de CER prédit connu barrières d&#39;espèces de souris de laboratoire à divers EST et ont utilisé le test dans les efforts pour prédire la barrière des espèces de nombreuses espèces de mammifères, y compris le mouflon d&#39;Amérique, à la maladie du dépérissement chronique (MDC) et autres EST 14, 15. Les enquêteurs se intéressent à un outil permettant le dépistage rapide des EST barrières d&#39;espèces ou de l&#39;évaluation de la conversion de PrP C de-PrP trouveront cette méthodologie utile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:205px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:287px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">12% Bis-Tris SDS-PAGE gels</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td style="width:205px;">Next Advance</td>
			<td style="width:157px;">ZROB05&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Other varieties of beads are also effective</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:296px;">Antibodies</td>
			<td style="width:205px;">various suppliers</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;">Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bead homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Next Advance</td>
			<td style="width:157px;">BBY24M</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:157px;">369434</td>
			<td style="width:287px;">High speed with temperature control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:205px;">any brand</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cotton-tipped applicator</td>
			<td style="width:205px;">Uline</td>
			<td style="width:157px;">S-18991</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Cuphorn sonicator</td>
			<td style="width:205px;">Heat Systems-Ultrasonics</td>
			<td style="width:157px;">W-380</td>
			<td style="width:287px;">Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:296px;">Densitometry software program</td>
			<td style="width:205px;">UVP</td>
			<td style="width:157px;">Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software</td>
			<td style="width:287px;">Other programs, such as NIH ImageJ, will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:157px;">885300</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">End-over-end mixer</td>
			<td style="width:205px;">Labnet International</td>
			<td style="width:157px;">H5600</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetra acetic acid</td>
			<td style="width:205px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:157px;">P-770</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine hydrochloride, 8M</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">24115</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating block</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">11-718</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">435570</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: strong acid</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4X</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0008</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin &#38; respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Methanol</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">A454-4</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:205px;">any brand</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-centrifuge</td>
			<td style="width:205px;">Labnet International</td>
			<td style="width:157px;">C1301</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">L-5125</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:205px;">Amresco</td>
			<td style="width:157px;">M158</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin irritation, eye damage</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:296px;">SDS-PAGE gel system</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NuPAGE electrophoresis system</td>
			<td style="width:287px;">Other SDS-PAGE systems will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">PCR tubes (low-binding)</td>
			<td style="width:205px;">Axygen</td>
			<td style="width:157px;">PCR-02-L-C</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Pestle homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">03-392-106</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">pH meter</td>
			<td style="width:205px;">Sentron</td>
			<td style="width:157px;">SI600</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyvinyldifluoride membrane</td>
			<td style="width:205px;">Millipore</td>
			<td style="width:157px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:157px;">V3021</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin &#38; eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:296px;">Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10X</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0009</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">D6750</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">28364</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">S5881</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemica; strong base</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Syringe</td>
			<td style="width:205px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:157px;">various</td>
			<td style="width:287px;">Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Syringe needles</td>
			<td style="width:205px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:157px;">various</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Thermoshaker (PCR tube shaker)</td>
			<td style="width:205px;">Hangzhou All Sheng Instruments</td>
			<td style="width:157px;">MS-100</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Tris base</td>
			<td style="width:205px;">Bio Basic&#160;</td>
			<td style="width:157px;">77-86-1</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:205px;">Integra Chemical Company</td>
			<td style="width:157px;">T756.30.30</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Vortexer</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">12-812</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing transmissible spongiform encephalopathy species barriers with an in vitro prion protein conversion assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

L&#39;utilisation réussie de l&#39;essai de CER dépend en grande partie la qualité de la paire de substrats utilisés dans les réactions de conversion. Pour cette raison, les procédures pour préparer paires de substrat CER suivant, un immunoblot de contrôle de la qualité doit être effectuée (Figure 2). Pour les deux substrats, un dosage de 10 à 25 ul par immunotransfert. PrP C doit être facilement détectable dans chaque substrat et les niveaux de PrP C doit être appro...

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Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Évaluation de l&#39;encéphalopathie spongiforme transmissible barrières d&#39;espèces avec une<em&gt; In Vitro</em&gt; Test Prion de conversion des protéines

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

7.7K vues.  USGS National Wildlife Health Center. Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

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Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarqueurs dans un modèle animal pour Révéler Corrélats neuronaux, hématologiques et du comportement de stress post-traumatique

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Recherche

Médecine

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Évaluer les changements tératogènes dans un modèle de poisson zèbre de l&#39;exposition d&#39;alcoolisation fœtale

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

Isolement des oligomères de PrP solubles et insolubles dans le cerveau humain normal

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

Simulation pancréatique neuroplasticité:<em&gt; In Vitro</em&gt; Double-neurone Plasticité Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Utilisant le virus adéno-associé comme un outil pour étudier les obstacles dans la maladie de la rétine

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Un modèle de Porcinet néonatale encéphalopathie hypoxique-ischémique

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best advance translational objectives and uncover new therapeutic strategies for brain injury associated with preterm birth, preclinical models of EoP must include similar mechanisms of prenatal global injury observed in humans and involve multiple components of the maternal-placental-fetal system. Ideally, models should produce a similar spectrum of functional deficits in the mature animal and recapitulate multiple aspects of the pathophysiology. To mimic human systemic placental perfusion defects, placental underperfusion and/or chorioamnionitis associated with pathogen-induced inflammation in early preterm birth, we developed a model of prenatal transient systemic hypoxia-ischemia (TSHI) combined with intra-amniotic lipopolysaccharide (LPS). In pregnant Sprague Dawley rats, TSHI via uterine artery occlusion on embryonic day 18 (E18) induces a graded placental underperfusion defect associated with increasing CNS damage in the fetus. When combined with intra-amniotic LPS injections, placental inflammation is increased and CNS damage is compounded with associated white matter, gait and imaging abnormalities. Prenatal TSHI and TSHI+LPS prenatal insults meet several of the criteria of an EoP model including recapitulating the intrauterine insult, causing loss of neurons, oligodendrocytes and axons, loss of subplate, and functional deficits in adult animals that mimic those observed in children born extremely preterm. Moreover, this model allows for the dissection of inflammation induced by divergent injury types.

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Modélisation encéphalopathie de prématurité Utilisation prénatale hypoxie ischémie avec un lipopolysaccharide intra-amniotique chez le rat

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key element is the quantitative determination of a tumor-specific genetic alteration in relation to a universal sequence using a dual-probe digital PCR assay and the subsequent calculation of the proportion of tumor cells. The assay is carried out on a culture containing tumor cells of an established line and spiked-in non-tumor cells. The mixed culture is treated with a test drug at various concentrations. After the treatment, DNA is prepared directly from the survived adhesive cells in wells of 96-well plates using a simple and inexpensive method, and subjected to a dual-probe digital PCR assay for measuring a tumor-specific genetic alteration and a reference universal sequence. In the present demonstration, a heterozygous deletion of the NF1 gene is used as the tumor-specific genetic alteration and a RPP30 gene as the reference gene. Using the ratio NF1/RPP30, the proportion of tumor cells was calculated. Since the dose-dependent change of the proportion of tumor cells provides an in vitro indication for specificity of the drug, this genetic and cell-based in vitro assay will likely have application potential in drug discovery. Furthermore, for personalized cancer-care, this genetic- and cell-based tool may contribute to optimizing adjuvant chemotherapy by means of testing efficacy and specificity of candidate drugs using primary cultures of individual tumors.

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

The goal of this protocol is to assess specificity of anticancer drugs in vitro using mixed cultures containing both tumor and non-tumor cells.

Évaluation Spécificité de Anticancer Drugs<em&gt; In vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Technique explosive cochléaire murine néonatale en tant que<em&gt; In Vitro</em&gt; Outil de dépistage dans la recherche auditive

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...