La présente recherche a été soutenue par un ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233 460), septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7 / 2007-2013) en vertu de convention de subvention n ° 256974 (EPC-TM-NET) et n ° 602783 (CAM-Pac ), la Sous-Direction générale de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 &amp; PI12 / 02643), et le Programa Nacional de internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Espagne). E. Lonardo a été soutenu par Roche Fellowship. M. Cioffi a été soutenu par le Programme de bourses Predoctoral La Caixa.

PDAC tumeurs humaines ont été obtenus avec le consentement éclairé écrit (Comunidad de Madrid, Espagne (CP CNIO-CTC-11 -. CI 11/103-E) Implantation des tumeurs pancréatiques humaines dans des souris immunodéficientes nécessite l&#39;approbation du comité d&#39;examen institutionnel ainsi que institutionnelle . Animal Care et l&#39;utilisation Comité (IACUC) Les procédures de modèles de souris de tumeurs pancréatiques xénogreffes doivent être menées en conformité avec les réglementations nationales et institutionnelles (ici comité d&#39;éthique de l&#39;Instituto de Salud Carlos III; Madrid, Espagne; Protocole PA 34_2012). 1. Culture Media <ol><li> Préparer milieu complet. <ol><li> Supplément milieu RPMI avec 10% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine. Pour 500 ml de RPMI ajouter 55 ml de FBS inactivé à la chaleur et 6 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 U / ml, 100X). </li><li> Conserver le milieu complet à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparer CSC moyenne. <ol><li> Compléter le DMEM / F12 mediu sans sérumm avec 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine et glutamine 2 mM. </li><li> Conserver le milieu SCC à 4 ° C. B27 (01:50) et 20 ng / ml de bFGF sont fraîchement ajoutés au milieu avant chaque expérience. REMARQUE: L&#39;ajout de B27 a été montré pour augmenter la formation de la sphère de la tumeur et de soutenir plusieurs passages de cultures de la sphère 32. La composition du milieu est une étape cruciale et doit être testé pour chaque type cellulaire dans la culture. Nous recommandons de tester l&#39;auto-renouvellement et la capacité de différenciation de sphères et analysons l&#39;expression des marqueurs du SCC par cytométrie de flux (c.-à-CD133 + et CD44 +). </li></ol></li><li> Préparer extracellulaire Flux milieu de dosage. <ol><li> Ce milieu spécifique est DMEM basale 5030 contenant des vitamines, acides aminés et autres suppléments, mais manquant de glutamine, le glucose, pyruvate et de bicarbonate. </li><li> Pour l&#39;essai en cours, compléter le milieu avec de la glutamine 2 mM, 8 mM de glucose et du pyruvate de sodium à 2 mM à une activité métabolique mitochondrial complet. NOTE: L&#39;absence de bicarbonate de sodium est essentielle afin de mesurer avec précision l&#39;acidification extracellulaire des cellules en croissance dans la culture, puisque milieu contenant du bicarbonate régulière en mémoire tampon des variations de pH pendant l&#39;essai. En outre, l&#39;utilisation d&#39;un milieu de base permet un contrôle serré de la concentration de L-glutamine (comme la L-alanyl-glutamine) de glucose, pyruvate de sodium ou nécessaire pour des conditions différentes et / ou des applications analytiques. </li></ol></li></ol> 2. Sphère essai de formation et de l&#39;analyse REMARQUE: Tous les protocoles de culture de tissus et de manipulations doivent être effectuées en utilisant des techniques stériles avec une grande attention à l&#39;aide propre, sans détergent, verrerie stérile. Avant utilisation, pré-chaud tout moyen et solution dans un bain-marie à 37 ° C (comme alternative, vous pouvez utiliser des solutions préchauffé à la température ambiante moyenne et). Obtenir tumeurs PDAC humain comme détaillé précédemment 21. <ol><li> Isolation des CSC de PDAC humain (Figure1) <ol><li> Dans une enceinte de biosécurité stérile transférer le tissu PDAC humaine à une boîte de 60 mm x 15 de culture contenant 1 ml de 1X tampon phosphate salin stérile (PBS). Émincer la tumeur en petits morceaux (1 - 5 mm) à l&#39;aide d&#39;un scalpel et pince stérile. </li><li> Ajouter 1 ml de solution stérile PBS 1X à la boîte de culture et répétez l&#39;étape de trituration jusqu&#39;à ce que le tissu est complètement dissocié, régulièrement cela nécessite 3-4 tours. Transférer la suspension de tissu (en haut jusqu&#39;à un volume final de 5 ml avec PBS 1X) dans un tube stérile et homogénéiser mécaniquement avec un dissociateur comme gentleMACS. </li><li> Incuber le tissu homogénéisé avec de la collagénase (en utilisant 2,5 mg / ml de collagénase dans 1X PBS) pendant 60 min à 37 ° C puis centrifuger pendant 5 min à 900 x g. Décanter le surnageant et remettre en suspension les culots cellulaires dans 10 ml de milieu complet. On filtre la suspension de cellules à travers un tamis de 40 um et centrifuger pendant 5 min à 900 x g. </li><li> Décanter le surnageant et remettre laun culot avec 5 ml de tampon de lyse de globules rouges (chlorure d&#39;ammonium-potassium, ACK), et incuber le </li><li> Reprendre le culot dans un milieu CSC, plaque sur un plat revêtu de gélatine, et incuber à 37 ° C pendant 1 h. Cette étape permettra d&#39;éliminer la plupart des cellules de fibroblastes qui se fixent rapidement sur la plaque. </li><li> Retirer la plaque de l&#39;incubateur et récupérer soigneusement suspension de cellules et de quantifier le nombre de cellules viables (trypan bleu-négatives) à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. Pour ce faire, mélanger doucement la suspension et la pipette 20 ul de la suspension dans un tube Eppendorf. Ajouter 20 pi (1: 1 ratio) de bleu trypan pour les cellules dans le tube à centrifuger et bien mélanger. Introduire à la pipette environ 10 ul du mélange sur la hémocytomètre. </li><li> Comptez toutes les cellules claires parmi les quatre quadrants de coin de la chambre de comptage pour le comptage des cellules viables. Note: La viabilité et le rendement des cellules peuvent varier considérablement entre les échantillons de tumeurs. Pour PDAC échantillons viabilité varie régulièrement between 45 à 70%, et de morceaux de tissu à partir d&#39;un échantillon de la tumeur macroscopique d&#39;un diamètre de 3-5 mm doivent céder à environ 5x10 6 cellules viables. </li></ol></li><li> Formation Sphère dosage et de traitement de metformine <ol><li> Prenez le nombre requis de cellules et ajouter le volume approprié de milieu CSC de préparer une concentration cellulaire de 2000 cellules / ml. Ne gardez pas la suspension de cellules sur la glace pendant plus d&#39;1h et bien mélangés avant le placage. </li><li> Ajouter 500 pi de PBS 1X à la première et la dernière rangée d&#39;une plaque de 24 puits pour l&#39;humidification afin d&#39;aider à minimiser l&#39;évaporation moyenne. Ensemencer les cellules dans des cellules de fixation ultra-basses des plaques à une densité de 2000 cellules par puits dans 1 ml de milieu de sphère de la tumeur (2000 cellules / ml). REMARQUE: Le nombre de cellules utilisées pour la sphère de la tumeur dosages de formation peut varier entre les types de tumeurs. </li><li> Traiter au moins quatre puits avec le véhicule (témoin négatif) et quatre puits avec chaque traitement alloué, par exemple., 3 mM de metformine. Place les cellules dans un incubateur réglé à 37 ° C et de fournir les cellules avec 5% de CO 2 pendant une semaine. NOTE: Le support ne doit pas être modifié afin de permettre la formation de sphères non perturbé de la tumeur, mais peut être complété avec des facteurs de croissance sur une base quotidienne, comme ils ne sont pas stables dans un milieu de culture. </li><li> Ajouter tous les deux jours de traitement, par ex., 3 mM de metformine ou d&#39;un véhicule à chacun des puits. Évaluer le nombre de sphères de tumeurs formées après 5 et / ou 7 jours par l&#39;utilisation d&#39;un compteur de cellules automatisé qui permet de compter des structures plus grandes (figure 2). NOTE: Seuls les sphères tumorales avec au moins 40 um doit être envisagée et peut être classé comme faible (40 - 80 um) ou grande (80 - 120 um), respectivement. Les résultats peuvent être illustrées comme le pourcentage de sphères de tumeur divisée par le nombre initial de cellules ensemencées (par exemple, 2.000 cellules). </li></ol></li><li> Le passage en série de sphères de tumeurs de première génération <ol&gt; <li> Après 7 jours d&#39;incubation récolter les sphères tumorales en utilisant un tamis cellulaire de 40 pm et les centrifuger pendant 5 min à 900 x g à température ambiante. </li><li> Dissocier le culot de sphères de tumeurs à cellules uniques en utilisant la trypsine, puis développez le nouveau cellules unicellulaires suspension obtenue pendant sept jours, comme décrit ci-dessus (voir 2.2). </li></ol></li></ol> 3. Analyse du métabolisme (ROS Production et consommation d&#39;oxygène) <ol><li> ROS production <ol><li> Dans ce protocole, nous avons utilisé carboxy-DCFDA comme un exemple de mesurer la production de ROS, car il est une sonde abordable, rapide et largement utilisé pour la détection ROS. Cependant, il existe plusieurs autres sondes et des méthodes qui peuvent être utilisées pour cet essai. </li><li> Traiter sphères tumorales avec la metformine comme décrit dans 2.2 pour le montant alloué de temps. A la fin du traitement, les sphères récolte tumorales en utilisant un tamis cellulaire de 40 pm, centrifuger les cellules à 900 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot dans 1 ml de trypsen. Incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Une fois que les cellules sont singularisés, centrifuger à 900 xg et remettre en suspension les cellules dans HBSS contenant 2,5 uM carboxy-DCFDA. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Avant de cytométrie en flux analyse protéger cellules colorées de la lumière comme carboxy-DCFDA peut être photo-oxydé donner des résultats faussement positifs. Placer les tubes sur de la glace jusqu&#39;à l&#39;analyse. REMARQUE: carboxy-DCFDA est fluorescent après réaction avec une variété d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène et de l&#39;azote, étant détectée en FL1 (ex 488 nm, em 520 nm..). </li></ol></li><li> Consommation d&#39;oxygène Mesure <ol><li> Pour ce protocole, nous allons utiliser le système extracellulaire Flux Analyseur de Seahorse Biosciences, à titre d&#39;exemple. Manteau de la plaque de culture cellulaire désirée avec une solution de 22,4 ug / ml de cellules et de tissu adhésif pendant 20 minutes à température ambiante. Rincer les puits avec de l&#39;eau 2 - 3 fois avant l&#39;ensemencement des cellules. </li><li> A la fin du traitement, les sphères récolte tumorales en utilisant un 40 um tamis cellulaire, centrifuger les cellules à 900 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot dans 1 ml de trypsine. Incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Plaque de cellules dans la plaque de culture cellulaire singularisée à une densité de 30 000 cellules / puits pour une plaque à 96 puits (volume final: 150 ßl). Resuspendre les cellules dans un milieu de dosage de la consommation d&#39;oxygène contenant du glucose et 8 mM de pyruvate de sodium à 2 mM. </li><li> Centrifuger les cellules au fond du puits par une centrifugation des puits jusqu&#39;à 100 XG a été atteint, puis de laisser l&#39;arrêt de la centrifugeuse avec frein off. Inverser l&#39;orientation de la plaque et répéter le processus. Transférer la plaque à un incubateur à 37 ° C sans addition de CO 2 pendant 30 min. </li><li> Entre-temps, préparer la cartouche pour le dosage. Chacun a bien 4 injecteurs différents à charge (25 pl / port): <ol><li> Port A: la metformine. Pour obtenir une concentration finale de 3 mM dans le puits, préparer une solution 8x (24 mM) en tant que volume final sera 175ul après l&#39;injection de l&#39;orifice A. </li><li> Port B: la metformine. Pour ajouter 3 mM et obtenir une concentration finale de 6 mM dans le puits, préparer une solution 9x (27 mM) en tant que volume final de 200 pi sera après l&#39;injection de l&#39;orifice B. </li><li> Port C: la metformine. Pour ajouter 3 mM et obtenir une concentration finale de 9 mM dans le puits, préparer une solution 10x (30 mM) en tant que volume final de 225 pi sera après l&#39;injection de l&#39;orifice C. </li><li> Port D: roténone 11 pM, 1 pM d&#39;obtenir que la concentration finale dans le puits (11x). Remarque: roténone inhibe complètement l&#39;activité mitochondriale résiduel quelconque. </li></ol></li><li> Calibrer la cartouche et charger la plaque de culture cellulaire. Effectuez le test avec le protocole standard de mélange et de mesure. </li><li> Calculer le pourcentage d&#39;inhibition de la respiration mitochondriale total réalisé par la metformine comme le pourcentage d&#39;inhibition obtenu avec la roténone (défini comme 100%). </li></ol></li></ol> 4.Modèle de xénogreffe de cancer du pancréas humain chez la souris immunodéprimée Remarque: L&#39;ordre des nombres suffisants de modèles féminins athymiques nues ou d&#39;autres, plus immunodéprimés tels que souris NOD-SCID, SCID-beige, ou NSG pour les expériences 33. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant l&#39;expérience et leur permettre de refroidir à température ambiante avant utilisation. Pour les tumeurs sous-cutanées, nous avons utilisé un minimum de 4 souris par état avec une tumeur par le flanc pour un total de 8 tumeurs. <ol><li> Xénogreffe Transplantation <ol><li> Préparer morceaux de tumeur à partir d&#39;échantillons de tissus cancéreux pancréatiques humaines. Transférer la tumeur dans une boîte de Pétri et disséquer le tissu en petits morceaux (2 mm de diamètre, 8 ~ 3 mm) en utilisant un scalpel et des pinces pour maintenir le tissu. Tremper les morceaux obtenus en gélatineuse solution de mélange de protéines maintenu sur de la glace. </li><li> Anesthésier la souris en utilisant de 1 - 3% isofluorane ou d&#39;autres anesthésiques par inhalation ou injectables. NOTE: Avant de commencer toute proc chirurgicaleedure, veiller à ce que les souris ont complètement perdu connaissance en stimulant la peau de l&#39;abdomen ou mèches avec une paire de pince à échardes. Appliquer une pommade oculaire pour prévenir la sécheresse. </li><li> Une fois l&#39;anesthésie a pris effet, essuyer le dos de la souris avec la peau contenant de l&#39;éthanol antiseptique. Administrer la buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) avant la chirurgie pour assurer l&#39;analgésie post-opératoire. </li><li> Soulevez la peau du dos avec une pince, faire un 0,7 à 1,0 cm de long incision avec micro ciseaux stériles et préparer ensuite carrément une petite poche sous-cutanée, dans laquelle un morceau de tissu de cancer du pancréas patient dérivée est insérée (~ 8 mm 3). </li><li> Fermer la plaie en utilisant 1 - 2 agrafes de la peau. Retirez-les après 7 jours. Retourner les souris dans leurs cages et les garder sur un coussin chauffant ou sous une lampe chauffante jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient à nouveau pleinement actif. </li><li> Après l&#39;implantation de la tumeur, les souris surveiller au moins deux fois par semaine pour la croissance tumorale et les signes généraux de morbidité résultant comme fourrure froissée, hunched posture, et l&#39;immobilité. </li><li> Une fois que les tumeurs ont atteint une taille moyenne de 200 mm3, les souris sont randomisées à des traitements respectifs. Administrer véhicule ou la metformine quotidiennement par des injections ip (150 mg / kg pc) ou par l&#39;intermédiaire de l&#39;eau potable (150 mg / kg de poids corporel) avec des effets de traitement comparables. </li><li> Surveiller la charge tumorale en utilisant un pied à coulisse et calculer le volume de la tumeur une fois par semaine (mesure du volume de la tumeur = 1/2 longueur x largeur x souffle). </li><li> Sacrifiez les souris une fois les tumeurs ont atteint 1 cm de diamètre ou souris commencent à montrer des signes de douleur ou une maladie grave comme indiqué ci-dessus. </li></ol></li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+Lgr5++stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas.">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337 (6095), 730-735 (2012).</li><li>Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+mode+of+tumour+growth+by+clonal+analysis.">Defining the mode of tumour growth by clonal analysis.</a> Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).</li><li>Shaw, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+LKB1+mediates+glucose+homeostasis+in+liver+and+therapeutic+effects+of+metformin.">The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin.</a> Science. 310 (5754), 1642-1646 (2005).</li><li>Martin-Castillo, B., Vazquez-Martin, A., Oliveras-Ferraros, C., Menendez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+and+cancer:+doses,+mechanisms+and+the+dandelion+and+hormetic+phenomena.">Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).</li><li>Honjo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+sensitizes+chemotherapy+by+targeting+cancer+stem+cells+and+the+mTOR+pathway+in+esophageal+cancer.">Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer.</a> Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).</li><li>Wurth, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+selectively+affects+human+glioblastoma+tumor-initiating+cell+viability:+A+role+for+metformin-induced+inhibition+of+Akt.">Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt.</a> Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).</li><li>Cufi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin-induced+preferential+killing+of+breast+cancer+initiating+CD44+CD24-/low+cells+is+sufficient+to+overcome+primary+resistance+to+trastuzumab+in+HER2++human+breast+cancer+xenografts.">Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts.</a> Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).</li><li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+targets+the+metabolic+achilles+heel+of+human+pancreatic+cancer+stem+cells.">Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76518 (2013).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+B27+supplement+on+promoting+in+vitro+propagation+of+Her2/neu-transformed+mammary+tumorspheres.">The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres.</a> J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).</li><li>Ishizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-initiating+cells+are+rare+in+many+human+tumors.">Tumor-initiating cells are rare in many human tumors.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li><li>Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+murine+prostate+stem+cells.">Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).</li><li>Seaberg, R. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rodent+neurogenic+regions:+the+ventricular+subependyma+contains+neural+stem+cells,+but+the+dentate+gyrus+contains+restricted+progenitors.">Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors.</a> J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+'side+population'+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Miranda-Lorenzo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+autofluorescence:+a+biomarker+for+epithelial+cancer+stem+cells.">Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells.</a> Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).</li></ol>

Les auteurs ont aucun intérêt à divulguer concurrence.

Avec l&#39;émergence et la validation ultérieure du concept SCC pour de nombreuses tumeurs, le domaine du développement de médicaments a pris un nouvel élan, avec le potentiel de développement de traitements contre le cancer plus efficaces et par la suite réduire le risque de rechute de la maladie. Cependant, le champ SCC est encore à un stade précoce et plus doit être accompli en termes de compréhension origine et la propagation du SCC, et leur rôle dans l&#39;élaboration de l&#39;architecture de la tumeur et la promotion de la métastase. Dans ce contexte, l&#39;utilisation de tests SCC reproductibles et significatifs ainsi que l&#39;interprétation éclairée des données obtenues représentent un élément crucial pour faire avancer notre compréhension de la biologie du SCC. De nombreux points de vue biologique, la formation de la sphère a émergé comme un dosage extrêmement précieux; néanmoins les utilisateurs devraient être conscients de ses limites afin d&#39;interpréter correctement les résultats expérimentaux. Un aspect important à considérer avant même l&#39;évaluation de la sphère formation de données est à l&#39;origine de l&#39;échantillon étudié, étant donné que les résultats obtenus à partir des échantillons frais de patients dérivés pourraient être significativement différents de ceux obtenus à partir de lignées de cellules cancéreuses établies. Classiques des dosages de formation de sphères consistent à ensemencer des cellules à densité clonale dans des plaques ultra-fixation et l&#39;évaluation de la formation de sphère en présence de facteur de croissance épidermique (EGF) et / ou le facteur de croissance des fibroblastes (b-FGF) enrichi, mais un milieu sans sérum 21, 34. La composition du milieu de culture est aussi un problème important à considérer. Dans notre expérience, nous avons constaté que le milieu DMEM / F12 additionné de B27, le bFGF et la glutamine en l&#39;absence de sérum est un milieu optimal de croître, étendre et maintenir la SCC dans des conditions non différenciées. Nous avons constaté que dans cet état de culture (milieu et de la suspension) les cellules expriment des quantités élevées de marqueurs de cellules souches du cancer (y compris CD133 +, CD44 + et CD24 +) et ne reflètent pas les protéines de différenciation associé (CK-20 Et CK-19). L&#39;une des hypothèses fondamentales de ces essais est que chaque sphère est clonal, à savoir, une sphère résulte de l&#39;expansion d&#39;une cellule souche unique. Cependant, les sphères sont intrinsèquement des structures dynamiques qui sont sujettes à fusionner, même à faible densité de semis 35. Étalement des cellules est une étape critique dans le protocole et la densité d&#39;une cellule / puits peut certainement contourner le problème d&#39;agrégation. Mais même pour les progéniteurs prospective triés, cela se traduit régulièrement dans la formation très faible sphère raison de la faible activité de formation de la sphère intrinsèque et peut également être attribuée à la stimulation autocrine limité en raison des effets de dilution. Dans notre expérience, nous avons constaté que seulement 30% des cellules étalées sont capables de former des sphères. Nous vous recommandons d&#39;utiliser au moins 100 cellules / puits pour obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Autres méthodes de culture à SCC de croissance sont fondées sur les cultures 3D solide ou semi-solide (par exemple, sur la base de mAtrigel, du collagène ou de la méthylcellulose). Ces méthodes ont été utilisées pour limiter la mobilité de la cellule et l&#39;agrégation de cellules 36 ultérieur. Cependant, chacune de ces matrices porte leurs propres limites. Par exemple, matrigel est une membrane de sous-sol soluble isolé du Engelbreth-Holm-Swan (EHS) tumeur et, bien que l&#39;extrait ressemble à l&#39;environnement de la tumeur extracellulaire complexe trouvé dans de nombreux tissus, il contient de multiples facteurs de croissance plus ou moins bien définies qui rend souvent mécaniste études pour les éléments réglementaires spécifiques très difficiles. Un autre point à considérer est que les fonctions cellulaires sphère capacité de former et de la tige ne ​​sont pas des termes interchangeables 34. On a montré que tandis que certaines cellules souches et progénitrices de présenter une insuffisance sphère formant capacité de 37, pour produire des sphères in vitro ne pas exclure vivo en fonction souches / progénitrices. Par exemple, des cellules souches quiescentes peuvent tout simplement pas répondre aux signaux fournis par le extracellulairessélectionné dans des conditions de culture in vitro. Ainsi, à long terme in vitro et in vivo la capacité d&#39;auto-renouvellement des populations de cellules purifiées, de préférence au cours de passages en série, devrait être évaluée afin de prouver ou de réfuter la fonction des cellules souches. Dans ce contexte, la capacité de se propager de façon prospective et simultanément diverses populations de cellules souches et progénitrices est un aspect crucial de l&#39;analyse de la sphère de formation et rend cet essai très précieux pour le domaine du SCC; aussi longtemps que ses limites sont gardés à l&#39;esprit pour l&#39;interprétation des données obtenues. dosages de Sphère formation ont été largement utilisés pour identifier rétrospectivement cellules souches en fonction de leur capacité à l&#39;auto-renouvellement et de différenciation au niveau de la cellule unique in vitro. La découverte de marqueurs qui permettent l&#39;isolement éventuel de cellules souches et de leur descendance à partir de leur niche in vivo permet les propriétés fonctionnelles des populations purifiées à définir. Les combinaison d&#39;essai de formation de la sphère et la FACS est une stratégie efficace pour isoler les cellules du tissu solide ou sous-populations spécifiques enrichir de PDAC dans la culture. Par exemple, l&#39;expression simultanée de EpCAM, CD24 et CD44 définit une sous-population de cellules souches cancéreuses en mesure de: l&#39;auto-renouvellement, de se différencier et d&#39;initier une tumeur, ce qui reflète l&#39;hétérogénéité de la tumeur d&#39;origine. Hermann et al. ont montré que les cellules CD133 + possédaient la capacité de prolifération augmentée et le SCC dispose de 15. D&#39;autres marqueurs ont également été utilisées pour la caractérisation de cellules souches cancéreuses: une ALDH- (aldéhyde déshydrogénase-1) expression est associée à des cellules hautement tumorigènes dans 38 le cancer du pancréas; cellules capables d&#39;exclure le colorant d&#39;ADN Hoechst 33342, la population de côté appelé (SP) des cellules, ont la capacité certifié pour initier des tumeurs 39. Récemment, nous avons montré que un compartiment d&#39;autofluorescence subcellulaire caractérise une population distincte de cellules humaines avec des traits SCC exclusifs à travers différents types de tumeurs40. Même si aucun de ces marqueurs semble caractériser sélectivement une population pure de CSC, combinaisons de plus en plus complexes de marqueurs doivent être utilisés pour purifier FACS populations les plus raffinés de cellules. Beaucoup de questions demeurent sur le rôle précis des CSC dans l&#39;origine, la progression et la résistance aux médicaments des tumeurs. Par exemple, une façon d&#39;aborder la question de l&#39;évolution clonale de définir si et comment un seul CSC lance une tumeur, pourrait être d&#39;analyser les échantillons des patients à différents stades de la maladie, et plus particulièrement de suivre le nombre de CSC pendant et après le traitement. En répondant à ces questions, nous pouvons réaliser des progrès significatifs de notre connaissance de CSC dans les tumeurs solides et de développer des thérapies pour prévenir finalement la progression tumorale et la rechute.

Pancréatique adénocarcinome canalaire (PDAC) est l&#39;une des tumeurs solides les plus agressifs. Il est actuellement le 4 ème décès lié au cancer le plus fréquent dans la société occidentale et devrait augmenter à la cause 2 ème plus fréquente dans la prochaine décennie (~ 400.000 décès par an dans le monde) 3 .Au moment du diagnostic 90% des patients présentent avec une maladie avancée, qui a une survie à 5 ans de moins de 5%. Ce taux de survie a malheureusement restée inchangée au cours des 50 dernières années, malgré les activités de recherche de plus en plus intensifs 4. Sur les 10% de patients restants qui ont potentiellement la maladie &quot;curable&quot; par résection chirurgicale, 80% mourront de récidive dans les 5 ans. Depuis de nombreuses années la norme de soins pour la maladie avancée a été monothérapie gemcitabine, mais cela ne confère un avantage de survie marginale 5. De petites améliorations dans la survie à court terme ont été obtenus par l&#39;additionde l&#39;erlotinib 6 ou 7 capécitabine, mais le bénéfice de survie est de l&#39;ordre de semaines à la médiane de survie globale encore ~ 6 mois. Récemment, des résultats plus encourageants sont apparus pour la gemcitabine / nab -paclitaxel 8 et la combinaison de FOLFIRINOX régime 9,10. Ces thérapies améliorent la survie médiane par un 2 et 4 mois respectivement modestes, mais sont hautement toxiques et les survivants à long terme sont encore une exception rare. Bien que le traitement offre le potentiel d&#39;amélioration, ce sont les régimes toxiques à laquelle de nombreux patients ne répondent pas ou ne montrent que l&#39;amélioration progressive de la survie globale. En conséquence, il ya un besoin urgent de compléter les traitements actuels et à développer de nouvelles approches thérapeutiques multimodales les plus probables. L&#39;hétérogénéité tumorale Il devient de plus en plus évident que l&#39;hétérogénéité du cancer ne se limite pas à l&#39;évolution distincte sous-clones within 11 chaque tumeur, mais aussi entraîné par hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle et la plasticité au sein de chaque sous-clone 12. Les soi-disant cellules souches du cancer (CCM) ou des cellules tumorales de promotion sont responsables de l&#39;hétérogénéité intraclonale 13-16. Plus précisément, les CSC représentent un sous-ensemble de cellules cancéreuses, pour lesquels nous et d&#39;autres avons fourni des preuves concluantes, jusqu&#39;à la cellule unique, qu&#39;ils représentent la racine de la maladie en donnant naissance à tous les descendances différenciées au sein de chaque sous-clone du cancer 17. Plus important encore, ces cellules sont essentiels pour le comportement métastatique et représentent aussi une source importante de rechute de la maladie après un traitement, même avec des médicaments relativement efficaces capables d&#39;induire une régression de la tumeur initiale (par exemple, -paclitaxel nab) 15,18-20. Il est important de noter que les CSC ne représentent pas nécessairement de bonne foi cellules souches, pas plus qu&#39;ils ne se posent à partir de cellules souches de tissus dans de nombreux cas, mais plutôt ils ont acquired certaines caractéristiques des cellules souches. La plupart d&#39;entre eux sont fonctionnellement définie, par exemple CSC sont équipées avec une capacité d&#39;auto-renouvellement indéfini qui les rend résistants à la chimiothérapie conventionnelle, et de montrer envahissant qui favorise l&#39;activité métastatique augmenté. Fonctionnels phénotypes cellulaires souches du cancer Le phénotype fonctionnel de CSC est basée sur leur capacité d&#39;auto-renouvellement, qui peut être testé in vitro en utilisant la formation de la sphère de série et des essais de formation de colonies respectivement. Plus important encore, les CSC capables d&#39;auto-renouvellement ours dans tumorigenicity vivo qui peuvent être testés en limitant la dilution in vivo que la lecture fonctionnelle ultime, de préférence lors de la transplantation de série indicative de tumorigénicité exclusive à long terme. En outre, il existe une hétérogénéité dans le compartiment du SCC, avec une sous-population distincte des CSC portant la capacité exclusive de donner lieu à des métastases qui est non seulement unconséquence directe de leur exclusivité dans tumorigenicity vivo. En effet, CSC metastastitic acquièrent la capacité de se soustraire à la tumeur primaire, et finalement survivre anoïkis translocation et épépiner les sites secondaires. Ces capacités fonctionnelles évoluées peuvent être testés in vitro en utilisant des essais d&#39;invasion modifiés et in vivo en utilisant des analyses de métastases. Ciblant les cellules souches du cancer Nous et d&#39;autres avons fourni des preuves convaincantes que les traitements se concentrant sur ​​la tumeur en masse de cellules PDAC différenciées, même en combinaison avec des agents du stroma-ciblage, ne pas avoir un impact majeur sur la progression tumorale et l&#39;issue subséquente, sauf combinée avec une stratégie CSC-ciblage 21, 22. Ainsi, sur la base des fonctions cruciales de CSC dans la progression de la maladie et de la résistance à la thérapie, ces cellules doivent signifier une composante essentielle de toute approche de traitement 18,20 roman, mais il faudra une compréhension beaucoup plus approfondie of le mécanisme de réglementation des CSC. Bien que les CSC et leurs descendances plus différenciées portent états génétiques identiques au sol par rapport à des altérations génétiques, CSC présentent l&#39;expression des gènes distincts et donc épigénétiquement déterminé profils part modules avec des cellules souches pluripotentes. La plupart des gènes impliqués dans la production induite par les cellules souches pluripotentes (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) ont non seulement été liée au cancer, mais leur expression se limite essentiellement au compartiment CSC. En outre, la pertinence fonctionnelle des CSC par des expériences de perte de fonction à l&#39;aide des outils génétiques pour cibler CCF ont désormais fermement établi le concept SCC pour plusieurs types de cancer 23-25. Alors que la plupart de ces approches sont basées sur des modèles de souris et donc ne sont pas facilement transférables dans la clinique, ils ne fournissent la preuve de concept pour la pertinence clinique potentielle de ciblage CSC en combinaison avec des cellules tumorales en vrac. L&#39;étude des cellules souches du cancer Dans Vitro pour identifier leur talon d&#39;Achille Afin d&#39;identifier des façons nouvelles et cliniquement applicables pour cibler les cellules souches cancéreuses, leurs caractéristiques sont régulièrement étudiés in vitro et la formation de la sphère est largement utilisé dans ce contexte. Initialement développé pour l&#39;étude de la biologie des cellules souches normales, y compris l&#39;auto-renouvellement et la capacité de différenciation, cet essai a ensuite été adapté pour étudier CSC in vitro et a été utilisé pour étudier les CSC isolés à partir de 20 PDAC. Nous avons trouvé que les sphères de tumeurs formées à partir de cellules primaires humaines PDAC portent toutes les caractéristiques distinctes de CSC, indiquant ainsi qu&#39;ils contiennent bona fide pancréatiques CSC 21. Ainsi, le dosage de la sphère de la tumeur représente un outil puissant à l&#39;écran pour des thérapies plus efficaces in vitro, mais les résultats doivent encore être évalués dans plus strictes des essais in vivo. En effet, les données générées avec ce dosage in vitro doivent être traités avec beaucoup de prudence, car ee dosage peut faire l&#39;objet d&#39;erreur significative. Protocoles hautement standardisés, y compris le comptage automatique de sphères formées, devraient être mis en place pour assurer que les données reproductibles et prédictifs. Dans ce contexte, nous avons récemment utilisé ce test pour dépister CSC pancréatiques dérivées d&#39;un ensemble diversifié de PDAC humains primaires et montré que ces cellules sont très vulnérables à la reprogrammation métabolique par antidiabétique metformine composé. Auparavant, la metformine a été démontré pour inhiber le cancer expansion cellulaire par activation indirecte de la protéine kinase activée par l&#39;AMP (AMPK) de signalisation et l&#39;inhibition ultérieure de mTOR 26, ayant pour résultat la synthèse des protéines et réduit la prolifération des cellules 27. En plus de ces effets sur la population de la tumeur en vrac, nous et d&#39;autres avons découvert que la metformine est capable de cibler et éliminer réellement la sous-population CSC dans un certain nombre de tumeurs solides telles que du sein, cancer de l&#39;œsophage, le glioblastome et le cancer du pancréas 28-31 &lt;/ Sup&gt;. Ainsi, la metformine représente une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse et sûre pour plusieurs cancers ayant des besoins médicaux non satisfaits actuellement. En outre, en utilisant la formation de la sphère comme un moyen pour enrichir CSC, nous avons montré que les effets primaires de la metformine sur la CSC pancréatiques était indépendante de l&#39;activation de l&#39;AMPK et surtout compté sur sa toxicité mitochondriale modeste (par inhibition de complexe I), qui était apparemment mortelle pour le sous-ensemble des CSC seulement. Pour ce dernier, nous avons pu évaluer leur consommation d&#39;oxygène et la production cellulaire ROS mitochondriale comme des indicateurs de la toxicité de la drogue au niveau cellulaire. Par la suite, ces données in vitro pourraient être validés dans des modèles murins précliniques et bien entraîné prolongé significativement la survie 31. La méthodologie présentée ici permet la génération rapide des profils de sensibilité aux médicaments pour les CSC, y compris des études sur leurs effets sur le métabolisme du SCC. Nous fournissons maintenant étendu détails expérimentaux sur le com utilisécomplémentaire in vitro et dans des procédures in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Counting Chamber/Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific Co</td>
			<td>3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement</td>
			<td>Roche Innovatis</td>
			<td>AG CASY Model TTC 45,60,150 &#956;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Co</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes&#160;</td>
			<td>Miltenyi Co</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Ultra-low Attachment Plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL polypropylene conical tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL polypropylene conical tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml sterile tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dishes, 10 cm dishes&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton Syringe Co</td>
			<td>81075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution, 100X&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metformin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D150959-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200 mM, 100X&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mM Sodium Pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Assay medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100965-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution, 0.05%&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement 50x&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium/F12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2&#39;,7&#39;-DichlorofluoresceinDiacetate)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% (vol/vol)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>IsoVet, Braun</td>
			<td>571105.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>35620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sterile Cotton tipped applicator</td>
			<td>&#160;Puritan medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF96e Extracellular Flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with CO2 input&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying pancreatic cancer stem cell characteristics for developing new treatment strategies

Adénocarcinome ductal pancréatique (PDAC) contient un sous-ensemble de cellules souches cancéreuses tumorigènes exclusivement (CCM) qui se sont révélées conduire à l&#39;initiation de la tumeur, les métastases et la résistance à la radio- et chimiothérapie. Nous décrivons ici une méthodologie spécifique pour la culture de cellules souches cancéreuses pancréatiques humaines primaires que des sphères tumorales dans des conditions de l&#39;ancrage indépendant. Les cellules sont cultivées en absence de sérum, des conditions non-adhérentes afin d&#39;enrichir pour CSC tandis que leurs descendances plus différenciés ne survivent et prolifèrent pendant la phase initiale après l&#39;ensemencement des cellules individuelles. Ce dosage peut être utilisé pour estimer le pourcentage de cellules souches cancéreuses présentes dans une population de cellules tumorales. Les deux taille (qui peut varier de 35 à 250 micromètres) et le nombre de sphères formés représente tumorales SCC activité soit hébergé en vrac populations de cellules cancéreuses ou des tumeurs de culture fraîchement récoltées et digérés 1,2. L&#39;utilisation de ce test, nous avons récemment constaté que la metformine ablation sélective pancreatCSC ic; une constatation qui a ensuite été corroboré par démontrant expression réduite des gènes / marqueurs de surface de pluripotence-associé et réduit la tumorigénicité in vivo de cellules de metformine-traitée. Comme la dernière étape pour le développement préclinique, nous avons traité des souris porteuses de tumeurs établies avec la metformine et a trouvé significativement prolongé la survie. Les études cliniques évaluant l&#39;utilisation de la metformine chez des patients avec PDAC sont actuellement en cours (par exemple, NCT01210911, NCT01167738, et NCT01488552). Mécaniquement, nous avons constaté que la metformine induit une crise de l&#39;énergie fatale dans les CSC en améliorant les espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) et la réduction de potentiel transmembranaire mitochondrial. En revanche, les non-CCM ne sont pas éliminés par un traitement à la metformine, mais plutôt réversible subi un arrêt du cycle cellulaire. Par conséquent, notre étude sert comme un exemple réussi pour le potentiel de la formation in vitro de la sphère comme un outil de dépistage pour identifier des composés qui ciblent potentiellement SCCs, mais cette technique, il faudra en outre in vitro et in vivo de validation pour éliminer les fausses découvertes.

Metformine cible sélectivement les cellules souches cancéreuses pancréatiques Nous avons d&#39;abord examiné les effets fonctionnels de traitement par la metformine sur la capacité d&#39;auto-renouvellement des cellules souches cancéreuses in vitro. A cet effet, nous avons effectué des dosages de formation de sphères en utilisant des cellules pancréatiques humaines cancéreuses primaires isolées à partir de tissus réséqués PDAC pendant la chirurgie. Nous avons observé que la metformine a fortement diminué la taille des sphères formées (figure 1A). Ce fut probablement par inhibition de l&#39;expansion des descendances du SCC, qui représentent encore l&#39;essentiel des cellules présentes dans les sphères car ils ne sont enrichies en cellules souches cancéreuses. En effet, les sphères plus longues sont cultivées sans repiquage la plus étendue de l&#39;expansion des descendances plus différenciées sera. Ainsi, nous avons trouvé la metformine pour diminuer considérablement le nombre de sphères formées en fait, indépendamment de leur taille, se produisant d&#39;une manière dépendante de la dose qui suggère une forte inhibition de la capacité d&#39;auto-renouvellement de CSC (données non présentées). Nous avons constaté que la metformine à 3 mM diminué de manière significative le nombre de sphères formées (figure 1B). Afin d&#39;étudier de manière plus stricte les effets à long terme de la metformine sur la capacité d&#39;auto-renouvellement des cellules souches cancéreuses, nous avons par la suite à des passages les sphères primaires formés dans les sphères secondaires et tertiaires. Bien que seuls des sphères primaires ont été traitées avec la metformine, la formation de sphères dans les deuxième et troisième passages a été considérablement réduite et de plus en plus, ce qui implique un traitement de metformine a en effet irréversiblement éliminé la majorité des cellules souches cancéreuses (figure 1C). Ainsi, nos données ont montré des effets significatifs du traitement pour la metformine sur la capacité d&#39;auto-renouvellement des cellules souches cancéreuses pancréatiques primaires et donc nous ont encouragés à effectuer d&#39;autres mécanistique ainsi que des études in vivo. Metformine inhibe mitochondrial consommation d&#39;oxygène et induit la production de ROS Depuis metformin a été montré pour agir comme un poison mitochondrial en inhibant partiellement activité du complexe I, nous avons ensuite examiné les effets aigus de la metformine sur la consommation cellulaire d&#39;oxygène dans les cellules dérivées de la sphère. A cet effet, nous avons sélectionné des cellules dérivées de deux tumeurs primaires représentatives PDAC et mesuré la consommation d&#39;oxygène au cours du temps après l&#39;injection séquentielle de metformine 3 mM (trois injections) et 1 uM de roténone (une injection). Comme le montre la Figure 2A, l&#39;injection de la metformine a induit une diminution rapide et dose-dépendante de la consommation d&#39;oxygène, ce qui fait varier considérablement entre les différentes tumeurs. Nous avons calculé l&#39;activité mitochondriale résiduelle lors du traitement de la metformine en injectant la roténone, un complexe inhibiteur puissant I, qui est capable d&#39;inhiber complètement la consommation d&#39;oxygène des mitochondries. Sensibilité à la metformine en termes de consommation d&#39;oxygène mitochondriale corrélée avec sa capacité à induire la production de ROS défini comme un déplacement de la moyenne de la popution après traitement par la metformine (figure 2B, panneau de gauche), qui peut être facilement quantifié (Figure 2B, panneau de droite). Comme on s&#39;y attendait, les cellules primaires qui étaient les plus sensibles à l&#39;inhibition de la consommation d&#39;oxygène ont également montré la plus forte augmentation de la production de ROS lors d&#39;un traitement de metformine. Ainsi, ces expériences métaboliques in vitro montrent que les objectifs de metformine CSC en inhibant leur dépendance sur la fonction mitochondriale, résultant en une augmentation ultérieure de la production mitochondriale de ROS et éventuellement induction de l&#39;apoptose. Metformin Echoppes PDAC Progression In Vivo Nous avons enfin étudié les effets de la metformine in vivo en utilisant des xénogreffes de tissus provenant de différents patients atteints de PDAC. Nous avons observé une réduction significative de la progression de la tumeur chez les souris traitées à la metformine par rapport au groupe de contrôle, mais les tumeurs jamais complètement disappeared (Figure 3). Par la suite, au cours de long terme suivi toutes les tumeurs finalement rechuté suggérant résistance de metformine de cellules survivantes de la phase initiale du traitement. Néanmoins, le traitement de metformine, même lorsqu&#39;il est appliqué en tant qu&#39;agent unique, étendu de manière significative la survie chez toutes les souris. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig1.jpg" /> Figure 1. La metformine cible sélectivement le CSC. (A) La metformine a diminué la taille des sphères. Des images représentatives de sphères obtenues après le traitement avec les doses indiquées de la metformine pour 7 jours (panneau de droite). Quantification de la taille de la sphère (de n≥6) (panneau de gauche), les chiffres indiqués dans l&#39;axe des abscisses représente la tumeur individuelle. (B) Sphère de la capacité de formation en présence ou en l&#39;absence de metformine pendant 7 jours (n≥6), les nombres indiqués dans abscissesreprésentent axe tumeur individuelle. (C) de graphe représentant de SCC auto-renouvellement des capacités dans les domaines secondaires et tertiaires de cellules cancéreuses pancréatiques primaires. Les sphères ont été seulement traités lors de la formation de la sphère de première génération pour un total de 7 jours (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig2.jpg" /> Figure 2. La metformine traitement inhibe la consommation d&#39;oxygène et la production de ROS Induit. (A) plus de la metformine inhibe la consommation d&#39;oxygène (OCR) de cellules de la sphère dérivés. Deux sphères secondaires PDAC différents ont été traités avec la metformine et les changements OCR ont été mesurés par analyse des flux extracellulaire. Injection roténone a été utilisé comme témoin pour la consommation totale mitochondrial OCR.L&#39;axe des X représente le taux de consommation d&#39;oxygène de l&#39;oxygène en pmol / h normalisée par la teneur en protéine dans chaque puits. sphères (B) utilisés dans la PDAC A ont été traités pendant 8 heures avec de la metformine et de la production de ROS a été évaluée par cytométrie en flux en utilisant carboxy-DCFDA. Gauche, flux représentant cytométrie parcelles. Droit, résumé des données provenant de trois expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig3.jpg" /> Figure 3. La metformine Echoppes PDAC Progression In Vivo. Deux tissus de xénogreffes PDAC différents ont été implantés dans des souris immunodéprimées et le traitement a été attribuée après le décollage initial de la tumeur a été vérifiée. Les souris ont été traitées avec la metformine (Met) ajoutés à l&#39;eau potable (150 mg / kg corps weilutte; basé sur 5 ml de la consommation d&#39;eau par jour). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.4K vues.  Spanish National Cancer Research Center. Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

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Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

Stem Cell Transplantation Stratégies pour la restauration de troubles cognitifs causés par la radiothérapie crânienne

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Recherche

Médecine

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Évaluation de la migration des cellules souches du cancer utilisant compartimenter dispositifs microfluidiques et imagerie des cellules vivantes

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Modèle Orthotopique bioluminescente la progression du cancer du pancréas

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Enrichissement pour chimiorésistantes cancer de l&#39;ovaire des cellules souches à partir de lignées cellulaires humaines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput Caractérisation des cellules souches adultes d&#39;ingénierie pour la livraison des facteurs thérapeutiques pour les stratégies neuroprotectrices

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local recurrence and distant metastasis. One hypothesis to explain this recurrence is the presence of cancer stem-like cells (CSCs) that present inherent chemo- and radio-resistance. In order to develop new therapeutic strategies, it is necessary to have experimental models that validate the effectiveness of targeted treatments and therefore to have reliable methods for the identification and isolation of CSCs. To this end, we present a protocol for the isolation of CSCs from human HNSCC cell lines that relies on the combination of two successive cell sortings performed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The first one is based on the property of CSCs to overexpress ATP-Binding Cassette (ABC) transporter proteins and thus exclude, among others, vital DNA dyes such as Hoechst 33342. The cells sorted with this method are identified as a &#34;side population&#34; (SP). As the SP cells represent a low percentage (&#60;5%) of parental cells, a growing phase is necessary in order to increase their number before the second cell sorting. The next step allows for the selection of cells that possess two other HNSCC stem cell characteristics i.e. high expression level of the cell surface marker CD44 (CD44high) and the over-expression of aldehyde dehydrogenase (ALDHhigh). Since the use of a single marker has numerous limitations and pitfalls for the isolation of CSCs, the combination of SP, CD44 and ALDH markers will provide a useful tool to isolate CSCs for further analytical and functional assays requiring viable cells. The stem-like characteristics of CSCs was finally validated in vitro by the formation of tumorispheres and the expression of &#946;-catenin.

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Isolement et caractérisation d&#39;une tête et du cou squameux Carcinome Sous-population Ayant les cellules souches Caractéristiques

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with radiotherapy. Experimental approaches to understanding mechanisms of salivary gland dysfunction and restoration have focused on in vivo models, which are handicapped by an inability to systematically screen therapeutic candidates and efficiencies in transfection capability to manipulate specific genes. The purpose of this salivary gland organotypic culture protocol is to evaluate maximal time of culture viability and characterize cellular changes following ex vivo radiation treatment. We utilized immunofluorescent staining and confocal microscopy to determine when specific cell populations and markers are present during a 30-day culture period. In addition, cellular markers previously reported in in vivo radiation models are evaluated in cultures that are irradiated ex vivo. Moving forward, this method is an attractive platform for rapid ex vivo assessment of murine and human salivary gland tissue responses to therapeutic agents that improve salivary function.

Using three-dimensional organotypic cultures to visualize morphology and functional markers of salivary glands may provide novel insights into the mechanisms of tissue damage following radiation. Described here is a protocol to section, culture, irradiate, stain, and image 50&#8211;90 &#956;m thick salivary gland sections prior to and following exposure to ionizing radiation.

Traitement par rayonnement des cultures organotypiques de modèles de glandes salivaires sous-mandibulaires et parotides clés caractéristiques in vivo

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...