Nous remercions le Pr. Bernard La Scola pour des conseils techniques utiles et intéressante discussion sur coculture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne. Nous remercions également le Dr Vincent Thomas pour son aide dans la mise en œuvre de la technique dans notre laboratoire.

Une. Amibienne Coculture 1.1 Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Échantillons de l&#39;environnement <ol><li> Les échantillons d&#39;eau Filtrer l&#39;échantillon de l&#39;eau (500 ml à 1 litre) à travers une membrane de taille de pore de 0,22 um. Ensuite, secouer la membrane dans amibe salines moyennes des PAS de la page (120 mg de NaCl, 4 mg de sulfate de magnésium 4 • 7H 2 O, 4 mg de CaCl 2 • 2H 2 O, 142 mg de Na 2 HPO 4, et 136 mg de KH 2 PO 4 dans 1 litre d&#39;eau distillée). </li><li> Les échantillons solides Remettre en suspension les échantillons solides tels que la terre ou sable échantillons et des échantillons semi-solides telles que des boues activées dans l&#39;eau distillée ou du PBS et les filtrer à travers une membrane de taille de pore de 0,22 um. Ensuite, secouer la membrane PAS. </li><li> Échantillons fortement contaminés par des amibes endogène et protozoaires Première sédimenter les échantillons par centrifugation à basse vitesse (180 x g) for 10 min ou filtrer à travers une membrane de taille de pores de 5 um. Poursuivre le traitement du surnageant (filtrat respectivement), comme au point 1.1.1. Note: D&#39;autres techniques de décontamination peuvent être utilisées pour décontaminer en outre des échantillons environnementaux: Chauffer l&#39;échantillon à 50 ° C pendant 30 min ou traiter avec des solutions acides ou basiques 14. </li></ol></li><li> Échantillon clinique Traiter les échantillons cliniques en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. Filtrer ou centrifuger les liquides pour éliminer les grosses impuretés. Remettre en suspension les échantillons solides. Pour utiliser les tissus, les broyer, par exemple en utilisant une homogénéiser Dounce ou des billes de verre, et de lyser les cellules pour libérer les bactéries intracellulaires. </li></ol> 1.2 préparation amibes <ol><li> préparation d&#39;un bouillon Préparer les supports suivants: rich media contenant de la peptone, l&#39;extrait de levure et de glucose (PYG; 100 g de peptone protéose, 10 g d&#39;extrait de levure, 4,9 g de MgSO 4 7H 2 •O, 5 g de citrate de sodium • 2H 2 O, 0,1 g de Fe (NH4) 2 (SO4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g de KH 2 PO 4, 1,97 g de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g de glucose, et 0,295 g de CaCl 2 à 5 L d&#39;eau distillée) et un milieu non nutritif tel que PAS pour les espèces Acanthamoeba. </li><li> Culture amibienne <ol><li> Cultiver amibes (Acanthamoeba préférentiellement castellanii ATCC 30010 ou A. polyphaga Linc-AP1) à 25 ° C dans des flacons de culture de cellules contenant 30 ml de milieu PYG. </li><li> Récolter les amibes par agitation vigoureuse de la fiole et centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 1500 x g. Laver le culot deux fois avec du milieu de PAS. Compter les cellules dans une diapositive Kova et régler le volume pour obtenir une suspension de 5 x 10 5 cellules par ml. </li><li> Transférer la suspension amibienne en microplaques. Utilisez 1 ml par puits pour 12 - et 24-wplaques Ell, 500 ul pour des plaques de 48 puits et 300 pl pour plaques à 96 puits. Incuber la microplaque pendant au moins 2 heures à 25 ° C. Ceci permet la sédimentation et la fixation de la amibes au fond de chaque puits. </li></ol></li></ol> 1.3 Coculture <ol><li> inoculation de l&#39;échantillon <ol><li> Inoculer la plaque de 2.3.3 à des dilutions successives de l&#39;échantillon à partir de 1,1 ou 1,2, habituellement avec 10 fois la série de dilution, à partir de 100 ul de l&#39;échantillon non dilué. </li><li> Centrifuger la microplaque à 1800 xg pendant 10 min à sédiments sur la pelouse amibienne les microorganismes potentiellement présents dans l&#39;échantillon. Cela augmente le contact et la phagocytose des micro-organismes par les amibes. </li><li> Incuber les plaques pendant 45 minutes à 25 ° C et laver trois fois avec SAP en remplaçant les médias avec le PAS frais. Ajouter 1 ml par puits de PAS avec ou sans addition d&#39;antibiotiques (streptomycine, de la pénicilline, de gentamicine et / ou à la vancomycine), en fonction de la bactériurieespèces al qui sont recherchées. </li><li> Incuber la microplaque à 32 ° C dans une atmosphère humidifiée pour éviter enkystement du amibes. Observez chaque puits tous les jours avec un objectif 20X pour détecter la présence de bactéries envahissantes et lyse des amibes. </li><li> Dans le cas d&#39;une lyse, effectuer une sous-culture sur des amibes frais par inoculation de 100 ul de co-cultures d&#39;une monocouche d&#39;environ 10 5 amibes / cm 2. Pour isoler spécifiquement une espèce bactérienne donnée, inoculer aussi des médias spécifique agar conçu pour ces bactéries (c.-à-BCYE gélose pour Legionella spp.). </li><li> En l&#39;absence de lyse, prendre 100 pi de co-cultures quatre à sept jours après la première inoculation et inoculer une culture fraîche amibienne de 900 pi dans une plaque de 24 puits. Si la lyse rapide des amibes est observée sans prolifération de bactéries, un virus peut être présent. Dans ce cas, filtrer le surnageant à 0,22 um et utiliser la suspension filtrée pour infecter des amibes frais. </li></ol&gt; </li></ol> 1.4 l&#39;isolement et la caractérisation bactérienne <ol><li> Coloration bactérienne Effectuer co-cultures directement sur des lamelles de verre en microplaques de 24 puits. Retirez le support et effectuer de coloration ou immunofluorescence. <ol><li> Modifié coloration Romanowsky <ol><li> Laissez la lamelle sec. Immerger la lamelle cinq fois dans la solution de fixation (2 mg / L Fast Green dans le méthanol). </li><li> Immerger la lamelle couvre-cinq fois dans la solution de coloration I (1,22 g / L Eosine G dans du tampon phosphate pH 6,6) </li><li> Enfin, immerger la lamelle 5 fois dans la solution de coloration II (1,1 g / L de thiazine dans du tampon phosphate pH 6,6). </li><li> Rincer l&#39;échantillon avec de l&#39;eau distillée. Laissez sécher et observer par microscopie. </li></ol></li><li> Ziehl-Neelsen <ol><li> Laissez la lamelle sec. Couvrir l&#39;échantillon avec Ziehl fuchsine. Chauffer le colorant avec une flamme jusqu&#39;à ce que les vapeurs apparaissent. </li><li> Refroidir à la température ambiante pendant au moins 5 minuteset rincer avec de l&#39;eau distillée. Couverture de l&#39;échantillon avec une solution d&#39;acide chlorhydrique à 3% dans l&#39;isopropanol pendant 2 minutes et rincer à l&#39;eau distillée. </li><li> Couvrir pendant 30 secondes avec du bleu de méthylène et rincer avec de l&#39;eau distillée. Laissez sécher et observer par microscopie 22. </li></ol></li><li> Coloration de Gimenez <ol><li> Préparer une solution de base de fuchsine boursier en mélangeant 100 ml de 10% de fuchsine basique (10 g de fuchsine basique dans 100 ml 95% d&#39;éthanol), 250 ml de 4% de phénol aqueux et 650 ml d&#39;eau distillée. Incuber à 37 ° C pendant 48 heures avant utilisation. </li><li> Laissez sécher la lamelle et le fixer en le faisant passer à travers la flamme. Couvrir l&#39;échantillon avec la fuchsine basique fraîchement filtrée (4 ml de solution de base de fuchsine stock dans 10 ml de 0,1 M de tampon phosphate de sodium, pH 7,45) pendant 2 min. </li><li> Rincer l&#39;échantillon avec de l&#39;eau et incuber dans le vert de malachite (0,8% dans l&#39;eau distillée) pendant 10 secondes. Rincer à nouveau avec de l&#39;eau et répéter coloration vert malachite. Rincer à nouveau avec de l&#39;eau. Laissez la lamelle sec, montant, et observer par microscopie 23. </li></ol></li><li> Immunofluorescence <ol><li> Fixer la lamelle couvre-objet par l&#39;incubation dans du methanol pendant 5 minutes, ou avec du paraformaldéhyde 4% pendant 10 min. </li><li> Laver trois fois avec du PBS et incuber pendant 2 heures dans une solution de blocage (5% de BSA, 0,1% de saponine dans du PBS) à température ambiante. </li><li> Incuber la lamelle couvre pendant 1 heure dans une solution de blocage contenant des anticorps dirigés contre le micro-organisme d&#39;intérêt. </li><li> Laver à nouveau trois fois dans du PBS et incuber pendant 1 heure avec un anticorps secondaire dirigé contre l&#39;anticorps primaire et lié à un fluorophore. Laver trois fois avec du PBS, monter la lamelle couvre-objet et d&#39;observer au microscope à fluorescence. </li></ol></li></ol></li><li> la détection de l&#39;ADN par PCR Extraire l&#39;ADN de 100 à 200 ul de coculture amibienne. Détecter des micro-organismes avec des amorces universelles ciblant le gène de l&#39;ARNr 16S ou des amorces spécifiques pour les espèces d&#39;intérêt tels que les mycobactéries 24, 25 légionelles ou les membres de la 26 Chlamydiales. </li></ol> 2. Enrichissement amibienne 2.1. Préparation de l&#39;échantillon Remettre en suspension les échantillons solides et semi-solides dans le PAS par vortex. Centrifuger la suspension à basse vitesse (180 x g) pendant 10 min. Ceci permet l&#39;enrichissement des amibes libres dans le culot. Le surnageant peut être utilisé pour la co-culture amibienne et le culot 21 pour l&#39;enrichissement amibienne. 2.2. Préparation du milieu <ol><li> Ajouter 1,5 g d&#39;agar-agar à 100 ml de PAS et le milieu à l&#39;autoclave 15 min à 121 ° C. Verser le milieu chaud dans des boîtes de Pétri et laisser solidifier à température ambiante. </li><li> Cultiver Escherichia coli (ATCC 25922) dans un bouillon LB ou thioglycolate pendant une nuit à 37 ° C. Laver les bactéries fois avec du PBS et les remettre en suspension dans un milieu de PAS. Diluer 10x à Pas et répandre 2-3 ml de cette dilution sur une plaque de gélose PAS et laisser sécher. </li></ol> Ajouter une goutte de l&#39;échantillon (ou d&#39;un morceau de filtre) sur un côté de la plaque et laisser s&#39;écouler plus de la boîte de Pétri pour former une ligne au centre du plat. 2.4. Croissance amibienne et sous-culture amibienne <ol><li> Observez la boîte de Pétri quotidien. Si un front de migration amibienne est détectée, découper un petit morceau de gélose à l&#39;avant de la migration et inoculer un plat frais ANI Petri recouverte d&#39;une pelouse de E. coli. </li><li> Répéter plusieurs fois la réinoculation en fonction de la pureté de l&#39;échantillon, afin de disposer d&#39;une culture pure d&#39;une souche donnée amibienne. </li></ol> 2.5. Amibes et les bactéries caractérisation <ol><li> Grattez les cellules et les remettre en suspension dans SAP. </li><li> Extraire l&#39;ADN et déterminer l&#39;identité des amibes et / ou endosymbiontes bactériennes par PCR et séquençage (ARNr 16S amplification pour les bactéries, resp. 18S pour les amibes et séquençage, par exemple). </li> &lt;li&gt; Utilisez ces cellules grattées à Pas pour inoculer amibes frais et effectuer une co-culture amibienne pour détecter les bactéries éventuellement présentes dans l&#39;échantillon. </li></ol>

<ol>
	<li>Fraser, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionnaires'+disease:+description+of+an+epidemic+of+pneumonia.">Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia.</a> New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).</li><li>McDade, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionnaires'+disease:+isolation+of+a+bacterium+and+demonstration+of+its+role+in+other+respiratory+disease.">Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease.</a> New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).</li><li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+report+on+the+pathogenicity+of+Legionella+pneumophila+for+freshwater+and+soil+amoebae.">Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae.</a> J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).</li><li>Rodriguez-Zaragoza, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+free-living+amoebae.">Ecology of free-living amoebae.</a> Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).</li><li>Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+distribution+of+Acanthamoeba+species+genotypes+associated+with+nonkeratitis+infections.">Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections.</a> J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).</li><li>Brussow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+between+protists+and+phages:+from+antipredation+strategies+to+the+evolution+of+pathogenicity.">Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity.</a> Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).</li><li>Greub, G., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microorganisms+resistant+to+free-living+amoebae.">Microorganisms resistant to free-living amoebae.</a> Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).</li><li>Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-living+amoebae+and+their+intracellular+pathogenic+microorganisms:+risks+for+water+quality.">Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality.</a> FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).</li><li>Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia-like+obligate+parasite+of+free-living+amoebae.">Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae.</a> Lancet. 349, 925-926 (1997).</li><li>Amann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obligate+intracellular+bacterial+parasites+of+acanthamoebae+related+to+Chlamydia+spp.">Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).</li><li>Birtles, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidatus+Odyssella+thessalonicensis'+gen.+nov.,+sp.+nov.,+an+obligate+intracellular+parasite+of+Acanthamoeba+species.">Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).</li><li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criblamydia+sequanensis,+a+new+intracellular+Chlamydiales+isolated+from+Seine+river+water+using+amoebal+co-culture.">Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture.</a> Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).</li><li>Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+amoeba-resisting+bacteria+from+water+in+human+environment+by+using+an+Acanthamoeba+polyphaga+co-culture+procedure.">Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure.</a> Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).</li><li>Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+of+amoebae+and+amoebae-resisting+bacteria+in+a+drinking+water+treatment+plant.">Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).</li><li>Corsaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Chlamydiales+strains+isolated+from+a+water+treatment+plant.">Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).</li><li>Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waddlia+chondrophila+enters+and+multiplies+within+human+macrophages.">Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages.</a> Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).</li><li>Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permissivity+of+Vero+cells,+human+pneumocytes+and+human+endometrial+cells+to+Waddlia+chondrophila.">Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila.</a> Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).</li><li>Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permissivity+of+fish+cell+lines+to+three+Chlamydia-related+bacteria:+Waddlia+chondrophila,+Estrella+lausannensis+and+Parachlamydia+acanthamoebae.">Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).</li><li>Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+amplification+and+sequencing+of+the+16S+ribosomal+DNA+of+an+intracellular+Legionella+species+recovered+by+amoebal+enrichment+from+the+sputum+of+a+patient+with+pneumonia.">Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).</li><li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella+pneumophila+serogroup+1+from+human+feces+with+use+of+amebic+cocultures.">Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures.</a> Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).</li><li>Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebae-resisting+bacteria+isolated+from+human+nasal+swabs+by+amoebal+coculture.">Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture.</a> Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).</li><li>Isenberg, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).</li><li>Gimenez, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+Rickettsiae+in+Yolk-Sac+Cultures.">Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures.</a> Stain Technol. 39, 135-140 (1964).</li><li>Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-resisting+bacteria+in+a+hospital+water+network.">Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).</li><li>Miyamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+seminested+PCR+method+for+detection+of+Legionella+species+and+its+application+to+surveillance+of+legionellae+in+hospital+cooling+tower+water.">Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).</li><li>Lienard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+chlamydiales-specific+real-time+PCR+and+its+application+to+respiratory+clinical+samples.">Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).</li><li>Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+mycobacteria+from+soils+at+an+illegal+dumping+site+and+landfills+in+Japan.">Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan.</a> Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).</li><li>Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-associated+bacteria+in+water+treatment+plants.">Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants.</a> Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+drancourtii+sp.+nov.,+a+strictly+intracellular+amoebal+pathogen.">Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).</li><li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Afipia+and+Bosea+strains+isolated+from+various+water+sources+by+amoebal+co-culture.">New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture.</a> Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoeba-resisting+bacteria+and+ventilator-associated+pneumonia.">Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia.</a> Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).</li><li>Collingro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+an+environmental+Chlamydia+strain+from+activated+sludge+by+co-cultivation+with+Acanthamoeba+sp.">Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp.</a> Microbiology. 151, 301-309 (2005).</li><li>Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrella+lausannensis,+a+new+star+in+the+Chlamydiales+order.">Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order.</a> Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+virus+in+amoebae.">A giant virus in amoebae.</a> Science. 299, 2033 (2003).</li><li>Boyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Marseillevirus+highlights+the+role+of+amoebae+as+a+melting+pot+in+emergence+of+chimeric+microorganisms.">Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).</li><li>Thomas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lausannevirus,+a+giant+amoebal+virus+encoding+histone+doublets.">Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets.</a> Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).</li><li>Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+infection+of+a+technician+by+mimivirus.">Laboratory infection of a technician by mimivirus.</a> Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).</li><li>Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parachlamydia+acanthamoebae,+an+emerging+agent+of+pneumonia.">Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia.</a> Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).</li><li>Lamoth, F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebal+pathogens+as+emerging+causal+agents+of+pneumonia.">Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).</li><li>Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+6.">Ch. 6.</a> Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ. Microbiol. , (2012).</li><li>Ovrutsky, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooccurrence+of+Free-Living+Amoebae+and+Nontuberculous+Mycobacteria+in+Hospital+Water+Networks,+and+Preferential+Growth+of+Mycobacterium+avium+in+Acanthamoeba+lenticulata.">Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Coculture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne sont des méthodes efficaces qui ont permis l&#39;isolement de nombreuses nouvelles espèces bactériennes et amibienne. Les résultats obtenus avec ces méthodes confirment la présence ubiquitaire des amibes et les bactéries à la fois d&#39;amibes résistant à l&#39;environnement, et plus intéressant dans les réseaux d&#39;eau d&#39;origine humaine qui sont considérés pour être commandé par des traitements chimiques tels que la chloration, ozonation. Cocul...

Avant l&#39;avènement de diagnostic moléculaire, les micro-organismes présents dans l&#39;environnement niches ou dans des échantillons cliniques sont souvent détectés en les cultivant sur différents milieux sélectifs, principalement sur de la gélose dans des boîtes de Pétri. Le phénotype des colonies bactériennes et leur activité métabolique ensuite laissé classification bactérienne au niveau de l&#39;espèce. Le bouillon peut également être utilisée pour augmenter la sensibilité de détection. Cependant, ces deux techniques ne permettent pas la récupération de bactéries qui se développent lentement ou pas du tout sur ces supports. C&#39;est la raison pour laquelle des approches moléculaires sont si largement utilisés de nos jours. Néanmoins, la détection de l&#39;ADN fournit aucune indication sur la viabilité des bactéries. En outre, contrairement à la culture, les approches moléculaires ne conduisent pas à une souche qui peut être en outre caractérisé. L&#39;étude des agents pathogènes qui se développent mal sur des supports solides ou que les cellules ont besoin pour grandir est compliqué. La plupart de ces «difficile à cultiver&quot; les bactéries sont intr fastidieuxbactéries acellulaire, souvent découverts et caractérisés suivant les grandes épidémies comme ce fut le cas pour Legionella pneumophila. Cette bactérie a été caractérisé suite à une épidémie qui s&#39;est produite au cours d&#39;un congrès de la Légion américaine. Autant que 182 personnes ont été infectées et 29 sont mortes en raison d&#39;une pneumonie sévère de 1,2. Il a ensuite été démontré que les amibes sont les hôtes naturels de cette bactérie et que leur présence dans les réseaux hôtel de système de climatisation et de l&#39;eau est à l&#39;origine de l&#39;éclosion de la maladie de la soi-disant légionnaire 3. Les amibes sont présents dans le monde entier et ont été isolés à partir du sol, l&#39;air, l&#39;eau et la muqueuse nasale de volontaires humains (revue en 4). Ces amibes &quot;libre-vie» sont généralement divise de manière autonome dans l&#39;environnement, mais peut parfois envahir hôtes permissives 5. l&#39;alimentation des amibes sur divers micro-organismes par phagocytose et après digestion lysosomale par hydrolases 6. Beaucoup de bactéries intracellulaires facultatives ou obligeront sont capables de résister à la digestion et donc d&#39;infecter et de diviser en amibes comme par exemple des bactéries ou des mycobactéries Legionella, Chlamydia liées (revu en 7 et 8). Amibes libres représentent probablement un réservoir important potentiel pour les bactéries intracellulaires qui l&#39;ont pas encore été découverts. Cela a conduit notre groupe à mettre en œuvre à Lausanne deux techniques principales, appelées co-culture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne, qui ont permis d&#39;isoler les différents groupes de plusieurs nouveaux micro-organismes intracellulaires obligatoires à partir de divers échantillons environnementaux 9-15. Depuis amibes sont des phagocytes professionnels qui paissent sur les bactéries, une bactérie capable de résister à la phagocytose et à se développer à l&#39;intérieur de ces protistes peut également coloniser les phagocytes humains et être pathogène envers les humains. Ceci a été partiellement démontrée pour certaines bactéries Chlamydia liés, tels que Waddlia chondrophila. W. chondrophila peut se développer non seulement dans les amibes, mais également dans plusieurs types de cellules telles que des cellules épithéliales de mammifères, les macrophages, et les lignées cellulaires de poisson de 16 à 18. La co-culture amibienne semble également pertinent pour détecter des bactéries intracellulaires dans des échantillons cliniques, y compris 19,20 selles qui sont fortement contaminés par les différentes espèces bactériennes 21. Nous décrivons ici les principales étapes de co-culture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne, y compris (a) le traitement des échantillons environnementaux ou cliniques; (b) la croissance des amibes sur les médias axéniques et sur ​​une pelouse bactérienne d&#39;Escherichia coli et (c) la sélection et la caractérisation des bactéries intracellulaires.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m pore size membrane</td>
			<td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td>SCVPU11RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteose peptone</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>353135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kova slide</td>
			<td>Hycor, Indianapolis, IN</td>
			<td>87144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture microplates</td>
			<td>Corning Inc, Corning, NY</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff-Quik staining kit</td>
			<td>Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany</td>
			<td>130832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziehl fuchsin</td>
			<td>Fluka, St-Louis, MI</td>
			<td>21820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic fuchsin</td>
			<td>Sigma, St-Louis, MI</td>
			<td>857843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma, St-Louis, MI</td>
			<td>P1037</td>
			<td>Corrosive and mutagenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Fluka, St-Louis, MI</td>
			<td>63160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma, St-Louis, MI</td>
			<td>84510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches

Pathogènes intracellulaires tels que les légionelles, les mycobactéries et organismes Chlamydia-like sont difficiles à isoler car ils poussent souvent mal ou pas du tout sur des milieux sélectifs qui sont habituellement utilisés pour cultiver des bactéries. Pour cette raison, beaucoup de ces agents pathogènes ont été découverts que récemment ou à la suite des flambées importantes. Ces agents pathogènes sont souvent associés à des amibes, qui servent de la cellule hôte et de permettre la survie et la croissance des bactéries. Nous avons l&#39;intention ici de fournir une démonstration de deux techniques qui permettent l&#39;isolement et la caractérisation de pathogènes intracellulaires présents dans les échantillons cliniques ou environnementaux: la co-culture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne. Coculture amibienne permet la récupération des bactéries intracellulaires en inoculant l&#39;échantillon étudié sur une pelouse amibienne qui peut être infectée et lysée par des bactéries intracellulaires présentes dans l&#39;échantillon. Amibienne enrichissement permet la récupération d&#39;amibes présent dans un échantillon clinique ou environnementale. Thest peut conduire à la découverte de nouvelles espèces amibienne, mais aussi de nouvelles bactéries intracellulaires croissance spécifiquement dans ces amibes. Ensemble, ces deux techniques permettent de découvrir de nouvelles bactéries intracellulaires capables de se développer dans les amibes. En raison de leur capacité à infecter les amibes et résister à la phagocytose, ces bactéries intracellulaires peuvent aussi échapper à la phagocytose par les macrophages et, par conséquent, être pathogènes pour les eucaryotes supérieurs.

Utilisation de co-culture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne, toute une gamme de bactéries de l&#39;environnement et / ou pathogènes ont été découverts (tableau 1). Coculture amibienne a été utilisé par notre groupe et d&#39;autres pour analyser des échantillons environnementaux, les usines de traitement de l&#39;eau et des systèmes de distribution d&#39;eau. Un large éventail de microorganismes a pu être isolé par cette technique. Les bactéries les pl...

Watch this Scientific Journal Video about Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches at JoVE.com

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Coculture amibienne est un système de culture cellulaire en utilisant des amibes adhérente à croître sélectivement les pathogènes intracellulaires capables de résister à des cellules phagocytaires telles que les amibes et les macrophages. Il représente donc un outil essentiel pour découvrir de nouveaux agents infectieux. Enrichissement amibienne permet de découvrir de nouvelles espèces amibienne et de leurs bactéries intracellulaires spécifiques.

Découverte de nouveaux agents pathogènes intracellulaires par amibienne Coculture et approches amibienne enrichissement

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

discovery-new-intracellular-pathogens-amoebal-coculture-amoebal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.4K vues.  University Hospital Center and University of Lausanne.  Coculture amibienne est un système de culture cellulaire en utilisant des amibes adhérente à croître sélectivement les pathogènes intracellulaires capables de résister à des cellules phagocytaires telles que les amibes et les macrophages. Il représente donc un outil essentiel pour découvrir de nouveaux agents infectieux. Enrichissement amibienne permet de découvrir de nouvelles espèces amibienne et de leurs bactéries intracellulaires spécifiques. 

Vidéo: Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Recherche

Immunologie et infection

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Simples mesures de cellules de rupture Vacuolar causées par des pathogènes intracellulaires

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d&#39;ions concentrations dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation des colorants fluorescents

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier Rénovation du système Endo-lysosomale par des bactéries intracellulaires

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Transformation biolistique d&#39;un fluorescent Tagged Gene dans la opportuniste pathogène fongique<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualisation de SNARE intracellulaire traite par Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika Virus spécifique Diagnostic épitope découverte

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monocouches de Colonoid humain pour étudier les Interactions entre les pathogènes, germes commensaux et hôte épithélium Intestinal

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...