Ce travail a été soutenu par une Lundbeck Junior Group Leader Bourse de LNN. PWW reconnaît le soutien financier de la subvention du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et. Nous remercions également le danois moléculaire Bioimaging Centre à l&#39;Université du Danemark du Sud pour l&#39;accès à la filature microscopie disque.

Acquisition des protéines EGFP-marqué dans la membrane du plasma pour l&#39;analyse des CIEk peut être fait sur un microscope à épifluorescence, une configuration de TIRF ou sur un microscope à disque rotatif fixé à acquérir des images de la membrane d&#39;intérêt. La taille de pixel caméra ainsi que le temps entre les trames d&#39;image sont nécessaires pour l&#39;analyse. Les séquences d&#39;images de 100-1,200 images à un taux de 4-30 Hz cadre peuvent être utilisés pour l&#39;analyse. Au cours de l&#39;acquisition, il est important de maintenir la membrane à l&#39;orientation tout au long de la durée de l&#39;imagerie et de se concentrer sur une fraction de la membrane à plat dans laquelle la fluorescence est uniformément répartie. Déménagement vésicules, dépassant les régions membranaires et des organites cellulaires peut être cultivé plus tard dans le processus d&#39;analyse. Le temps d&#39;acquisition doit être choisi de sorte qu&#39;il n&#39;y ait pas de dérive ou du mouvement de la cellule. Pour obtenir les scripts de code CCI pour MATLAB, communiquez avec Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). La première fois que le code est utilisé CIEk, MAT ouvertLAB et cliquez sur le fichier, puis définissez le chemin, puis cliquez sur ajouter des sous-dossiers et trouver le dossier sur l&#39;ordinateur dans lequel le code CIEk se trouve. Puis cliquez sur OK, enregistrer et fermer. Maintenant, continuez avec l&#39;analyse des cultures décrites dans les points suivants. 1. Importer la séquence d&#39;images d&#39;intérêts dans un programme d&#39;analyse d&#39;imagerie comme une pile TIFF Enregistrez le fichier avec le nom: stack1.tif. <ol><li> Sélectionnez une région rectangulaire d&#39;intérêt (ROI) à la partie plate de la membrane à l&#39;exclusion des organites cellulaires mobiles et dépassant les régions de la membrane. La taille de la récolte est choisi de telle sorte que suffisamment de statistiques sont générées pour bien k 2 parcelles. </li><li> Recadrage de la région et de sauver la récolte en tant que fichier TIFF dans un dossier approprié. S&#39;il ya plusieurs cultures par le même film, utiliser un incrément de nombre, par exemple «stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif&quot;. </li><li> Placez le dossier contenant les cultures localementsur l&#39;ordinateur, pas sur un serveur, tout en faisant l&#39;analyse des CCI. </li></ol> 2. Importez les cultures dans le logiciel d&#39;analyse de One by One pour effectuer l&#39;analyse <ol><li> Ouvrir MATLAB et le type &quot;icsgui&quot; dans la fenêtre de commande et appuyez sur ENTRÉE. ICS GUI est le nom de l&#39;exécutable pour le programme d&#39;interface graphique utilisateur de spectroscopie de corrélation de l&#39;image. </li><li> Dans l&#39;interface graphique de ICS cliquez sur l&#39;onglet &quot;CIEk&quot;. Une capture d&#39;écran de la fenêtre d&#39;analyse est représenté sur la figure 1. </li><li> Trouver le dossier avec le nom du dossier &quot;code MATLAB&quot; et sélectionnez le fichier avec le nom de fichier &quot;Scripts&quot; et l&#39;ouvrir en double-cliquant dessus. Sinon, cliquez droit sur le fichier et sélectionnez &quot;ouvrir avec MATLAB&quot; ou allez dans Fichier, ouvert dans MATLAB et ouvrez le fichier son. Ce fichier est appelé Editor. </li><li> Dans le livre de l&#39;éditeur de &quot;données CCI de charge ensembles&quot;, puis copier ou nom de fichier de type et l&#39;emplacement du dossier dans la ligne de commande qui commenceavec img = par exemple &quot;C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif&quot;. Dans la ligne de commande ci-dessous l&#39;emplacement du dossier définir le nombre d&#39;images à analyser - par exemple [1:500]. Utiliser les mêmes paramètres pour tous les films consécutifs de la série de données. S&#39;il ya dérive accent dans des cadres plus tard, ceux-ci devraient être exclus de l&#39;analyse. </li><li> Dans l&#39;éditeur cliquez sur &quot;enregistrer&quot; puis cliquez sur &quot;évaluer cellule&quot;. L&#39;ensemble de données est maintenant chargé dans dans le logiciel d&#39;analyse. </li><li> Dans la fenêtre Analyse CIEk dans l&#39;interface graphique, entrez les paramètres de l&#39;analyse: <ol><li> Décochez boîtes &quot;de cellules T&quot;. </li><li> Entrez le nombre de décalages dans le temps à analyser. Le nombre de retards de temps (τ) aura un effet sur la parcelle de diffusion et doit être choisi de telle sorte que l&#39;intrigue de diffusion est linéaire. Commencez par entrer 25, puis diminuer à l&#39;endroit où le tracé de diffusion est linéaire. τ est le nombre de décalages dans le temps de l&#39;analyse des CIEk compare et un décalage dans le temps est le temps bntre une trame et la suivante. La plus petite valeur qui donne un tracé linéaire doit être sélectionné. Le nombre maximum de décalages dans le temps est choisi de telle sorte que d&#39;un ajustement linéaire est obtenue, en choisissant une valeur plus élevée de produire des données qui ne peuvent pas être montés en ligne. </li><li> Entrez la valeur maximale k 2 (voir cercle 1 dans la figure 1), il est habituellement de 20-50. Un bon k 2 intrigue est un complot dans lequel il ya de nombreux points qui sont répartis le long d&#39;une ligne de données. Commencez par entrer 70, puis diminuer après avoir évalué les k 2 et de diffusion des parcelles et sélectionnez la valeur la plus faible de la grappe de points de données autour d&#39;une ligne droite. La valeur de 2 k est l&#39;amplitude au carré de la k-vecteur spatial dans l&#39;espace de Fourier. Initialement, l&#39;analyse doit être répétée jusqu&#39;à ce que les meilleures valeurs sont déterminées, puis utiliser les mêmes paramètres pour tous les films consécutifs de la série de données, mais toujours vérifier que les réglages sélectionnés donnent un bon ajustement aux données: bien k 2 parcelleset un terrain de diffusion linéaire. </li><li> Cliquez sur &quot;paramètres de magasins et de procéder&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;oui&quot; pour afficher tous les graphiques. </li><li> Cliquez sur &quot;série d&#39;images de charge&quot; (voir cercle 2 de la figure 1), puis cliquez sur &quot;espace de travail&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;imgSerCrop&quot;, puis cliquez sur &quot;Importer à partir d&#39;espace de travail&quot;. </li><li> Entrez les paramètres de collecte du système d&#39;imagerie. Dans la &quot;taille de pixel&quot; boîte entrer la taille du pixel projeté pour le système de formation d&#39;image à laquelle les piles d&#39;images sont acquises. Pour AQP3-EGFP, 0.111 ont été utilisés. Dans la zone &quot;Entrer l&#39;heure (s) entre les images&quot;, 0,1150 a été utilisé pour AQP3-EGFP. </li><li> Cliquez sur &quot;sélectionner ROI&quot;, entrer &quot;1&quot;, cliquez sur OK et &quot;utiliser l&#39;image entière&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;analyse Do CIEk&quot; et cliquez sur Oui pour faire &quot;filtrage immobile&quot;. Résultats s&#39;ouvriront automatiquement comme des images. </li><li> Réduire la fenêtre des paramètres, de minimiser les informations de cellule window, et minimiser la fenêtre de photophysique. Dans la fenêtre dynamique, vérifiez que l&#39;intrigue de la dynamique montre un ajustement linéaire des données à une ligne avec une pente négative ce qui signifie que les points de données en corrélation et la diffusion libre peuvent être assumées. Enregistrer le coefficient de diffusion pour le laps de temps spécifique et k 2 paramètres (il n&#39;est pas nécessaire de noter l&#39;écart-type de l&#39;ajustement). Les points de données dans les k 2 parcelles doivent être regroupés autour de la ligne pour le moment donné traîne. </li><li> Cochez la case &quot;Enregistrer figures ouvertes que des images&quot;, puis cliquez sur &quot;Sauvegarder figures ouvertes que les images&quot; pour enregistrer des fichiers en résultant. Enregistrer dans un nouveau dossier sous C: Users Documents AQP3diffusion. Cliquez sur &quot;données actuelles clair&quot; et continuer avec l&#39;analyse de la prochaine récolte. </li></ol></li></ol> 3. Moyen du coefficient de diffusion calculé est calculée pour obtenir une vue d&#39;ensemble des données analysées <ol><li> Entrez les coefficients de diffusion individuels de chaque ROI dans un spreadsheet (assurez-vous de noter le τ et k 2 valeurs), utilisez les noms des cultures que fixé ci-dessus. </li><li> Calculer le coefficient de diffusion moyenne et écart-type à l&#39;aide d&#39;un tableur. </li><li> Effectuez un test de Kolmogorov-Smirnov ou étudiants t-test pour évaluer les différences statistiques en utilisant un niveau de signification de 5%. Quantitave comparaisons entre les cellules (par exemple traitées vs non traitées) peuvent être faites. </li><li> Ouvrez la version de feuille de calcul des parcelles de diffusion qui a été généré par le logiciel d&#39;analyse pour chaque culture, et la moyenne des données pour chaque condition pour chaque décalage. Générer un nouveau terrain de diffusion moyenne pour présenter dans des documents ou des présentations. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li><li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules.">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li><li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ce document présente un aperçu détaillé étape par étape de la façon d&#39;appliquer la méthode d&#39;analyse des CIEk pour déterminer les coefficients de diffusion à partir d&#39;images de microscopie de protéines marquées avec des protéines fluorescentes. L&#39;analyse est indépendant du choix de la sonde avec une très large gamme dynamique de la densité de marquage et peut donc également être appliquée à des protéines marquées avec des points quantiques ainsi que des colorants et des protéines f...

L&#39;organisation spatio-temporelle quatre dimensions et la mobilité latérale des protéines membranaires plasmatiques sont strictement réglementées et peuvent jouer un rôle dans la fonction de la protéine, l&#39;activité et les interactions protéine-protéine. Diffusion latérale des protéines de la membrane de plasma, a traditionnellement été étudiée en calculant les coefficients de diffusion pour les particules individuelles à partir de l&#39;imagerie time-lapse de point quantique ou un colorant des protéines marquées de la membrane plasmique 2-4. Cette approche nécessite l&#39;insertion d&#39;une étiquette extracellulaire dans le plasma protéine membranaire de point quantique ou un marquage par un colorant, qui peut compromettre le pliage et la fonction des protéines et, par conséquent, ne peut être réalisé pour certaines protéines. Le volume stérique d&#39;un point quantique a été montré pour ralentir la diffusion de la protéine 5 et plus, seule une infime fraction des protéines de la population sont étiquetés avec des points quantiques, et on ne sait pas si cette fraction est représentatif pour l&#39;ensemble de un groupe de protéines de membrane de plasma. Tra de particules simplescking (SPT) des mesures de coefficients de diffusion de la série d&#39;image de protéines marquées de points quantiques consiste à cartographier les positions des pics de représentation des particules avec deux dimensions gaussien Convient suivis par de vastes algorithmes d&#39;analyse. L&#39;analyse est de calcul très intense, ce qui nécessite de courbe non linéaire étendu raccord à chaque trame d&#39;image d&#39;une séquence time-lapse à des approximations de la fonction microscope d&#39;étalement de point (typiquement deux dimensions gaussiennes spatiale) et la liaison subséquente des positions des particules dans les trajectoires des particules décrivant l&#39; mouvement des molécules simples 6,7. Une technique de corrélation d&#39;images récemment mis au point, k-image de l&#39;espace spectroscopie de corrélation (CCI) permet des mesures relativement simples de coefficients de diffusion de fluorescence protéines marquées de la membrane plasmique. La possibilité de calculer systématiquement les coefficients de diffusion des protéines membranaires avec des protéines fluorescentes marquées par CIEk est un outil unique qui maintientplusieurs avantages par rapport quantique traditionnelle dot analyse SPT: Aucune insertion de balises et temps extracellulaires consommateurs étiquetage extracellulaire est nécessaire (lignées de cellules exprimant des protéines fluorescentes peuvent être utilisés); les coefficients de diffusion sont extraites à partir du pool total de protéines fluorescentes par rapport à un sous-ensemble marqué avec des points quantiques; analyse est simple, sans la nécessité de suivre certaines protéines et l&#39;analyse peut être effectuée en utilisant un code existant sans nécessiter de programmation supplémentaire de l&#39;utilisateur. La méthode est rapide car il s&#39;agit d&#39;une technique de calcul de moyenne, qui permet un calcul rapide et le calcul des coefficients de diffusion. Ces mesures de diffusion rapide de la population en protéines complètent l&#39;information de transport moléculaire plus détaillée obtenue pour un sous-ensemble de la population par les méthodes SPT laborieux. temps CIEk corrélation microscopie de fluorescence des séquences d&#39;images qui ont d&#39;abord été transformées à l&#39;espace de Fourier, et ainsi sépare flfluctuations uorescence raison de photophysique de celles dues au transport moléculaire 1. En conséquence, les CCI peuvent déterminer la densité en nombre, de la vitesse d&#39;écoulement, et la diffusion des molécules marquées par fluorescence tout en étant biaisée par photoblanchiment complexe ou le clignotement des fluorophores. Cela rend CIEk un outil utile pour déterminer rapidement la dynamique de diffusion de protéines membranaires de cellules marquées par fluorescence, sans la nécessité d&#39;algorithmes d&#39;écriture personnalisées. En plus des protéines marquées par fluorescence, CIEk peuvent également être appliquées à des protéines de membrane quantiques point marqué 8. Cet article fournit une introduction étape par étape comment utiliser CIEk pour extraire les coefficients de diffusion des protéines de la membrane plasmique EGFP-marqués en démontrant comment placer la culture, comment utiliser le code et comment évaluer les tracés générés, dont la diffusion les coefficients sont extraits. A titre d&#39;exemple, les données obtenues par filage ensemble disque-microscopie en réflexion totale interne semi-fluorescenceMode nce (FRBR), d&#39;une protéine canal rénale de l&#39;eau aquaporine-3 (AQP3) étiqueté avec EGFP est présenté.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

Diffusion latérale et la compartimentation des protéines de la membrane plasmique sont strictement réglementées dans les cellules et donc, l&#39;étude de ces processus va révéler de nouvelles perspectives à plasma fonction de la protéine de la membrane et de la réglementation. Récemment, k-image de l&#39;espace spectroscopie par corrélation (CCI) 1 a été développé pour permettre des mesures de routine de coefficients de diffusion directement à partir des images des protéines de la membrane plasmique marquées par fluorescence, qui ont évité les biais systématiques introduites par photophysique de la sonde. Bien que la base théorique pour l&#39;analyse est complexe, le procédé peut être mis en oeuvre par des non experts en utilisant un code librement disponible pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines. CIEk calcule une fonction de corrélation temporelle d&#39;une image de microscopie à fluorescence pile après transformation de Fourier de chaque image pour réciproque (k-) espace. Par la suite, une moyenne circulaire, logarithme naturel transformée linéaire et correspond à la fonction de corrélation donne le coefficient de diffusion. Cedocument fournit un guide étape par étape pour l&#39;analyse d&#39;image et la mesure des coefficients de diffusion via CIEk. D&#39;abord, une image d&#39;une séquence de protéines de membrane de plasma marqué par fluorescence de cadence élevée est acquise en utilisant un microscope à fluorescence. Puis, une région d&#39;intérêt (ROI) en évitant organites intracellulaires, les vésicules se déplaçant ou en saillie régions de la membrane est sélectionné. La pile de retour sur investissement est importé dans un code librement disponible et plusieurs paramètres définis (voir la section Méthode) sont définis pour l&#39;analyse des CCI. Le programme génère alors une «pente des pentes« complot des fonctions de corrélation de temps k-espace, et le coefficient de diffusion est calculée à partir de la pente de la courbe. Voici une procédure étape par étape CIEk pour mesurer le coefficient de diffusion d&#39;une protéine de membrane à l&#39;aide du rénale canal d&#39;eau aquaporine-3 marqués avec EGFP comme un exemple canonique.

Pour acquérir des piles d&#39;images convenant pour être analysés à l&#39;aide CIEk, des microscopes différents peuvent être utilisés. Il est possible d&#39;analyser des séquences d&#39;images à partir d&#39;un microscope à épifluorescence, ainsi que d&#39;une configuration de disque TIRF ou filage. La membrane doit être plat, sans grandes organites cellulaires mobile ou le déplacement des vésicules / objets. Cet article présente une séquence d&#39;images de laps de temps de AQP3 étiqueté avec EGFP dan...

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Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Ce document fournit un guide étape par étape pour la technique d&#39;analyse de fluctuation k-image de l&#39;espace spectroscopie de corrélation (CCI) pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines marquées par fluorescence de la membrane plasmique des cellules de mammifères vivants.

Facile mesure de coefficients de diffusion de EGFP-marqués plasma protéines membranaires en utilisant K-image de l&#39;espace spectroscopie de corrélation

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

easy-measurement-diffusion-coefficients-egfp-tagged-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K vues.  Aarhus University.  Ce document fournit un guide étape par étape pour la technique d'analyse de fluctuation k-image de l'espace spectroscopie de corrélation (CCI) pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines marquées par fluorescence de la membrane plasmique des cellules de mammifères vivants. 

Vidéo: Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

Mesure des coefficients de diffusion par deux photons de récupération de fluorescence après photoblanchiment

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Recherche

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

La quantification des protéines à l&#39;aide d&#39;enrichissement d&#39;immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Cartographie Diffusion moléculaire dans la membrane plasmique par multiple-cible de Recherches (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasma Membrane déformations Avec pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

Utilisation de corrélation d&#39;images à caractériser les souches locales sur des échantillons de tissus vasculaires

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...