Les auteurs tiennent à remercier le Dr Charles Keese, le Dr Christian Renken, Christian Dehnert (Applied Biophysique Inc.) et le Dr Ulf Radler (ibidi GmbH) pour leurs conseils, l&#39;aide et les discussions fructueuses lors de la préparation de ce manuscrit. En outre, nous tenons à remercier Jan van Bezu pour son excellent soutien technique.

Une. Préparation du système de mesure <ol><li> Préchauffer le support de matrice dans un incubateur à 37 ° C avant de commencer l&#39;expérience, afin d&#39;éviter la condensation. </li><li> Remplir cercueil d&#39;eau de l&#39;incubateur avec de l&#39;eau distillée pour éviter le séchage des puits. </li><li> Effectuer toutes les manipulations sur les cellules et les réseaux dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles. </li></ol> 2. Préparation de tableaux et inoculation des cellules REMARQUE: Les matrices de ECIS doivent être nettoyés et stabilisée avant une expérience visant à empêcher la dérive d&#39;électrodes, afin d&#39;améliorer la reproductibilité du puits à puits et un rapport signal-sur-bruit. Par conséquent, deux options sont disponibles: A) prétraitement des électrodes avec la fonction de stabilisation de l&#39;ECIS L-cystéine et B). Option A: L-cystéine est recommandé que le pré-traitement plus uniforme, mais peut, dans certains cas particuliers, d&#39;interagir avec la protéine Revêtementsgs sur les électrodes. Les volumes présentés sont utilisés pour les tableaux 8 puits standard. <ol><li> Ajouter 200 ul / puits de 10 mM de L-cystéine. Cystéine nettoie et modifie la surface d&#39;électrode fournissant une capacité élevée et reproductible électrode. </li><li> Incuber 15 min à température ambiante (RT). </li><li> Laver deux fois 500 pl / puits avec de l&#39;eau ultra-pure (type 1). Ne pas utiliser de tampons phosphates, qui peuvent interférer avec l&#39;adsorption de certaines protéines. Evitez également les solutions contenant du sérum avant le revêtement, la surface de l&#39;or va adsorber les premières macromolécules apportés en contact. </li><li> Manteau avec 200 pl / puits chaud 1% de gélatine. </li><li> Incuber 30 min à 37 ° C. </li><li> Retirer la gélatine, mais ne laissez pas sécher la surface. Cela peut endommager les électrodes. </li><li> Laver une fois avec de l&#39;eau ultra-pure (type 1). </li><li> Ajouter 400 ul / puits de milieu complet de culture de cellules (contenant du sérum, les antibiotiques et les facteurs de croissance). </li><li> tableau de diapositives dans un tableau porte und s&#39;assurer que le réseau est positionné de telle sorte que les neuf or pads carrés sont correctement contactés par les broches de pogo ressort et la vis de réglage de correction à la main. Soyez prudent avec les tableaux transparents, la couche d&#39;or peut facilement être endommagé. </li><li> Ouvrez le programme d&#39;installation du logiciel de mesure et presse suivie par chèque dans la section «Collecte des données» pour effectuer une mesure d&#39;impédance rapide de chaque puits. Les valeurs obtenues sont la base de mesure et seront automatiquement stockés dans les &quot;Commentaires&quot;. </li><li> Le contrôle de puits détermine automatiquement le type de tableaux ECIS utilisé. Vérifiez les tableaux sélectionnés dans la section &quot;Bien Configuration&quot;. </li><li> Le schéma de tableau s&#39;allume en vert pour les puits sont correctement raccordés et rouge pour les puits raccordés vides ou incorrectes. Pourtant, assurez-vous toujours que les tableaux ont été placés correctement dans le support. REMARQUE: Si le nettoyage et le revêtement ont réussi les tableaux 8W1E ECIS ont acapacitance d&#39;environ 5 nF et les matrices de 8W10E de 50 nF, ce qui se traduit par une résistance de référence de l&#39;ordre de 200 Ω et 2000, respectivement. </li><li> Retirer tableau de titulaire. </li><li> des cellules de semences sous forme de suspension de cellules individuelles dans 400 ul / puits de milieu complet de culture cellulaire. </li></ol> Option B: La fonction de stabilisation de l&#39;ECIS peut être utilisé comme une alternative ou en combinaison avec le traitement de la L-cystéine et si les problèmes de dérive de la chaîne ou de grandes différences dans la résistance et la capacité du puits à puits se produisent. <ol><li> Effectuer un traitement de cysteine ​​(en option) et des électrodes de pré-couche avec de la protéine (en option). </li><li> Ajouter 200 ul / puits de milieu complet à chaque puits et placer la matrice dans le porte-matrice. </li><li> Ouvrez le logiciel de mesure et appuyez sur Configuration suivie Cocher pour vérifier le réseau est correctement connecté et à mesure initiale Z, R et C. </li><li> Stabiliser les électrodes en appuyant sur <strong&gt; Stabiliser dans la section «Collecte des données». L&#39;ECIS appliquera un courant élevé (ca. 3 mA), haute fréquence (64 kHz) impulsion de nettoyer les électrodes. </li><li> Vérifiez à nouveau les électrodes. Capacité devrait être augmentée et les valeurs de résistance doivent être dans une gamme comparable. </li><li> Si les valeurs de capacité et de résistance sont toujours pas satisfaisants, répétez la stabilisation. </li><li> Retirer tableau du support et inoculer des cellules. </li></ol> 3. Mise en place le logiciel de mesure et d&#39;acquisition de données <ol><li> Placer la matrice dans le porte-matrice comme décrit précédemment. </li><li> Ouvrez le logiciel de mesure et appuyez sur le bouton Configuration dans la section «Collecte des données» pour connecter le logiciel de l&#39;ECIS à l&#39;instrument ECIS et exécuter un autre bien Vérifier. </li><li> Vérifiez les tableaux sélectionnés dans la section &quot;Bien Configuration&quot;. </li><li> Sélectionnez les puits à mesurer dans la &quot;Eh bien Configuratsection ion &quot;. </li><li> Sélectionnez le mode de mesure parmi les options &quot;recueillir des données&quot;: <ol><li> Pour une série de temps à une fréquence fixe, sélectionnez la fréquence unique. / Heure (SFT) et choisir la fréquence de mesure de la menu déroulant. </li><li> Pour la mesure de la couverture de l&#39;électrode et de la modélisation de Rb et Alpha, sélectionnez la fréquence multiple. / Heure (MFT). Le dispositif ECIS mesure automatiquement à toutes les fréquences disponibles. </li><li> Pour micromouvements (voir l&#39;analyse de données), sélectionnez Heure rapide Collect (RTC) et d&#39;ajuster la fréquence de mesure et la fréquence d&#39;échantillonnage. Voici la résolution temporelle standard est un échantillon par seconde (1 Hz), mais la fréquence d&#39;échantillonnage peut également être augmentée pour suivre les changements rapides de l&#39;impédance jusqu&#39;à 25 Hz (pour le Z-Theta). Note importante: en mode RTC un seul puits est mesurée. REMARQUE: Si micromouvements doivent être mesurés dans plusieurs puits par la suite, cliquez sur Aide&gt; Afficher la barre articles d&#39;experts / menu Outils&gt; Acquire&gt; Multi-Eh bien RTC. Spécifiez le Délai (h) dans la section de Collecter les données; la ECIS va maintenant mesurer les puits sélectionnés dans l&#39;ordre numérique. Après le démarrage de la mesure, le logiciel vous demandera de spécifier le nombre de cycles. Entrez la valeur de la fréquence de la mesure doit être répétée. </li></ol></li><li> Pour SFT et MFT, sélectionnez l&#39;intervalle de temps (sec) entre les mesures ou si les données doivent être acquis aussi vite que possible laisser cette option désactivée. REMARQUE: Pour obtenir des données du dispositif d&#39;ECIS utilise un multiplexeur de passer d&#39;un puits à l&#39;autre avec un taux minimum d&#39;acquisition SFT de 0,25 s et 7,5 s pour MFT. Signification de l&#39;intervalle est fonction du nombre de puits sélectionnés et les fréquences. Pour les mesures sur les cellules en prolifération lente ou un simple enregistrement de la résistance en fonction du temps, en utilisant des intervalles de 600 s ou plus. </li><li> Appuyez sur Démarrer, nommez le fichier et sélectionnez l&#39;emplacement de stockage des données. REMARQUE: La taille du fichier ne doit pas être un problème, puisque les données ECIS sont enregistrées dans un type de format de texte brut appelé *. abp, qui ne dépasse jamais quelques centaines de Mo, même avec toutes les fréquences de mesure et le nombre de puits sélectionnés. </li><li> Arrêtez exécuter en appuyant sur ​​Terminer. </li></ol> 4. Changement moyen et Manipulation de cellules <ol><li> Appuyez sur Pause, cela arrêtera l&#39;acquisition de données, mais continuer à fonctionner l&#39;horloge expérimentale. </li><li> Enlever la matrice du support et de manipuler le cadre d&#39;un banc à flux laminaire (ie moyen de changement). </li><li> Placez tableau dans son support et cliquez sur Vérifier la connexion soit ou CV Expérience de poursuivre l&#39;acquisition de données. Le logiciel de mesure va placer un repère temporel dans le jeu de données. </li></ol> 5. Stimulation aiguë lors de l&#39;acquisition de données REMARQUE: Une deuxième option consiste à manipuler les cellules lors de l&#39;acquisition de données pour le suivi des changements immédiats. Ceci n&#39;est possible que; Lorsque les échantillons ne doit pas être stérile dans la suite de l&#39;expérience. <ol><li> Ajouter le stimulus directement au bien et assurez-vous de mélanger prudent avec une pipette ul 200. </li><li> Point Time Mark manuellement en appuyant sur ​​Mark et ajouter un commentaire. </li></ol> 6. Blessant électrique REMARQUE: Trouver les bons réglages pour le type de cellule utilisée est la clé pour blessures électrique. Si blessant est trop courte, cela peut entraîner la suppression insuffisante des cellules, alors que si la blessure est trop long et / ou rugueux, cela peut endommager les électrodes (en particulier sur les réseaux transparents). Par conséquent, plusieurs impulsions de courte blessantes sont recommandés. Pour les cultures HUVEC deux longue blessantes impulsions 10-20 sec de 5 V à 60 kHz chacun ont été trouvés optimale en utilisant la ECIS 1600R. En général, il est recommandé d&#39;utiliser des fréquences élevées&gt; 20 kHz à maintenir des hauts champs uniformes dans les cellules et d&#39;éviter d&#39;endommager les électrodes. <ol><li> Effectuer blessant pendantment une mesure ECIS active. </li><li> Activer Blessure / Setup électroporation, puis cliquez sur la plaie et remplir le temps (sec), la tension de la plaie (V pour 1600 R) ou en cours (uA pour Z et Z-Theta) et la fréquence (Hz). Les valeurs par défaut affichés sont basés sur le type de tableau et le dispositif de l&#39;ECIS. </li><li> Sélectionnez les puits de blesser dans la section &quot;Bien Configuration&quot;. Seuls les puits cochés seront blessés. </li><li> Activer Retarder jusqu&#39;à Heure et remplir le temps de retard pour activer la fonction retard de la plaie. Cette fonction peut être arrêtée à tout moment en appuyant sur ​​Stop ou l&#39;application d&#39;une blessure à la main. Seule une commande de retard peut être actif à la fois. </li><li> Appuyez sur Activer, puis cliquez sur OK dans la fenêtre pop-up pour commencer blessant. </li><li> Assurez-vous que le signal de la résistance tombe à l&#39;impédance décalée après blessure, sinon répéter la blessure. </li></ol> 7. Analyse des données </p&gt; <ol><li> Représentation des données et l&#39;exportation. <ol><li> mesure de finition ou charger des données défini via Fichier -&gt; Ouvrir. </li><li> Sélectionnez puits à afficher dans la fenêtre &quot;configuration bien&quot;. Groupe de puits individuels à présenter à la moyenne. </li><li> A choisi paramètre à afficher à partir de la barre d&#39;outils supérieure (Z, R ou C). </li><li> Sélectionnez le type de la barre d&#39;outils supérieure (T = temps, F = fréquence, 3D = cascade blot) graphique. </li><li> Définir décalage graphique et la gamme avec les curseurs ci-dessous la fenêtre graphique ou de remplir les valeurs exactes dans les contrôles adjacents. </li><li> Choisissez parmi les «Options de la série chronologique&quot; de base dans la section «Analyse» pour effectuer l&#39;écart type, moyenne mobile ou la normalisation des données. </li><li> Activer la barre d&#39;outils Expert dans le menu Aide pour les opérations plus avancées comme Nyuist terrain et de la transformation de Fourier. </li><li> Utilisez &quot;Options d&#39;affichage&quot; dans la section &quot;Analyser&quot; pour définir range de x et y des axes et l&#39;exportation graphique. </li><li> Exporter les données sélectionnées vers un fichier Excel via Fichier -&gt; Exporter des données -&gt; Pour Excel (sélectionnée) et utiliser un logiciel tiers de choix pour une analyse approfondie, les statistiques et la représentation que nécessaire. </li></ol></li><li> Modélisation de Rb et Alpha. NOTE: Pour la modélisation, il est recommandé d&#39;utiliser un milieu acellulaire bien rempli comme référence. <ol><li> Mesure Finition MFT ou charge des données MFT ensemble. </li><li> Si un puits de référence acellulaire est disponible, appuyez soit sur ​​Rechercher pour sélectionner automatiquement la valeur de référence ou Set pour sélectionner le point de temps libre cellulaire manuellement &quot;Freq. Modélisation Scan&quot; dans la section &quot;Analyse&quot;. </li><li> S&#39;il n&#39;y a pas de référence acellulaire, importer une valeur de référence d&#39;un autre ensemble de données. Ouvrez l&#39;ensemble de données de référence (assurez-vous que le même tableau et moyennes ont été utilisées) et utiliser Trouver ou Set pour sélectionner la valeur de référence.Puis accédez à des données mesurées et appuyez sur Get. </li><li> S&#39;il n&#39;y a pas fixés utilisation disponible par défaut d&#39;usine des données de référence sans cellules. </li><li> Appuyez sur Modèle de commencer les calculs. Modélisation peut prendre plusieurs minutes dépendant de la taille de l&#39;ensemble de données. </li></ol></li><li> Calcul des micromouvements. Note: Ce calcul ne fait pas partie du logiciel de mesure, mais peut être réalisée avec n&#39;importe quel logiciel de traitement de signal. <ol><li> Terminez mesure RTC ou charger l&#39;ensemble de données RTC. </li><li> Normaliser fixées par la résistance moyenne de l&#39;ensemble de la période données. </li><li> Cassez fixés en segments d&#39;une longueur de points de 256 données données et nettoyer chaque segment par une fenêtre de Hanning. </li><li> Exécuter une transformation de Fourier 256 points et la moyenne résultant spectres de fréquences à un spectre de puissance 129 points unilatéral de réduire au minimum le bruit aléatoire et amélioré le signal biologique. </li><li> fréquence de Complot contre amplitude dans un graphique log-log et d&#39;appliquerajustement linéaire des moindres carrés. </li><li> La pente de la régression linéaire est une mesure du bruit dans le signal global, et de ce fait les cellules de micro-mouvements. </li></ol></li></ol>

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Applied Biophysique Inc. a couvert les frais d&#39;accès ouvert, tandis que la structure et le contenu de l&#39;article restés entière responsabilité de leurs auteurs.

ECIS est un excellent outil pour le dépistage des propriétés et le comportement cellulaire ainsi que pour la quantification des effets des substances connues et inconnues. Ainsi les cellules sont maintenues dans des conditions de culture standard, impédance peut être contrôlée en permanence avec une haute résolution temporelle et corrélées à des signaux optiques. De cette façon, le point de temps optimal pour les manipulations de cellules peut être choisie sur la base de l&#39;état morphologique et fonctionnelle cellulaire. Malheureusement, cette résolution de mesure élevée est livré avec le prix que les petites variations de température, le pH ou la stimulation mécanique des cellules (changement de milieu) auront une influence sur le signal d&#39;impédance immédiatement. L&#39;application de la faible courant de mesure pour les cellules rend la mesure non invasive de l&#39;ECIS, non destructive et sans étiquette, mais à la suite seulement les propriétés bioélectriques passive peut être mesurée (pas de potentiels d&#39;action). Un élément clé est que un certain nombre de paramètres peut être der<html> Ived partir d&#39;une seule mesure, en combinant les informations provenant de plusieurs essais classiques, comme la perméabilité ou des analyses de la cicatrisation des plaies. Voici l&#39;aspect particulier intéressant est que les données mathématiquement modélisés peuvent être utilisés pour explorer les changements de la résistance et de la capacité et les orienter vers les structures cellulaires distinctes (par exemple cellulaires contacts ou la membrane cellulaire). Est important de noter que la spectroscopie d&#39;impédance fournit toujours un signal moyenne de toutes les cellules sur l&#39;électrode de détection, ce qui ne permet pas d&#39;études sur les cellules simples et aussi le modèle mathématique est valable uniquement dans les couches de cellules confluentes. Par conséquent les cellules endothéliales doivent avoir lieu dans l&#39;état de confluence pour au moins un jour avant utilisé pour la modélisation d&#39;assurer cellulaires adhérences matures et les cellules au repos. De même, les blessures électriques ne doivent être appliquées à confluentes couches cellulaires en utilisant des impulsions multiples blessantes courtes avec des fréquences élevées, pour atteindre l&#39;efficacité optimale blessures et éviter d&#39;endommager les électrodes. jove_content &quot;&gt; Pour obtenir la quantité maximale de l&#39;information à partir d&#39;une mesure de l&#39;ECIS, comme dans chaque essai, plusieurs paramètres tels que la combinaison d&#39;un substrat de matrice, le revêtement et la densité d&#39;ensemencement pour le type de cellule individuelle doivent être testées et optimisées avant d&#39;une expérience. Une limitation importante de l&#39;ECIS est que la mesure ne fournit pas d&#39;information directe sur le niveau moléculaire. Ainsi mesures ECIS sont généralement plus informative au début d&#39;une série d&#39;expériences pour aider à associer un problème scientifique avec des structures ou des propriétés cellulaires et de fournir des données importantes pour la génération d&#39;une hypothèse testable. Par conséquent, la conception modulaire de l&#39;ECIS fournit un large éventail d&#39;applications avec la possibilité pour Tailor Made tableaux. Les derniers développements de tableau indiquent un avenir accent sur ​​haut débit projections d&#39;impédance pour la prolifération cellulaire et la blessure électrique et l&#39;avance des tableaux de flux spéciaux pour la simulation in vivo </em&gt; cisaillement avec des profils de flux différents. Documentation supplémentaire S&#39;il vous plaît se référer également à la page Web de la biophysique appliquées (www.biophysics.com) pour les notes d&#39;application, des webinaires et une liste détaillée des publications couvrant l&#39;ensemble du spectre ECIS.

ΩΩΩHere nous présentons Cell-substrat électrique Impedance Sensing, connu comme l&#39;ECIS, une méthode spécifique pour mesurer et analyser le spectre de cellules adhérentes en culture une impédance. L&#39;objectif de ce protocole est d&#39;offrir un guide général applicable à l&#39;utilisation de ce type particulier de l&#39;impédance en fonction des dosages cellulaires et fournir des protocoles pour certaines des fonctions clés du nombre sans cesse croissant d&#39;applications. L&#39;accent sera mis sur l&#39;étude de la prolifération cellulaire, la fonction de barrière, les jonctions cellulaires, et la motilité cellulaire. Depuis ECIS et son modèle associé pour transformer les données de spectroscopie d&#39;impédance dans les paramètres biologiques pertinents a été introduit sous sa forme actuelle à la communauté scientifique par Giaever et Keese en 1991 2, il a souvent été considéré comme un système de mesure de TEER (trans -épithéliale de résistance électrique), ce qui n&#39;est pas exact. Les différences apparaissent marginales au premier abord, maissont importants pour l&#39;interprétation des données. Pour les mesures de TEER classiques, les cellules sont cultivées sur des filtres perméables à caractériser les mécanismes de transport paracellulaires, qui sont dominés par des jonctions serrées épithéliales ou endothéliales adhérentes jonctions 3. Communément, les deux électrodes placées au-dessus et en dessous du filtre sont utilisés pour appliquer un courant continu (DC) couler sur la couche de cellules et de deux autres électrodes afin de mesurer la chute de tension résultante 4. La résistance électrique est calculée en utilisant la loi d&#39;Ohm, ce qui permet une description numérique de la qualité de la barrière cellulaire. ECIS suit ce principe de base et l&#39;étend. Dans le système de l&#39;ECIS, les cellules sont cultivées sur des électrodes opposées, de l&#39;or circulaires qui sont incorporés dans le fond de boîtes spéciales de culture cellulaire. Le nombre d&#39;électrodes par la culture est ainsi variable dépend de l&#39;application et les électrodes ont un diamètre standard de 250 um, dans certains cas, un plus grand contre-électrodeest utilisé pour compléter le circuit. ECIS utilise un courant alternatif constant (AS) de 1 uA avec une fréquence donnée à la place d&#39;un courant continu. L&#39;impédance est calculée à partir des variations correspondantes de la tension (en mV) entre les électrodes. ECIS offre la possibilité de mesurer l&#39;impédance sur une plage de fréquences pour étudier les propriétés cellulaires dépendant de la fréquence, ce qui a plusieurs avantages par rapport TEER et seront expliquées en détail dans cet article. Tout d&#39;abord, la mesure de l&#39;impédance complexe permet de séparer l&#39;impédance globale dans la résistance de la barrière de cellules et la capacité de la cellule. En outre, en prenant des données à des fréquences multiples et l&#39;application d&#39;un modèle mathématique, on peut distinguer entre l&#39;impédance de jonction (raideur des contacts cellule-cellule) et de l&#39;impédance causée par des interactions cellule-substrat (la distance de la membrane des cellules basales de la matrice sous-jacente), ainsi que la contribution de la capacité de la membrane cellulaire. Deuxièmement, la prolifération cellulaire et la motilité peuvent être évaluées, puisque la cellules sont en contact direct avec les électrodes. Troisièmement, le substrat et les électrodes sont suffisamment minces pour permettre le champ lumineux et microscopie à contraste de phase. Base de mesures d&#39;impédance: L&#39;impédance complexe La base de la mesure de l&#39;impédance électrique d&#39;objets biologiques (par exemple des cellules) est la loi d&#39;Ohm, un principe de l&#39;électro-technique de base, qui décrit la relation entre la résistance (R), le courant (I) et la tension (U) à un circuit électrique à un instant donné (t). Applicable dans le circuit DC: R (t) = U (t) / I (t) Lorsque l&#39;on travaille dans le système de climatisation, le courant et la tension ne diffèrent pas dans leur amplitude, mais également dans leur phase (φ). Maintenant, la résistance n&#39;est plus suffisant pour décrire ces relations. Au lieu de cela, l&#39;impédance complexe (Z) ou, dans la plupart des cas, l&#39;amplitude de l&#39;impédance (| Z |) sont utilisés, contenant la résistance ohmique précédemment décrit, plus la réactance (X), qui resultats de courant alternatif s&#39;écoule à travers les condensateurs et les inductances route du déphasage entre la tension et le courant 5. Applicable dans le circuit AC: | Z (f) | = √ (R 2 + X (f) 2) φ = arctan (X / R) Pour effectuer des mesures d&#39;impédance sur des cellules intactes, en raison des caractéristiques de leur membrane, les cellules agissent comme une connexion parallèle d&#39;une résistance et d&#39;un condensateur. Ici, la résistance représente l&#39;opposition à la circulation du courant, tandis que la capacité (C), on décrit la séparation de porteuses électriques dans le bi-couche isolant de la membrane cellulaire qui provoque la polarisation de la cellule. Ainsi X est dominée par les propriétés capacitives de la membrane cellulaire. X (f) ≈ (2 * pi * f * C Cell) -1 Etant donné que X est dépendante de la fréquence, de la variation de la fréquence de mesure permet l&#39;étude de différentes propriétés fonctionnelles et structurelles de la cellule. Les mesures de l&#39;appareil de ECIS la fois R et X, qui permet de calculerde | Z |, C et φ. Quantification des couches de cellules entières avec la spectroscopie d&#39;impédance: Le circuit électrique équivalent. Comme expliqué précédemment, quand une cellule est amenée en un champ électrique, elle montre les propriétés des composants électroniques passifs. Si maintenant, au lieu d&#39;une seule cellule, une couche entière de cellules cultivées sur le dessus d&#39;électrodes et complété par du milieu de culture cellulaire est étudié, le modèle simple de la résistance et du condensateur doit être étendue à l&#39;ensemble d&#39;un réseau électrique. Dans ce circuit que l&#39;on appelle l&#39;équivalent, la résistance du milieu de culture (R M) ainsi que la capacité (C Electr) et une résistance (R Electr) caractérisant l&#39;interaction électrode / électrolyte doivent être envisagés 3,6. Un, exemple général simplifié d&#39;un tel circuit équivalent pour une couche de cellules adhérentes en croissance peuvent être trouvées dans la figure 1. L&#39;avantage d&#39;un tel mathématiquePPROCHE pour décrire un système biologique, c&#39;est que ces circuits peuvent être affinés ad libitum et ajustés aux questions expérimentales spécifiques, par exemple en tenant compte de l&#39;impédance causée par organelles intracellulaires ou de distinguer les influences de la cellule-cellule (R jonction), et adhérences cellule-substrat (R Sub) sur 7,8 globale d&#39;impédance. Néanmoins, le but de la modélisation devrait toujours être d&#39;utiliser le plus petit nombre d&#39;éléments décrivant toutes les caractéristiques du spectre d&#39;impédance mesurée pour permettre des corrélations significatives. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51300/51300fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Schéma du système de l&#39;ECIS et circuit équivalent représentant une couche de cellules en croissance adhérentes. A) de la section de la Croix d&#39;une culture de l&#39;ECIS bien. Les cellules sont de plus en plus au-dessus de détection et contre-électrode et unere recouvert de milieu de culture. Les électrodes sont reliées à un amplificateur lock-in et un signal de courant alternatif est appliqué par l&#39;intermédiaire d&#39;une résistance de 1 MQ pour créer une source de courant constant. Stimuli peuvent être ajoutées directement au milieu de culture à tout moment dans le temps. B) des mesures d&#39;ECIS la somme de toutes les contributions individuelles à l&#39;impédance. Résistance du milieu de culture (R M) ainsi que l&#39;impédance causée par l&#39;interface électrode / électrolyte, qui est pour plus de simplicité présentés comme une combinaison en parallèle d&#39;une résistance (R Electr) et un condensateur (C Electr), ainsi que les propriétés électriques de la membrane cellulaire, décrite par un montage en parallèle d&#39;une résistance (R cellulaire) et la capacitance (C Mem), doivent tous être pris en considération. R cellulaire est variable, car elle dépend de la perméabilité des cellules en direction du courant. Le circuit équivalent peut être étendu et affiné ad libitum. A titre d&#39;exemple de jonction (R Junc) commeainsi que la résistance sous-endothélial (R Sub) ont été ajoutés au circuit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51300/51300fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> paramètres d&#39;impédance et leur signification biologique Les deux paramètres les plus directs dérivées de mesures d&#39;impédance sont la résistance et la capacité des cellules. Résistance représente la qualité et la fonction de la barrière de la cellule et prend en considération la résistance à l&#39;égard de para-et de la circulation du courant trans-cellulaire donc. Capacité fournit une mesure globale de la couverture de l&#39;électrode. La particularité de l&#39;ECIS est que, avec l&#39;aide de circuits équivalents et la modélisation de ces paramètres globaux donnent un aperçu sur de nombreuses propriétés plus cellulaires, y compris les adhésions cellule-cellule et cellule-substrat, qui seront discutées plus tard dans cet article. Avant de commencer: considé expérimentalevivres configuration de la mesure - La configuration se compose de plusieurs éléments distincts: l&#39;appareil ECIS avec l&#39;électronique de mesure; PC pour l&#39;acquisition de données, support de tableau pour le 8 - ou système à 96 puits; tableaux ECIS et de la culture cellulaire de choix. Le porte-matrice doit être placée dans un incubateur et relié au dispositif de ECIS l&#39;extérieur de la couveuse. Le PC doit être équipé du logiciel de l&#39;ECIS (1.2.123.0 du 14 Février 2013) et relié au dispositif de l&#39;ECIS. sélection Array - Il ya une variété sans cesse croissante de tableaux ECIS, conçus pour de multiples applications. Les réseaux classiques sont la 8W1E et les matrices de 8W10E, qui sont composées de 8 puits de culture (indiquées par W) comprenant une ou 10 électrodes de mesure (indiqués par E), respectivement. Un grand contre-électrode complète le circuit, mais son impédance est essentiellement négligeable dans la mesure proprement dite 6. Le titulaire du tableau 8 puits standard peut accueillir deux unerrays, résultant en un nombre total de 16 puits de culture. Les électrodes en or sont de 50 nm d&#39;épaisseur, délimitée par un film isolant et montées de part et d&#39;un substrat de polycarbonate Lexan optiquement clair ou une carte de circuit imprimé (PCB). Les tableaux contenant des BPC sont plus robustes et rentables. Les lames transparentes permettent de microscopie optique et d&#39;immunofluorescence. Ce qu&#39;il faut considérer, c&#39;est que le tableau 1E améliore les fluctuations du signal de résistance causé par les mouvements cellulaires et est nécessaire pour les études de cicatrisation des plaies. En outre, les électrodes individuelles permettent corrélation des signaux électriques et optiques. Dans les réseaux d&#39;électrodes multiples, le signal est moyenné sur plusieurs électrodes, qui en raison de la surface augmentée de mesure comprend plus de cellules dans la mesure, limite le biais des données par inoculation inégale et la croissance des cellules et réduit le flou du signal due à la cellule motions. Par conséquent, les matrices d&#39;électrodes multiples sont utiles pour étudier la prolifération cellulaire et la formation de la barrière. À côté detableaux standard, il ya des tableaux spéciaux pour l&#39;application de la contrainte de cisaillement 9, pour étudier la chimiotaxie 10, la migration cellulaire et la prolifération ainsi que des plaques à 96 puits pour les projections à haut débit. Pour conclure, le tableau doit être utilisé dépend fortement question scientifique et le type de cellule et doit être sélectionné et testé avec soin. fréquence de la mesure - La modélisation de Rb et alpha (voir l&#39;analyse de données) nécessite des mesures de fréquences multiples (MFT). Sinon impédance peut être mesurée au cours du temps à une fréquence spécifique de type cellulaire (SFT), avec l&#39;avantage que les données peuvent être recueillies avec une résolution temporelle plus élevée. La fréquence de mesure plus sensible pour un type de cellule spécifique peut être trouvée par des balayages de fréquence. Lors du traçage impédance respectivement résistance fonction de la fréquence dans un log-logarithmique de la fréquence où la différence entre le libre-cellule et cellule-électrode enrobée est la plus grande est la fréquence à laquelle bloquent les cellules Til courant le plus efficacement possible. Dans le cas des cellules endothéliales (CE) cette fréquence est d&#39;environ 4 kHz. Densité de semis - Comme à chaque densité régulière expérience ensemencement à base de cellules dépend du problème scientifique. Lorsque l&#39;on étudie l&#39;adhérence et d&#39;étalement ou de la formation de la barrière, les cellules endotheliales doivent être ensemencées avec une densité élevée de 40.000-60.000 cellules / cm 2 pour garantir un confluentes, barrière stable après 48 heures. Si la mise au point de l&#39;expérience est de prolifération, les cellules endotheliales doivent être ensemencées avec une faible densité d&#39;environ 2.000-10.000 cellules / cm 2.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1269px;" width="1269">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:320px;">Company</td>
			<td style="width:247px;">Distributor Europe</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:329px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ECIS Z&#952;</td>
			<td style="width:320px;">Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA</td>
			<td style="width:247px;">ibidi GmbH, Munich, Germany</td>
			<td>71617</td>
			<td><a href="http://www.biophysics.com/products-ecisz0.php">http://www.biophysics.com/products-ecisz0.php</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">8W1E PCB Electrode Array</td>
			<td style="width:320px;">Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA</td>
			<td style="width:247px;">ibidi GmbH, Munich, Germany</td>
			<td>70004</td>
			<td><a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">8W1E Lexan Electrode Array</td>
			<td style="width:320px;">Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA</td>
			<td style="width:247px;">ibidi GmbH, Munich, Germany</td>
			<td>70001</td>
			<td>http://www.biophysics.com/cultureware.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">8W10E PCB Electrode Array</td>
			<td style="width:320px;">Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA</td>
			<td style="width:247px;">ibidi GmbH, Munich, Germany</td>
			<td>70010</td>
			<td>http://www.biophysics.com/cultureware.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">L-Cystein</td>
			<td style="width:320px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:247px;">-</td>
			<td>102838</td>
			<td><a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/l-cystein/MDA_CHEM-102838/p_GLOb.s1L7V8AAAEWL.EfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=L-cystein&amp;BackButtonText=search+results">http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/l-cystein/MDA_CHEM-102838/p_GLOb.s1L7V8AAAEWL.EfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=L-cystein&#38;BackButtonText=search+results</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Gelatin</td>
			<td style="width:320px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:247px;">-</td>
			<td>104070</td>
			<td><a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/gelatine/MDA_CHEM-104070/p_S7Wb.s1LadYAAAEWaOEfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=gelatine&amp;BackButtonText=search+results">http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/gelatine/MDA_CHEM-104070/p_S7Wb.s1LadYAAAEWaOEfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=gelatine&#38;BackButtonText=search+results</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Bovine Thrombin</td>
			<td style="width:320px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:247px;">-</td>
			<td>604980</td>
			<td><a href="http://www.merckmillipore.com/germany/life-science-research/thrombin-bovine-high-activity/EMD_BIO-604980/p__pmb.s1LNsYAAAEWS2IfVhTm?PortalCatalogID=merck4biosciences">http://www.merckmillipore.com/germany/life-science-research/thrombin-bovine-high-activity/EMD_BIO-604980/p__pmb.s1LNsYAAAEWS2IfVhTm?PortalCatalogID=merck4biosciences</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Albuman (Human Serum Albumin)</td>
			<td style="width:320px;">Sanquin</td>
			<td style="width:247px;">-</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sanquin.nl/en/products-services/plasma-products/">http://www.sanquin.nl/en/products-services/plasma-products/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Y-27632</td>
			<td style="width:320px;">Tocris Biosciences</td>
			<td style="width:247px;">-</td>
			<td>1254</td>
			<td><a href="http://www.tocris.com/dispprod.php?ItemId=1382#.UbiFNNish8E">http://www.tocris.com/dispprod.php?ItemId=1382#.UbiFNNish8E</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EGM-2 BulletKit&#160;</td>
			<td style="width:320px;">Lonza</td>
			<td style="width:247px;">-</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/endothelial-cell-growth-media-kits.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/endothelial-cell-growth-media-kits.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:320px;">Lonza</td>
			<td style="width:247px;">-</td>
			<td>17-602E</td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility

Cell-substrat électrique Impedance Sensing (ECIS) est un système de mesure d&#39;impédance in vitro pour quantifier le comportement des cellules dans des couches de cellules adhérentes. À cette fin, les cellules sont cultivées dans des chambres de culture spéciales sur le dessus de opposées, des électrodes d&#39;or circulaires. Un petit courant alternatif constant est appliqué entre les électrodes et le potentiel aux bornes est mesurée. Les propriétés isolantes de la membrane cellulaire créent une résistance à la circulation du courant électrique résultant en une augmentation de potentiel électrique entre les électrodes. Mesure de l&#39;impédance cellulaire de cette manière permet l&#39;étude automatisée de l&#39;attachement cellulaire, la croissance, la morphologie, la fonction et la motilité. Bien que la mesure de l&#39;ECIS lui-même est simple et facile à apprendre, la théorie sous-jacente est complexe et le choix des bons réglages et l&#39;analyse et l&#39;interprétation des données correcte n&#39;est pas évident. Pourtant, un protocole clair décrivant les différentes étapes de l&#39;expérimentationla conception de la préparation, la réalisation et l&#39;analyse de l&#39;expérience n&#39;est pas disponible. Dans cet article, le principe de mesure de base ainsi que les applications possibles, des considérations expérimentales, les avantages et les limites du système de ECIS sont discutées. Un guide est prévu pour l&#39;étude de la fixation des cellules, d&#39;étalement et de la prolifération, la quantification du comportement des cellules dans une couche confluente, en ce qui concerne la fonction de barrière, la motilité cellulaire, de la qualité des adhérences cellule-cellule et cellule-substrat, et la quantification de la cicatrisation des plaies et réponses cellulaires à des stimuli vasoactifs. Les résultats représentatifs sont décrits sur la base de micro-vasculaire humain (MVEC) et ombilicaux cellules endothéliales humaines de veine (HUVEC), mais sont applicables à toutes les cellules en croissance adhérentes.

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Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Ce protocole d&#39;évaluations Cell-substrat électrique impédance de détection, un procédé pour enregistrer et analyser le spectre de cellules adhérentes d&#39;impédance pour la quantification de la fixation cellulaire, la prolifération, la motilité et la réponse cellulaire aux stimuli pharmacologiques et toxiques. La détection de la perméabilité endothéliale et l&#39;évaluation des contacts cellule-cellule et cellule-substrat sont mis en évidence.

Électrique Cell-substrat Impedance Sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

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56.6K vues.  Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center.  Ce protocole d'évaluations Cell-substrat électrique impédance de détection, un procédé pour enregistrer et analyser le spectre de cellules adhérentes d'impédance pour la quantification de la fixation cellulaire, la prolifération, la motilité et la réponse cellulaire aux stimuli pharmacologiques et toxiques. La détection de la perméabilité endothéliale et l'évaluation des contacts cellule-cellule et cellule-substrat sont mis en évidence. 

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Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

MICRO-creux à base de capteur pour multiplexée transdermique Sensing électrochimique

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Recherche

Bio-ingénierie

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the passage of necessary ions and molecules. A breach in this barrier can be caused by a reduction in the extracellular calcium concentration. This reduction in calcium concentration causes a conformational change in proteins involved in the sealing of the barrier, leading to an increase of the paracellular flux. To mimic this effect the calcium chelator ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetra acetic acid (EGTA) was used on a monolayer of cells known to be representative of the gastrointestinal tract. Different methods to detect the disruption of the barrier tissue already exist, such as immunofluorescence and&#160;permeability assays. However, these methods are time-consuming and costly and not suited to dynamic or high-throughput measurements. Electronic methods for measuring barrier tissue integrity also exist for measurement of the transepithelial resistance (TER), however these are often costly and complex. The development of rapid, cheap, and sensitive methods is urgently needed as the integrity of barrier tissue is a key parameter in drug discovery and pathogen/toxin diagnostics. The organic electrochemical transistor (OECT) integrated with barrier tissue forming cells has been shown as a new device capable of dynamically monitoring barrier tissue integrity. The device is able to measure minute variations in ionic flux with unprecedented temporal resolution and sensitivity, in real time, as an indicator of barrier tissue integrity. This new method is based on a simple device that can be compatible with high throughput screening applications and fabricated at low cost.

The Organic Electrochemical Transistor is integrated with live cells and used to monitor ion flux across the gastrointestinal epithelial barrier. In this study, an increase in ion flux, related to disruption of tight junctions, induced by the presence of the calcium chelator EGTA (ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid), is measured.

Détection de perturbation des tissus barrière avec un transistor électrochimique organique

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have witnessed a tremendous increase in interest in EVs. EVs have been shown to play important roles in various physiological and pathological processes, including coagulation, immune responses, and cancer. In addition, EVs have potential as therapeutic agents, for instance as drug delivery vehicles or as regenerative medicine. Because of their small size (50 to 1,000 nm) accurate quantification and size profiling of EVs is technically challenging.
This protocol describes how tunable resistive pulse sensing (tRPS) technology, using the qNano system, can be used to determine the concentration and size of EVs. The method, which relies on the detection of EVs upon their transfer through a nano sized pore, is relatively fast, suffices the use of small sample volumes and does not require the purification and concentration of EVs. Next to the regular operation protocol an alternative approach is described using samples spiked with polystyrene beads of known size and concentration. This real-time calibration technique can be used to overcome technical hurdles encountered when measuring EVs directly in biological fluids.

Extracellular vesicles play important roles in physiological and pathological processes, including coagulation, immune responses, and cancer or as potential therapeutic agents in drug delivery or regenerative medicine. This protocol presents methods for the quantification and size characterization of isolated and non-isolated extracellular vesicles in various fluids using tunable resistive pulse sensing.

Quantification et Taille-profilage des vésicules extracellulaires Utilisation accordable résistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Modélisation par éléments finis d’un microenvironnement électrique cellulaire

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositifs électriques et magnétiques de champ pour la stimulation des tissus biologiques

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Quantification of Mouse Heart Left Ventricular Function, Myocardial Strain, and Hemodynamic Forces by Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations result in pathology, and how myocardial diseases may be treated. Cardiovascular magnetic resonance imaging (CMR) has become an indispensable tool for a comprehensive in vivo assessment of cardiac anatomy and function. This protocol shows detailed measurements of mouse heart left ventricular function, myocardial strain, and hemodynamic forces using 7-Tesla CMR. First, animal preparation and positioning in the scanner are demonstrated. Survey scans are performed for planning imaging slices in various short- and long-axis views. A series of prospective ECG-triggered short-axis (SA) movies (or CINE images) are acquired covering the heart from apex to base, capturing end-systolic and end-diastolic phases. Subsequently, single-slice, retrospectively gated CINE images are acquired in a midventricular SA view, and in 2-, 3-, and 4-chamber views, to be reconstructed into high-temporal resolution CINE images using custom-built and open-source software. CINE images are subsequently analyzed using dedicated CMR image analysis software.
Delineating endomyocardial and epicardial borders in SA end-systolic and end-diastolic CINE images allows for the calculation of end-systolic and end-diastolic volumes, ejection fraction, and cardiac output. The midventricular SA CINE images are delineated for all cardiac time frames to extract a detailed volume-time curve. Its time derivative allows for the calculation of the diastolic function as the ratio of the early filling and atrial contraction waves. Finally, left ventricular endocardial walls in the 2-, 3-, and 4-chamber views are delineated using feature-tracking, from which longitudinal myocardial strain parameters and left ventricular hemodynamic forces are calculated. In conclusion, this protocol provides detailed in vivo quantification of the mouse cardiac parameters, which can be used to study temporal alterations in cardiac function in various mouse models of heart disease.

This study describes a comprehensive cardiovascular magnetic resonance imaging (CMR) protocol to quantify the left ventricular functional parameters of the mouse heart. The protocol describes the acquisition, post-processing, and analysis of the CMR images as well as assessment of different cardiac functional parameters.

Quantification de la fonction ventriculaire gauche du cœur de souris, de la tension myocardique et des forces hémodynamiques par imagerie par résonance magnétique cardiovasculaire

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations ...

Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification

The tricuspid valve (TV) regulates the unidirectional flow of unoxygenated blood from the right atrium to the right ventricle. The TV consists of three leaflets, each with unique mechanical behaviors. These variations among the three TV leaflets can be further understood by examining their four anatomical layers, which are the atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F), and ventricularis (V). While these layers are present in all three TV leaflets, there are differences in their thicknesses and microstructural constituents that further influence their respective mechanical behaviors. 
This protocol includes four steps to elucidate the layer-specific differences: (i) characterize the mechanical and collagen fiber architectural behaviors of the intact TV leaflet, (ii) separate the composite layers (A/S and F/V) of the TV leaflet, (iii) carry out the same characterizations for the composite layers, and (iv) perform post-hoc histology assessment. This experimental framework uniquely allows the direct comparison of the intact TV tissue to each of its composite layers. As a result, detailed information regarding the microstructure and biomechanical function of the TV leaflets can be collected with this protocol. Such information can potentially be used to develop TV computational models that seek to provide guidance for the clinical treatment of TV disease.

This protocol describes the biaxial mechanical characterization, polarized spatial frequency domain imaging-based collagen quantification, and microdissection of tricuspid valve leaflets. The provided method elucidates how the leaflet layers contribute to the holistic leaflet behaviors.

Microdissection en couche des feuillets de valve tricuspide pour la caractérisation mécanique biaxiale et la quantification microstructurale

The tricuspid valve (TV) regulates the unidirectional flow of unoxygenated blood from the right atrium to the right ventricle. The TV consists of three ...

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a chemotherapeutic might be functionalized with an antibody to enhance binding to cancer cells (&#34;targeting&#34;) or functionalized with polyethylene glycol to help evade immune cell recognition (&#34;stealth&#34;). Even at a cellular level, optimizing the binding and uptake of a drug carrier is a complex biological design problem. Thus, it is valuable to separate how strongly a new carrier interacts with a cell from the functional efficacy of a carrier&#39;s cargo once delivered to that cell.
To continue the chemotherapeutic example, &#34;how well it binds to a cancer cell&#34; is a separate problem from &#34;how well it kills a cancer cell&#34;. Quantitative in vitro assays for the latter are well established and usually rely on measuring viability. However, most published research on cell-carrier interactions is qualitative or semiquantitative. Generally, these measurements rely on fluorescent labeling of the carrier and, consequently, report interactions with cells in relative or arbitrary units. However, this work can be standardized and be made absolutely quantitative with a small number of characterization experiments. Such absolute quantification is valuable, as it facilitates rational, inter- and intra-class comparisons of various drug delivery systems-nanoparticles, microparticles, viruses, antibody-drug conjugates, engineered therapeutic cells, or extracellular vesicles.
Furthermore, quantification is a prerequisite for subsequent meta-analyses or in silico modeling approaches. In this article, video guides, as well as a decision tree for how to achieve in vitro quantification for carrier drug delivery systems, are presented, which take into account differences in carrier size and labeling modality. Additionally, further considerations for the quantitative assessment of advanced drug delivery systems are discussed. This is intended to serve as a valuable resource to improve rational evaluation and design for the next generation of medicine.

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A workflow is demonstrated for the absolute quantification of drug carrier-cell interactions using flow cytometry to allow better rational evaluation of novel drug delivery systems. This workflow is applicable to drug carriers of any type.

Quantification expérimentale des interactions entre les systèmes d’administration de médicaments et les cellules in vitro : Guide d’évaluation préclinique de la nanomédecine

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Production à haut rendement de racines poilues de soja transgénique

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with soil-borne microbes that form symbiosis to fix nitrogen and pathogens, which makes research involving soybean root genetics of prime importance to improve its agricultural production. The genetic transformation of soybean hairy roots (HRs) is mediated by the Agrobacterium rhizogenes strain NCPPB2659 (K599) and is an efficient tool for studying gene function in soybean roots, taking only 2 months from start to finish. Here, we provide a detailed protocol that outlines the method for overexpressing and silencing a gene of interest in soybean HRs. This methodology includes soybean seed sterilization, infection of cotyledons with K599, and the selection and harvesting of genetically transformed HRs for RNA isolation and, if warranted, metabolite analyses. The throughput of the approach is sufficient to simultaneously study several genes or networks and could determine the optimal engineering strategies prior to committing to long-term stable transformation approaches.

Pleins feux sur l’auteur : Transformation de la racine poilue du soja pour l’analyse de la fonction des gènes  

Here, we present a protocol for the high-efficiency production of transgenic soybean hairy roots.

Transformation racinaire poilue du soja pour l’analyse de la fonction génique

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...