We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. Préparation de verre Lamelles <ol><li> Stériliser 12 mm de diamètre autour de lamelles de verre en les trempant dans de l&#39;éthanol 70% pendant au moins 10 minutes avec agitation occasionnelle pour assurer une exposition totale de toutes les lamelles couvre-objet à l&#39;éthanol. Verser des lamelles de verre et d&#39;éthanol dans une boîte de culture cellulaire stérile (soit 6 cm ou 10 cm de diamètre). </li><li> Avec une paire de fines stériles 5B forceps, ramasser et placer chaque lamelle de verre individuelle dans un puits d&#39;une plaque de grappe 24. Veiller à ce que les lamelles ne se touchent pas les parois du puits et sont à peu près au milieu du puits. </li><li> Laisser la plaque non couverte 24 ainsi cluster avec des lamelles de verre à sécher dans la hotte à flux. Cela prend environ 10 min </li><li> Pendant cette période, la préparation du mélange de revêtement en diluant 10 mg / ml de fibronectine humaine dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 0,1 mg / ml. </li><li> Lorsque les lamelles sont secs, pipette 100 pi de solution de revêtement sur chaque co de verreverslip si la solution ne couvre que le verre sans mise en commun autour de l&#39;extérieur du puits. Placer la plaque 24 et pôle couverte dans un incubateur de culture cellulaire pendant au moins une heure. </li><li> Juste avant utilisation, enlever la solution de revêtement. La même solution de revêtement peut être transféré dans un tube stérile et utilisé jusqu&#39;à trois fois sans perte d&#39;efficacité visible. </li></ol> 2. Préparation des cellules endothéliales monocouche <ol><li> Culture des cellules endotheliales coronaires humaines d&#39;artère (CE) dans un milieu à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone. </li><li> Aspirer milieux de culture et rincer monocouche CE avec 10 ml de HBSS </li><li> Aspirer HBSS et ajouter 2 ml de trypsine 0,5%, solution d&#39;EDTA à 0,2%. Incuber à température ambiante pendant environ 5 min. </li><li> Lorsque CE peut être délogé par un robinet sur le côté de la fiole, ajoutez 5 ml d&#39;inhibiteur de trypsine de soja et avec pipette gicler la surface du flacon pour déloger davantage les cellules. </li><li> Transfert des cellules dans un tube de 15 ml et centrifuger le tubeà 200 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre le culot CE dans 5 ml de médias. Compter les cellules avec un hémocytomètre et ajuster la concentration de cellules à 50000 CE par ml de milieu, CE. </li><li> Distribuer 1 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 24 puits contenant des lamelles de verre revêtues. Incuber les cellules S / N, dans une culture de cellules incubateur à 37 ° C plus 5% de dioxyde de carbone. </li><li> Les cellules sont prêtes pour une utilisation dans des expériences où une monocouche confluente est formé, dans les 3 jours. </li></ol> 3. Préparation des monocytes <ol><li> Transférer cellules HL-60 qui sont cultivées dans du RPMI supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, comme une culture en suspension, dans un tube de 15 ml. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min. </li><li> Retirer les cellules du surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de milieu et ajuster la concentration de cellules avec des milieux à 2 millions de cellules / ml. Si marquage par fluorescence de la HL-60 est souhaitée, remettre en suspension les cellules dans du RPMI sans sérum et proceed comme décrit dans la section 4. </li><li> Ajouter 0,5 ml de HL-60 suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 24 puits cluster contenant monocouche CE et incuber la plaque dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone pour une période fixe de temps choisi entre 1 et 3 h. Peu de différence est observée entre 1 h et 3 h point dans le temps, où la saturation de liaison est atteint. </li><li> Préparer pour la cellule de lavage / récolte: Remplir un tube de 120 ml avec 100 ml de HBSS. Distribuer 1 ml de formol dans chaque puits d&#39;une plaque de 24 fraîche. </li><li> Après la période d&#39;incubation, utiliser une paire de pinces acérées et ramasser la lamelle de verre à partir du puits et maintenez la lamelle verticale et tamponner le bord de la lamelle sur un morceau de tissu sur le banc pendant 3 secondes, en prenant soin de ne pas toucher le surface recouverte de cellule de la lamelle couvre-objet avec le tissu. </li><li> En maintenant fermement la lamelle avec une paire de forceps, tremper la lamelle couvre-objet dans et hors de la HBSS à cinq reprises. </li><li> Après le cinquième dunkdans du HBSS, tamponner le bord de la lamelle couvre-objet sur le tissu pendant 3 sec. </li><li> Répétez les procédures de dunk et tamponnant décrites dans 3.6 et 3.7, soit un total de trois séries de 5 dunks suivie d&#39;une noisette. </li><li> Transférer la lamelle dans un puits contenant 10% de formol pour fixer les cellules à température ambiante. La lamelle est prêt pour le dénombrement, pour le stockage à long terme ou à être soumis à d&#39;autres procédures décrites ci-dessous. </li></ol> 4. Étiquetage des cellules HL-60 avec la cellule Tracker (facultatif) <ol><li> Compter et transférer quantité appropriée de cellules HL-60 (par exemple, 10 millions) dans un tube de 15 ml centrifugeuse. Centrifugeuse de cellules HL-60 à 200 g pendant 5 min. Retirer le surnageant. </li><li> Resuspendre le culot cellulaire dans Cell Tracker en milieu RPMI sans sérum à une concentration de 1 million de cellules / ml. Incuber les cellules dans l&#39;incubateur de culture cellulaire pendant 1 heure. </li><li> Centrifuger les cellules à 200 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire dans un milieu à une concentration de 2 millions de cElls / ml. </li><li> Ajouter 0,5 ml de cellules Tracker marqué HL-60 dans chaque puits contenant les cellules endothéliales cultivées sur lamelle de verre. Continuer à 3,3. </li></ol> 5. énumération de cellules endothéliales Adhésif <ol><li> Mont lamelles de microscope sur coulisse avec DAPI contre-coloration pour identifier des cellules individuelles. </li><li> En utilisant un microscope inversé avec un objectif 4X ou 10X, acquérir des images de plusieurs champs (par exemple, 5 champs) et de compter le plus grand nombre de monocytes qui regroupent sur ​​les cellules endothéliales non irradié (Ce devrait être en général 3-5). </li><li> Définissez deux fois ce nombre comme le seuil de monocytes sur une cellule endothéliale à celle définie comme un cluster. Si nécessaire, un critère différent peut être utilisé pour définir une grappe en fonction de la nature de l&#39;expérience. </li><li> Comptez le nombre de grappes et le nombre de cellules endothéliales dans le domaine. Diviser la première par la seconde pour obtenir le pourcentage de cellules endotheliales adhésives. Butde nombreux domaines pour obtenir une moyenne et écart type des comtes. </li></ol> 6. La contre-coloration avec des anticorps <ol><li> Après le test d&#39;adhésion des cellules et sur ​​la lamelle couvre-objet ont été fixés dans 10% de formaline pendant 15 minutes à la température ambiante, soumettre les lamelles couvre-objet à immunofluorescence en utilisant la procédure standard 10 et des anticorps de choix. </li><li> Ajouter et supprimer les diverses solutions très doucement pour éviter de déloger les monocytes qui sont attachés à des cellules endothéliales. </li></ol> 7. La contre la sénescence associée bêta-galactosidase activité <ol><li> Après le test d&#39;adhésion des cellules et sur la lamelle couvre-objet ont été fixés dans de la formaline pendant 15 min, la tache de l&#39;activité bêta-galactosidase associé à la sénescence, comme décrit dans les instructions qui accompagnent le kit de coloration. Ajouter et supprimer les diverses solutions très doucement pour éviter de déloger les monocytes qui sont attachés à des cellules endothéliales. </li></ol>

<ol>
	<li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation:+an+integrated+view.">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms.">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li><li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells:+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion.">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li><li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes.">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li><li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis.">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li><li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin,+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal.">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li><li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium.">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li><li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression.">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Le test d&#39;adhérence des monocytes décrit ci-dessus a été utilisé avec succès dans des expériences conçues pour étudier les effets biologiques des rayonnements ionisants sur des monocouches endothéliales 10. Bien que ce soit pas la seule méthode permettant d&#39;évaluer l&#39;adhérence d&#39;une monocouche endotheliale, il est la seule méthode qui permet la quantification de la proportion ou le pourcentage de cellules endotheliales au sein d&#39;une monocouche qui est adhésive. Cette distinction est importante car un changement quantitatif global de l&#39;adhérence de monocytes, tel que mesuré par d&#39;autres méthodes peut être attribué soit à une augmentation générale de l&#39;adhérence de toutes les cellules de la monocouche endothéliale ou à l&#39;augmentation de l&#39;adhésivité d&#39;une sous-population de cellules endotheliales au sein de la monocouche, comme le montre l&#39;exemple ci-dessus. L&#39;intérêt de disposer de ces informations est illustré par le fait que la possibilité de quantifier le pourcentage de cellules endotheliales qui présentaient une adhérence améliorée après irradiation a conduit aux inescapable conclusion que cet effet est pas due à une mutation génétique d&#39;un gène particulier comme le pourcentage de cellules qui étaient adhésif était grandement ci-dessus (plus de 1000 fois plus) que ce qui serait attendu de mutation aléatoire d&#39;un gène par des rayons X à cette dose . Le facteur qui permet une bonne reproductibilité des résultats est le régime de lavage. Comme le procédé de lavage implique l&#39;immersion de la lamelle de verre dans le tampon de lavage, puis en tamponnant sur un tissu, la variabilité de la turbulence de la mémoire tampon qui se pose inévitablement de la vieille méthode de l&#39;ajout de la solution de lavage dans un puits est évitée. En effet, il a été l&#39;observation de la variabilité excessive entre les répétitions obtenues en utilisant le procédé de pipetage qui nous contraint de mettre au point un procédé de lavage qui élimine l&#39;élément de variabilité de l&#39;étape de lavage. Certes, les limites de cette analyse se trouvent dans la nécessité de mener à bien comptage manuel des grappes de monocytes, qui ne not lui permettre d&#39;être adapté pour des analyses à haut débit. Deuxièmement, la décision sur la façon dont de nombreux monocytes constituent un cluster doit être déterminée semi-arbitraire et le niveau peut être réglé trop haut et aboutir à l&#39;exclusion de certains groupes d&#39;origine. Le manque de force de cisaillement dans cette méthode peut aussi être considéré comme une limitation des expériences dans lesquelles l&#39;adhérence nettement améliorée des cellules endothéliales est induite (par exemple, + TNF). Dans d&#39;autres situations cependant, le manque de force de cisaillement est un avantage, car elle permet la détection de l&#39;augmentation moins exagérée de l&#39;adhésivité. Modeste augmentation des monocytes adhésivité peut être particulièrement important et pertinent. In vivo, les monocytes ne seraient pas (dans un temps expérimental typique) devraient être de joindre en grand nombre à des cellules endothéliales avec modeste augmentation de l&#39;adhérence, en grande partie due à une force de cisaillement. Dans le temps cependant, certains monocytes ferait probablement, et cela est plus susceptible de représenter l&#39;environnement de l&#39;inflammation chronique. En tant que tel,l&#39;absence de force de cisaillement peut être un avantage, car il offre la possibilité pour les petites augmentations de l&#39;adhérence des cellules endothéliales à être révélé dans les délais expérimentales qui sont généralement de courte durée et peut-être trop éphémère pour permettre modeste augmentation de l&#39;adhérence à être observé sous la contrainte de cisaillement. La possibilité de soumettre les cellules après cet essai à d&#39;autres analyses telles que dosage de la sénescence et immunofluorescence augmente l&#39;utilité de cette méthode, car elle permet à l&#39;association de l&#39;adhérence des cellules endothéliales spécifiques aux particuliers protéines cellulaires ou états cellulaires comme démontré ci-dessus, une caractéristique qui ne sont pas disponibles avec les tests d&#39;adhésion âgées. Cette méthode a été utilisée avec des cellules humaines endothéliales coronaires et des résultats similaires EST2 immortalisées ont également été obtenus avec des cellules endothéliales coronaires humaines primaires 10, démontrant qu&#39;il est pas spécifique à juste une lignée cellulaire particulière. En outre, le bruitption de cette méthode de dosage de l&#39;adhésivité des cellules endothéliales ne font pas obstacle à soumettre les mêmes cellules pour le dosage d&#39;adhérence norme qui mesure la fluorescence des immunocytes marqués. Ensemble, ce rapport démontre que cette méthode est polyvalent, inclusive et fournit beaucoup plus d&#39;informations que le test d&#39;adhésion standard.

L&#39;infiltration de cellules immunitaires telles que les monocytes à travers la couche de cellules endotheliales qui tapissent les vaisseaux sanguins est une étape importante dans le processus d&#39;inflammation 1. Cela permet à la domiciliation des cellules immunitaires (immunocytes) à un site de la lésion. Dans d&#39;autres cas et des endroits tels que l&#39;artère coronaire et l&#39;artère carotide, l&#39;infiltration de monocytes à travers la couche endotheliale peut conduire à la résidence à long terme de ces cellules indésirables dans la paroi de l&#39;artère, pouvant conduire à la formation de plaques 2. Dans tous les cas d&#39;infiltration immunocytes, la première étape implique l&#39;activation des cellules endothéliales dans une région localisée du vaisseau sanguin. Les cellules endotheliales sont activés par des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α et IL-6 pour augmenter l&#39;expression des protéines de la surface cellulaire tels que VCAM, ICAM et la E-sélectine qui facilitent le recrutement et la fixation des immunocytes sur la surface des cellules endotheliales 3- 6. 7 endotheliales monocouche. Les limites de cette méthode en termes de précision ont conduit à l&#39;utilisation de lymphocytes radiomarqué ou un monocyte, suivie par la quantification des matières radioactives qui correspond à des lymphocytes ou monocytes adhérence 4. Cette méthode a été éventuellement remplacée par un procédé à base de fluorescence, grâce à quoi immunocytes d&#39;intérêt ont été marquées avec un colorant fluorescent et soumis à la même procédure que ci-dessus avec la différence étant que la fluorescence à la place de la radioactivité est mesurée 8. Actuellement, cette méthode a émergé comme le plus pratique et est vendu sous forme de kit par plusieurs fournisseurs commerciaux. Bien que ce test peut mesurer les niveaux relatifs de l&#39;adhérence entre les contrôles et les échantillons expérimentaux, il ne révèle pas si un changement de fluorescence est due à un changement uniforme de l&#39;adhérence sur l&#39;ensemble du endothelial population de cellules ou si le changement est dû à une différence de adhésivité dans une sous-population de cellules. Il est également évident que la rigueur du lavage exerce un profond effet sur le résultat, et plus important encore, l&#39;uniformité de rincer monocytes non liés entre différentes monocouches de cellules endothéliales aura un grand impact sur la proximité des résultats de répétitions et la reproductibilité des résultats entre les échantillons . Plus récemment, plusieurs systèmes qui pompent des monocytes dans un milieu à travers une monocouche de cellules endotheliales ont été utilisés pour remédier à ce problème 9. En outre, ces systèmes d&#39;écoulement récapitulent également l&#39;effet de la force de cisaillement sur les cellules endothéliales. Bien que les avantages de ces systèmes sont claires et très attrayant, il est également important de comprendre que, bien que l&#39;adhérence des cellules endotheliales peut être considérablement augmentée, comme cela est le cas dans l&#39;inflammation aiguë, par des facteurs tels que le TNFa, d&#39;autres activateurs, par exemple un rayonnement ionisant 10 Susciter change tchapeau ne sont pas facilement détectée dans des délais expérimentaux in vitro par ces systèmes très strictes. Bien que de tels changements minimes de l&#39;adhésivité des cellules endothéliales sont facilement manqués ou rejetés in vitro, il est pas nécessairement bénigne in vivo, où ces petites variations à l&#39;intérieur d&#39;un temps de vie, ce qui est caractéristique d&#39;une inflammation chronique, peuvent exercer des effets très significatifs. Ainsi, un procédé robuste, mais sensible et spécifique pour détecter et mesurer l&#39;adhésivité des cellules endothéliales est nécessaire. Nous rapportons ici une méthode pour mesurer l&#39;adhérence des cellules endothéliales directement. Ce procédé ne repose pas sur la mesure de la fluorescence comme indicateur de substitution indirect de adhésivité des cellules endothéliales. Il révèle si des changements dans l&#39;adhésivité sont dues au changement uniforme dans toutes les cellules ou limitée à une sous-population. En outre, il permet la co-coloration des cellules endotheliales avec des marqueurs tels que la sénescence associée à la bêta-galactosidase, la viabilité cellulaire marker, Calcien AM et des anticorps contre la surface de la cellule et des protéines intracellulaires, permettant à l&#39;association de cellules endothéliales adhésives individuelles à certains états de la cellule ou l&#39;expression de protéines spécifiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips Round 12mm Diameter</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cluster plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meso-Endo Cell media</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>212-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta glasctosidase Assay kit&#160;&#160;</td>
			<td>CellSignaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

L&#39;un des procédés cardinaux de l&#39;inflammation est l&#39;infiltration de cellules immunitaires de la lumière du vaisseau sanguin vers le tissu environnant. Cela se produit lorsque les cellules endotheliales, qui tapissent les vaisseaux sanguins, deviennent adhésif pour faire circuler des cellules immunitaires telles que les monocytes. In vitro mesure de cette adhésivité a jusqu&#39;à présent été effectuée en quantifiant le nombre total des monocytes qui adhèrent à une couche endotheliale soit comme un comptage direct ou par mesure indirecte de la fluorescence de monocytes adhérents. Bien que de telles mesures font indiquer l&#39;adhérence moyenne de la population de cellules endothéliales, ils se confondent en un certain nombre de facteurs, comme le nombre de cellules, et ne révèlent pas la proportion des cellules endotheliales qui sont réellement adhésif. Ici, nous décrivons et démontrons une méthode qui permet le dénombrement des cellules adhérentes dans une population éprouvée de monocouche endothéliale. Les cellules endothéliales sont cultivées sur des lamelles de verre et suivants souhaitéstraitement sont mis au défi avec des monocytes (qui peut être marqué par fluorescence). Après incubation, une procédure de rinçage, impliquant de multiples cycles d&#39;immersion et drainage, les cellules sont fixées. Adhésif cellules endotheliales, qui sont entourés par les monocytes sont facilement identifiés et dénombrés, ce qui donne un indice d&#39;adhérence révèle que la proportion réelle des cellules endotheliales au sein de la population qui sont adhésif.

Cette méthode permet la détection de cellules endotheliales adhésifs individuels au sein d&#39;une population. Par exemple, alors qu&#39;une monocouche de cellules endothéliales non irradié conservé quelques sporadiques HL-60 monocytes après incubation et lavage, monocouche endothéliale à 7 jours après l&#39;irradiation 10Gy avant l&#39;incubation avec des monocytes ont été liés par les monocytes en grappes autour des cellules endothéliales individuels ( Figure 1). Bien que ce phénomène est facilement observable sous microscope à contraste de phase, de microscopie par fluorescence révèle une image encore plus claire des grappes de monocytes. Après avoir effectué le test d&#39;adhésion décrit, il est possible de procéder à la coloration des cellules à membrane, cytoplasmique ou nucléaire (figure 2) des protéines en utilisant des anticorps appropriés avec les méthodes d&#39;immunofluorescence standard. De plus, un dosage à base d&#39;enzymes telles que la bêta-galactosidase de sénescence associée (figure 3) peut également être performed. Etant donné que chaque groupe de monocytes correspond à une cellule endothéliale individu, le dénombrement des grappes révèle le nombre réel de cellules endothéliales d&#39;adhésif à l&#39;intérieur de la monocouche (figure 4), et donc le pourcentage de cellules endotheliales adhésifs au sein de la population (tableau 1, figure 6) . Ceci est la seule méthode qui permet à ce jour de tels quantification adhésivité des cellules endothéliales. Il est à noter que les cellules endotheliales utilisés dans les expériences ici sont inhibées par contact et ne pas augmenter en nombre, après avoir atteint la confluence. Ceci élimine la complexité potentiel posé par l&#39;augmentation du nombre des cellules endotheliales à des points de temps ultérieurs. Si on le souhaite, les monocytes attachés aux monocouches endotheliales peuvent être délogées par une solution de trypsine-EDTA 0,2% 0,5% (au lieu de la fixation à 3,9) et leur fluorescence mesurées en utilisant un lecteur de plaque, comme cela est le cas dans les méthodes actuelles (Figure 5). </p&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;adhérence des monocytes sur la monocouche de cellules endothéliales. Sur les cellules endothéliales non irradié, les monocytes adhérant sous forme de cellules individuelles d&#39;une manière sporadique et aléatoire (panneaux de gauche) et dans des clusters sur des cellules endotheliales individuelles des 7 jours après l&#39;irradiation de 10 Gy monocouche (des panneaux de droite). Panneaux inférieurs sont des images de fluorescence des panneaux supérieurs, confirmant que les petites et lumineuses cellules sphériques visibles en contraste de phase sont en effet des monocytes qui ont été pré-étiquetés avec Cell-Tracker vert. Certaines des grappes de monocytes sont indiqués par des flèches blanches. Les images ont été prises en utilisant un objectif 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <html><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Figure 2. Coloration des cellules endotheliales pour le dosage des protéines post-adhésion. Après avoir effectué le test d&#39;adhésion décrit, les cellules sur les lamelles de verre ont été soumis à immunofluorescence pour la détection de (A) la protéine de membrane (CD44), b) une protéine cytoplasmique (Tubulin) ou c) une protéine nucléaire (γ-H2AX). Panneaux de gauche de (A) et (B) (vu avec objectif 20X) montrent des monocytes pré-étiquetés avec la revue Cell Tracker vert et l&#39;image semblable sur les panneaux de droite révèlent CD44 et des microtubules (rouge) et les noyaux DAPI-colorés (bleus). Les flèches blanches dans (C) le point de noyaux de cellules endothéliales irradiées qui ont été colorées avec des anticorps contre γ-H2AX. noyaux de monocytes qui sont colorées d&#39;un bleu plus lumineux par DAPI sont facilement distingués des ovales noyaux des cellules endothéliales. Les images ont été prises avec l&#39;objectif 20X.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Figure 3. La sénescence associée à la bêta-galactosidase coloration des cellules endotheliales. Après analyse de l&#39;adhérence, les cellules sur des lamelles ont été soumises à une coloration de la sénescence associée à la bêta-galactosidase qui provoque lysosomes des cellules sénescentes à virer au bleu, comme on le voit dans la cellule endotheliale que est sélectivement lié par de nombreux monocytes, qui sont facilement identifiables en raison de leur petite taille et de forme sphérique. Image vue à travers l&#39;objectif 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. Énumération des grappes de monocytes sur les cellules endothéliales individuels. Après analyse de l&#39;adhérence, des images de cellules ont été prises à partir de plusieurs positions différentes et des grappes de monocytes identifiés et encerclé (en vert). Un groupe a été défini comme une agglomération de 10 ou plus de monocytes sur une cellule endothéliale. Le nombre de grappes de monocytes et le nombre de 12 jours cellules endothéliales post-irradiés (pointillé rouge) dans l&#39;image ont été comptées et le pourcentage de cellules endothéliales adhérentes calculées comme indiqué dans le tableau 1. Image prise par objectif 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Figure 5. Quantification de la fluorescence de monocytes adhérents. Après adhé<html> sion de dosage, les cellules sur des lamelles de verre ont été trypsinées et la fluorescence de monocytes pré-marqué avec CellTracker vert a été mesurée en utilisant un lecteur de plaques de fluorescence, comme un indicateur indirect de l&#39;adhésivité de la monocouche endothéliale. Les résultats de ces mesures à des jours indiqués post-irradiation ont été obtenus et tressé sur le graphique ci-dessus. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Figure 6. Représentation de dosage d&#39;adhérence scores au tableau 1. Les cellules endothéliales adhésives dans cinq endroits différents sur trois lamelles de verre ont été marqués comme décrit dans la figure 4 et les résultats sous forme de tableau ci-dessus démontre que 12 jours après 10 Gy d&#39;irradiation, de 8 à 10 pour cent des irradié les cellules endothéliales sont devenus adhésif. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; Pourcentage d&#39;adhésif cellules endotheliales </td></tr><tr><td></td><td> Disc 1 </td><td> Disc 2 </td><td> Disc 3 </td></tr><tr><td> Champ 1 </td><td> 8,65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Champ 2 </td><td> 10,44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> Champ 3 </td><td> 9,63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> Champ 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7,09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Champ 5 </td><td> 10,55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> Moyenne </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8,75 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Essai d&#39;adhésion scores. Cellules endothéliales adhésives dans cinq endroits différents sur trois lamelles de verre ont été marqués comme décrit dans Figure 4 et les résultats sous forme de tableaux ci-dessus montrant que 12 jours après l&#39;irradiation de 10 Gy, de 8 à 10 pour cent des cellules endothéliales irradiées est devenu adhésif.

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Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantification des cellules endothéliales adhésivité<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K vues.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

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In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assemblée nucléaire utilisant fractionnée extraits d&#39;œufs de Xénope

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Recherche

Biologie

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

L&#39;isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

La quantification de γH2AX Foci dans les échantillons de tissus

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Une méthode de quantification sensible et spécifique pour la détermination de sérum myosine cardiaque Binding Protein-C par immuno-Electrochemiluminescence

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Des cellules endothéliales Tube Formation test pour la<em&gt; In Vitro</em&gt; Etude de l&#39;angiogenèse

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

Quantification de l&#39;expression protéique et co-localisation utilisant multiplexé Immuno-histochimie Coloration et multispectrale Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Développement et caractérisation de<em&gt; In vitro</em&gt; Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Et production d&#39;oxyde nitrique

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...