This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).

1. Généralités cellules endothéliales Culture <ol><li> Culture des cellules bovines endotheliales aortiques (passages 4-9) sur des flacons de culture tissulaire revêtues de gélatine (couche de surface de culture de tissu avec 0,1% p / v de gélatine dans du PBS à température ambiante pendant 15 min) dans EGM-2 médias (à l&#39;EGM-2 balle Kit contenant 5% de sérum bovin foetal, des facteurs de croissance et tous les suppléments fournies par le fabricant, à l&#39;exception de l&#39;hydrocortisone). </li><li> Lorsque les cellules sont confluentes à court (environ 3 jours après le semis, après une 1: split 4), la récolte des cellules par traitement avec 0,05% p / v de trypsine / 0,02% p / v d&#39;EDTA dans du PBS à 37 ° C. Après la majorité des cellules ont détaché, ajouter complets EGM-2 médias pour étancher la trypsine puis centrifugeuse (100 xg, 5 min). </li><li> Préparation des cellules pour des études sur l&#39;adhérence de novo de cellules endotheliales vers la fibronectine (Expérience 1: Section 2) et le de-adhérence ultérieure des cellules endothéliales avec une adhérence établie sur ce substrat (expérience 2: Section 3). <ol><li> Laver récoltésles cellules une fois avec du exempt de sérum de Milieu 199 contenant 1% p / v d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et re-centrifugation (100 x g, 5 min). </li><li> Re-suspendre les cellules dans un milieu sans sérum 199 contenant 1% p / v de BSA à 2,5 x 10 5 cellules / ml (mesures d&#39;impédance cellule-substrat) ou 5 x 10 5 cellules / ml (analyses imagerie des cellules vivantes) et maintenir à 37 ° C avant utilisation. NOTE: Les réponses d&#39;adhérence de cellules sont très sensibles aux différences de température (par exemple, en raison des effets de convection) si tous les équipements et solutions utilisés pour manipuler et traiter les cellules pendant les protocoles suivants doivent être maintenus à une température constante de 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Expérience 1: Quantification De Novo Endothelial Cell Adhesion sur la fibronectine autochtones et MPO-oxydé (Cell-substrat Impédance) REMARQUE: Expérience 1 examine la mesure dans laquelle MPO médiation oxydation de fibronectine compromet sa capacité à soutenir de novo </em&gt; Adhésion des cellules endothéliales en suspension. <ol><li> Manteau fibronectine sur 96 puits or cellule-substrat tableaux impédance de microélectrodes. Ajouter 80 pl / puits de bovin purifié fibronectine à 5 ug / ml dans PBS, incuber pendant deux heures à 37 ° C et retirer la solution. </li><li> Incuber les surfaces revêtues de fibronectine avec MPO pour permettre la liaison de la MPO lié à la surface de la fibronectine. Ajouter 80 ul / puits de MPO purifié neutrophile humaine à 20 nm dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C. </li><li> Laver les surfaces deux fois avec HBSS pour éliminer toute MPO non lié. </li><li> Ajouter H 2 O 2 (0 à 10 uM de concentration finale) dans des puits de la plaque de matrice de microélectrodes contenant 80 pl / puits de HBSS pour initier catalysée par la MPO, l&#39;oxydation de la fibronectine HOCl-dépendante et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C. </li><li> Pour examiner l&#39;effet des inhibiteurs ou modulateurs de réactions catalysées MPO pertinents (par exemple, alternative enzyme MPOles substrats, les inhibiteurs de l&#39;enzyme ou des antioxydants; voir 9 pour plus de détails), les ajouter à la HBSS immédiatement avant H 2 O 2 plus. </li><li> Après 0,5 h, traiter les surfaces avec de la méthionine pour étancher espèces oxydantes de surface liée résiduels, ce est-chloramines liés aux protéines réactives, qui peuvent exercer des activités cellulaires de confusion. Ajouter 10 mM méthionine dans 80 ul HBSS par puits et incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Bloquer surfaces avec de la BSA. Ajouter 80 pl / puits de BSA à 0,2% p / v dans PBS, incuber pendant deux heures à 37 ° C et retirer la solution. REMARQUE: des régions de surface non revêtues résiduels appuieront l&#39;adhésion cellulaire et en bloquant ceux-ci avec une protéine non-adhésif (par exemple, BSA) veille à ce que les réponses d&#39;adhérence cellulaire dépendent étroitement de la matrice de cellules-adhésif purifié utilisé, dans ce cas, la fibronectine. </li><li> Laver les surfaces deux fois avec HBSS. REMARQUE: Aucun des traitements de surface précédentes affecte sensiblement cellule-substrat readings. </li><li> cellules endothéliales suspension de semences (ajouter 200 pl / puits à environ 2,5 x 10 5 cellules / ml, préparés dans un milieu sans sérum contenant 199 BSA 1%, voir 1.3) sur les surfaces revêtues de fibronectine indigènes ou MPO-oxydés. </li><li> Immédiatement après l&#39;ensemencement des cellules (à savoir, avant tout attachement des cellules et la diffusion), monter la plaque de réseau de microélectrodes sur l&#39;orifice d&#39;incubateur (logée dans un incubateur à 37 ° C en présence de 5% CO 2). <ol><li> Utilisation du logiciel de l&#39;instrument immédiatement prendre un «blanc» pour normaliser la lecture ultérieure impédance cellule-substrat («indice de la cellule») des valeurs aux valeurs de fond initiales obtenues en l&#39;absence d&#39;adhésion cellulaire. </li><li> Initier acquisition de données d&#39;index cellulaire continue (minimum d&#39;une cellule indice lecture / min). </li></ol></li><li> Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2 heures, période de temps pendant laquelle l&#39;attachement des cellules et la diffusion maximale est obtenue; ce qui se traduit parun plafonnement des valeurs d&#39;index de cellule (voir la figure 3A). NOTE: L&#39;expérience précédente (Expérience 1) examine la façon initiale MPO oxydation médiée par la fibronectine limite la capacité des cellules endotheliales à établir l&#39;adhérence des cellules sur ce substrat. L&#39;expérience (Experiment 2) suivante examine comment l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiation favorise diminutions dans la cellule-matrice adhérence (ce est à dire, de-adhérence) dans les cellules endothéliales avec adhérence établie sur ce substrat. Les traitements de ces deux expériences sont essentiellement identiques, sauf pour le temps d&#39;oxydation à médiation par MPO fibronectine (à savoir, avant l&#39;adhésion cellulaire - Expérience 1, après l&#39;adhésion cellulaire - Expérience 2). </li></ol> 3. Expérience 2: Quantification des cellules endothéliales De-adhérence de fibronectine en réponse à MPO médiation fibronectine oxydation (Impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes) <ol><li> Manteau fibronectine sur 96 puits microélectrodes d&#39;or unerrays pour des mesures d&#39;impédance cellule-substrat (ajouter 80 ul / puits de la fibronectine à 5 ug / ml dans du PBS et on incube pendant 2 heures à 37 ° C) ou des plaques de culture cellulaire à fond de verre de 35 mm pour les analyses d&#39;imagerie des cellules (ajouter 2 ml / boîte de fibronectine à 5 ug / ml dans du PBS et on incube pendant 2 heures à 37 ° C). </li><li> Bloquer surfaces avec de la BSA. Ajouter BSA à 0,2% p / v dans du PBS à des volumes indiqués dans 3,1 et incuber pendant 2 heures à 37 ° C. </li><li> Incuber surfaces avec MPO pour permettre la liaison du MPO à la fibronectine. Ajouter 20 nM MPO humaine purifiée dans du HBSS les volumes indiqués dans 3,1 et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C. </li><li> Laver les surfaces deux fois avec HBSS pour éliminer toute MPO non lié. </li><li> cellules endothéliales de semences en suspension (préparés Milieu 199 contenant 1% p / v de BSA sans sérum; voir 1.3) sur les surfaces revêtues de fibronectine indigènes ou MPO-portant. <ol><li> Ajouter 200 ul / puits à 2,5 x 10 5 cellules / ml à 96 puits cellule-substrat tableaux impédance de microélectrodes. </li> &lt;li&gt; Ajouter 2 ml / boîte à 5 x 10 5 cellules / ml à 35 mm à fond de verre plats de culture cellulaire. </li></ol></li><li> Immédiatement après l&#39;ensemencement des cellules (ce est à dire, avant toute fixation des cellules et la diffusion): <ol><li> Mont 96 des plaques de matrice de microélectrodes sur le Port impédance incubateur cellulaire substrat (logé dans un incubateur à 37 ° en présence de 5% de CO 2) et prendre des lectures «en blanc» pour lancer l&#39;acquisition continue de données d&#39;index cellulaire (cf. Section 2.10 ). </li><li> Transfert à fond de verre 35 mm boîtes de culture cellulaire à un incubateur à 37 ° C en présence de 5% CO 2. </li></ol></li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 heures pour permettre la fixation des cellules et maximale d&#39;écartement (voir section 2.11). </li><li> Retirez brièvement les (lectures d&#39;index de la cellule de pause à ce stade) de 96 puits de plaque de matrice de microélectrodes ou 35 mm à fond de verre cellulaire boîte de culture de la 37 ° C incubateur, retirez surnageant cellulaire et ajouter réchauffé (37 ° C) HBSS (volumes que per étape 3.1). REMARQUE: HBSS est employée lorsque l&#39;on étudie MPO-réactions d&#39;oxydation catalysée place de milieux de culture complète que celle-ci contient des espèces oxydables qui interfèrent avec les réactions d&#39;oxydation. </li><li> Pour examiner l&#39;effet des inhibiteurs / modulateurs des réactions catalysées par la MPO (substitution des substrats enzymatiques, des inhibiteurs enzymatiques ou des antioxydants ou des inhibiteurs) de signalisation cellulaire (par exemple, 40 uM blebbistatin pour inhiber la contractilité actomyosine), ajouter ces maintenant. </li><li> Placer immédiatement la plaque de matrice de microélectrodes de nouveau dans les (lectures d&#39;index cellulaire re-commence à ce point) 37 ° port incubateur C ou le verre de 35 mm à fond plat de culture cellulaire de retour dans le 37 ° C incubateur, et permettent aux cellules de se équilibrer dans le HBSS pendant 0,5 heure. NOTE: Après 0,5 h équilibrage dans HBSS, les valeurs de l&#39;indice de la cellule se stabilisent à des valeurs légèrement inférieures; lorsque les cellules pré-incubation avec des substrats d&#39;enzyme, l&#39;enzyme et les inhibiteurs de la signalisation des cellules ou des antioxydants, assurer d&#39;abord que tHese ne affecte pas significativement les valeurs obtenues après équilibrage. </li><li> Initier MPO-catalysée, l&#39;oxydation de la fibronectine HOCl-dépendante et dé-adhérence. <ol><li> Pour les études d&#39;impédance de cellules en utilisant 96 des plaques de matrice de microélectrodes: <ol><li> Retirer la plaque de matrice de microélectrodes de l&#39;incubateur et de pause des mesures d&#39;indice de la cellule. </li><li> Ajouter H 2 O 2 (concentration finale de 0 à 10 uM) à la HBSS et mélanger doucement par pipetage répété. </li><li> Immédiatement, re-fixer le réseau de microélectrodes de retour sur l&#39;orifice d&#39;incubateur à 37 ° C et à nouveau commencer l&#39;acquisition de valeurs d&#39;index de cellule. </li></ol></li><li> Pour les études d&#39;imagerie des cellules vivantes en utilisant 35 mm boîte de culture de cellules de verre à fond: <ol><li> Retirer la boîte de culture de l&#39;incubateur et monter sur une scène 37 ° C chauffée d&#39;un microscope confocal inversé équipé d&#39;un objectif 63X d&#39;eau avec optique DIC appropriés pour l&#39;enregistrement de films de cellules vivantes. </li><li> Focus sur les cellules etoptimiser l&#39;optique DIC (éclairage de Köhler, biais retard et décalage caméra / de gain; pour plus de détails, voir 13). </li><li> Initier film DIC et enregistrer des lectures de base de cellules non traitées pendant 1 min. </li><li> Ajouter H 2 O 2 (concentration finale de 0-10 uM) et mélanger délicatement par pipetage répété. Re-concentrer le microscope (si nécessaire) et continuer l&#39;enregistrement de films DIC des cellules traitées pour la période de temps requise. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Analyse et présentation des données <ol><li> Données d&#39;impédance cellule-substrat <ol><li> Exporter des données brutes (indice de la cellule en fonction du temps) dans un tableur. </li><li> Pour les études cellule de-adhérence (Expérience 2: Section 3), normaliser les données en définissant des valeurs enregistrées immédiatement avant le début de l&#39;oxydation de la fibronectine MPO-médiation à une valeur de 1 (ce est à dire, immédiatement avant l&#39;ajout de H 2 O 2 en 3.11 .1.1). NOTE: Cela garantit que, par rapportchangements dans les valeurs de l&#39;indice de cellules induites par l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiation ne sont pas masqués par de petites différences initiales dans les valeurs de l&#39;indice de cellule absolue entre les puits. <ol><li> Les données actuelles que des parcelles de l&#39;indice normalisé de cellules (axe des y) en fonction du temps (axe des x). </li></ol></li></ol></li><li> Données d&#39;imagerie de cellules vivantes (études cellule de-adhésion dans l&#39;expérience 2: article 3) <ol><li> Ouvrez DIC vivent les films d&#39;imagerie cellulaire enregistrées immédiatement avant et après l&#39;ouverture de l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiation dans un programme d&#39;analyse d&#39;image standard (par exemple, logiciel ImageJ). </li><li> Dans au moins deux films distincts DIC sélectionner au hasard plusieurs cellules et mesurer leur surface projetée en images séquentielles (par exemple, à des intervalles de 1 min) en traçant manuellement leur bord de la membrane et de quantifier le nombre de pixels fermés. </li><li> Exportation des données brutes (surface cellulaire projetée en fonction du temps) à une feuille de calcul Excel et normaliser les données de la zone cellulaire en fixant des valeurs enregistrées immédiatement avantl&#39;initiation de l&#39;oxydation de la fibronectine à médiation MPO à une valeur de 1 (ce est à dire, immédiatement avant l&#39;addition de H 2 O 2 dans 3.11.2.3). </li><li> Les données actuelles comme une parcelle de la zone normalisée cellulaire (axe des y) en fonction du temps (axe des x). </li></ol></li></ol>

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	<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+focal+adhesions+and+barrier+function.">Endothelial focal adhesions and barrier function.</a> J Physiol. 569, 359-366 (2005).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).</li><li>Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. 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Les auteurs ne ont aucune divulgation à faire.

L&#39;adhérence cellule-matrice et processus de-adhérence peuvent être quantifiés avec précision en temps réel avec une haute résolution temporelle utilisant une impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches en temps réel fournissent un avantage majeur sur les analyses point final de l&#39;adhésion cellulaire, qui fournissent une mauvaise résolution temporelle. En quantifiant avec précision rapides réponses de-adhésion avec haute résolution temporelle, ces analyse...

Adhésives contacts stables entre les cellules et leur matrice extracellulaire environnante sont nécessaires pour le maintien de l&#39;homéostasie tissulaire. Par exemple, l&#39;adhésion des cellules endothéliales à la matrice sous-endothéliale dans les vaisseaux sanguins joue un rôle critique dans le maintien de l&#39;intégrité de la couche endothéliale et sa fonction de régulation homéostatique comme une barrière semi-perméable vasculaire 1. Le cytosquelette d&#39;actine est mécaniquement couplé à l&#39;adhésif molécules de la matrice sur les sites d&#39;adhérence cellule-matrice et des contacts d&#39;adhésif à l&#39;interface cellule-matrice jouent un rôle important dans la détermination de la position de la membrane cellulaire en résistant à des forces de traction actomyosine centralement dirigées. Stimuli extracellulaires qui modifient cellule-matrice adhérence modifierait nécessairement l&#39;équilibre des forces à l&#39;interface cellule-matrice, un événement qui est rapidement &quot;senti&quot; par des protéines de signalisation mécano-sensibles, résultant dans la transduction du &quot;outside-in de signalisation&quot;. Ce pari diaphonieWeen cellules et leur matrice extracellulaire environnante joue un rôle clé dans le contrôle de la forme des cellules, la motilité, la fonction, la prolifération et la survie 2. Les processus physiopathologiques variés (le développement embryonnaire, l&#39;inflammation, la cicatrisation des plaies et les métastases du cancer) sont caractérisées par le remodelage dynamique de substrats de la matrice d&#39;adhésif par des oxydants et / ou des enzymes dégradant la matrice 3,4. Par exemple, l&#39;adhésif protéines de la matrice sous-endothéliale des vaisseaux sanguins (par exemple, la fibronectine) sont impliqués que les principaux objectifs de la modification ou de la dégradation dans les maladies inflammatoires humaines en raison de la production localisée d&#39;oxydants réactifs (par exemple, l&#39;acide hypochloreux, HOCl) par l&#39;enzyme de leucocytes dérivés myéloperoxydase (MPO), qui se accumule dans le sous-endothelium vasculaire au cours de la maladie inflammatoire (figure 1) 9/5. Changements dans la cellule-matrice adhérence induites par MPO-oxydants dérivés et autres stimuli de matrice modifier sont likely à jouer un rôle important dans la modification de l&#39;homéostasie vasculaire au cours de divers processus pathologiques, par exemple, par modification de la signalisation des cellules endotheliales, la morphologie et la viabilité, ce qui perturbe la fonction endothéliale et l&#39;intégrité de la barrière. Toutefois, les réponses de signalisation morphologiques et cellulaires de cellules adhérentes à des modifications de la matrice extracellulaire commencent seulement à être compris. Pour comprendre comment les modifications de la matrice dictent l&#39;évolution de la dynamique d&#39;adhésion cellulaire et voies de signalisation cellulaire d&#39;adhésion dépendant, les techniques sont tenus que de quantifier avec précision les changements dans la cellule-matrice adhérence en temps réel, avec une haute résolution temporelle. Ici, nous décrivons complémentaire impédance cellule-substrat et des techniques d&#39;imagerie des cellules vivantes qui répondent à ces critères et qui fournissent une plate-forme pour quantifier l&#39;adhésion cellulaire et des processus de-adhérence d&#39;une manière non-invasive. Nous montrons comment ces cellules impédance-substrat et imagerie des cellules vivantes Approdouleurs peuvent être facilement utilisés pour (i) suivre la dynamique de l&#39;attachement des cellules et la diffusion (ce est à dire, de novo adhésion cellulaire) sur des substrats de matrice natifs et modifiés, et (ii) pour mesurer la dynamique de détachement cellulaire matrice (c.-de-adhérence ) par des cellules adhérentes exposés à des stimuli de matrice modificateurs. Le système xCELLigence cellule-substrat impédance biocapteur fournit une mesure en continu de la zone de contact cellule-matrice par la quantification de l&#39;impédance électrique à la surface de 96 puits réseaux de microélectrodes de l&#39;or et exprime ces mesures d&#39;impédance électrique comme &quot;indice de cellule&quot;, une valeur sans dimension qui est en grande partie proportionnelle à la surface de contact de substrat de cellule 10 (figure 2), tout en étant également sensibles aux variations de la distance moyenne entre le (isolante) membrane cellulaire et la surface d&#39;électrode 11. Une augmentation supplémentaire de valeurs de l&#39;indice de la cellule est également atteint lors de la formation du serrée contacts cellule-cellule that restreindre courant paracellulaires, 11 des conditions qui ne existent pas dans les expériences décrites dans cette étude. Mesure de la surface projetée des cellules individuelles au fil du temps par analyse d&#39;image de time-lapse contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) des films fournit une mesure complémentaire de changements dans le domaine de contact cellule-substrat et fournit des informations supplémentaires concernant la nature exacte et la dynamique de la changements morphologiques quantifiés par la méthode de l&#39;impédance cellule-substrat. Plus précisément, nous décrivons l&#39;application de ces approches pour contrôler la manière dont l&#39;oxydation des adhésifs protéines de la matrice sous-endothéliale (par exemple, la fibronectine) (i) MPO-médiée réduit l&#39;adhérence de novo de cellules endothéliales en suspension sur de la fibronectine purifiée et (ii) déclenche cellule-matrice de -adhesion dans les cellules endothéliales avec adhérence établie sur la fibronectine. En effectuant la signalisation cellulaire parallèle des analyses au fil du temps en utilisant Biochem pertinentesdosages iCal (par exemple, Western blot), les relations temporelles et causales entre les processus adhérence / de-adhésion et les changements associés à la signalisation cellulaires événements d&#39;adhésion dépendant peuvent être déterminées. Ces approches ont été récemment utilisés pour démontrer que l&#39;oxydation de la matrice extracellulaire catalysée par les dépôts sous-endothéliaux de MPO déclenche une perte rapide de la cellule-matrice adhésion des cellules endothéliales qui est entraîné par des forces contractiles actomyosine préexistants 9. Fait important, en permettant à la relation temporelle entre les changements à la fois dans l&#39;adhérence cellulaire et de signalisation à déterminer l&#39;adhésion cellulaire dépendante, ces approches ont identifié que la modification de la matrice MPO induite et cellulaire de-adhérence déclenche changements de signalisation cellulaires voies importantes d&#39;adhérence dépendant notamment Src kinase dépendante de la phosphorylation paxilline et chaîne légère de myosine II phosphorylation (Figure 1) 9. Ce mode de signalisation redox dépendantes, invÉSOLUTION l&#39;activation des événements de signalisation intracellulaire par des réactions d&#39;oxydation extracellulaires qui perturbent l&#39;adhérence cellule-matrice, représente un nouveau mode de signalisation cellulaire appelée &quot;outside-in signalisation redox&quot; (figure 1) 9. En général, ceux-ci complémentaire biocapteur de l&#39;impédance cellule-substrat et des approches d&#39;imagerie des cellules devraient être utiles pour révéler comment différents stimuli ou des agents matriciels modificateurs de route changements dans la dynamique de l&#39;adhérence cellulaire, la morphologie et de signalisation au sein de différents types de cellules adhérentes soumises à une grande variété de paramètres expérimentaux. Le protocole suivant décrit comment quantifier l&#39;impact de l&#39;oxydation de la matrice MPO médiation de novo sur l&#39;adhérence des cellules endothéliales (Experiment 1) et la cellule de-adhésion endothéliale (Experiment 2) des processus. MPO se lie avec avidité à la fibronectine et d&#39;autres protéines de la matrice extracellulaire sous-endothéliaux et nous adhésiveses peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) pour convertir les ions chlorure (Cl -) à la très réactif chloration oxydante de l&#39;acide hypochloreux (HOCl), qui réagit à proximité de ces protéines de la matrice et perturbe les propriétés adhésives de la cellule (Figure 1) 8,9, 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1328">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:551px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">E-Plate 96</td>
			<td>single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">blebbistatin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">B0560</td>
			<td>selective inhibitor of non-muscle myosin-II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">BW-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">05470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGM-2 BulletKit</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">CC-3162</td>
			<td>endothelial cell growth media kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fibronectin, lyophilized powder</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">F-4759</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish</td>
			<td style="width:223px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:151px;">FD35-100</td>
			<td>Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Gelatin from bovine skin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G9391</td>
			<td>cell culture substratum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:223px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">107298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Medium-199</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">11150-059</td>
			<td>serum-free cell media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Methionine</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M9500</td>
			<td>quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">475911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td>Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using cell-substrate impedance and live cell imaging to measure real-time changes in cellular adhesion and de-adhesion induced by matrix modification

L&#39;adhérence cellule-matrice jouent un rôle clé dans le contrôle de la morphologie cellulaire et de signalisation. Les stimuli qui perturbent l&#39;adhérence cellule-matrice (par exemple, la myéloperoxydase et d&#39;autres oxydants de matrice modificateur / enzymes libérées au cours de l&#39;inflammation) sont impliqués dans le déclenchement des changements pathologiques dans la fonction cellulaire, le phénotype et la viabilité dans un certain nombre de maladies. Ici, nous décrivons comment impédance cellule-substrat et les approches d&#39;imagerie des cellules peuvent être facilement utilisés pour quantifier avec précision les changements en temps réel dans l&#39;adhésion cellulaire et de-adhérence induite par modification de la matrice (en utilisant des cellules endothéliales et myéloperoxydase comme un stimulus de matrice modifier physiopathologique) avec une résolution temporelle élevée et d&#39;une manière non-invasive. Le système de l&#39;impédance cellule-substrat xCELLigence quantifie en continu la zone d&#39;adhérence cellule-matrice, en mesurant l&#39;impédance électrique à l&#39;interface cellule-substrat dans les cellules cultivées sur des réseaux de microélectrodes or. L&#39;analyse des images du time-lapse différenLes films tiel de contraste d&#39;interférence de quantifier l&#39;évolution de la surface projetée de cellules individuelles dans le temps, représentant les changements dans la zone de contact cellule-matrice. Les deux techniques de quantifier avec précision les changements rapides aux processus d&#39;adhésion cellulaire et de-adhérence. Impédance Cell-substrat sur les tableaux de microélectrodes biocapteurs fournit une plate-forme pour des mesures robustes, à haut débit. Analyse imagerie des cellules vivantes fournir des détails supplémentaires concernant la nature et la dynamique des changements morphologiques quantifiés par des mesures d&#39;impédance cellule-substrat. Ces approches complémentaires fournissent de précieuses informations sur la façon dont la modification oxydative myéloperoxydase catalysée subcellulaires composants de la matrice extracellulaire déclenche des changements rapides dans l&#39;adhésion cellulaire, la morphologie et de signalisation dans les cellules endothéliales. Ces approches sont également applicables pour l&#39;étude de la dynamique d&#39;adhésion cellulaire en réponse à des stimuli autres modificateurs de matrice et des cellules adhérentes connexes (par exemple, des cellules épithéliales).

Quantification en temps réel des cellules endotheliales de-adhérence de fibronectine, en réponse à l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiée (Expérience 2). L&#39;ensemencement des suspensions de cellules endotheliales sur native (MPO libre) fibronectine ou MPO portant les résultats de la fibronectine dans l&#39;attachement cellulaire maximale et d&#39;étalement moins de 2 heures, tel que jugé par un plafonnement des valeurs d&#39;index de cellule de la mesure de l&#39;impédance du substr...

Watch this Scientific Journal Video about Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification at JoVE.

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Ici, nous présentons un protocole de quantifier en permanence les processus d&#39;adhésion cellulaire et de-adhésion avec haute résolution temporelle d&#39;une manière non-invasive par l&#39;impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches révèlent la dynamique des processus adhésion cellulaire / de-adhérence déclenchées par modification de la matrice et de leur relation temporelle à des événements de signalisation adhérence dépendant.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

using-cell-substrate-impedance-live-cell-imaging-to-measure-real-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.9K vues.  University of New South Wales.  Ici, nous présentons un protocole de quantifier en permanence les processus d'adhésion cellulaire et de-adhésion avec haute résolution temporelle d'une manière non-invasive par l'impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches révèlent la dynamique des processus adhésion cellulaire / de-adhérence déclenchées par modification de la matrice et de leur relation temporelle à des événements de signalisation ad...

Vidéo: Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Recherche

Bio-ingénierie

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

La récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to investigate mechanisms governing cell adhesion under dynamic flow conditions. For instance, cancer cells labeled with multiple fluorophores can be perfused over a potentially reactive substrate to model mechanisms of cancer metastasis. However, multi-channel single camera systems and color cameras exhibit shortcomings in image acquisition for real-time live cell analysis. To overcome these limitations, we used a dual camera emission splitting system to simultaneously capture real-time image sequences of fluorescently labeled cells in the flow chamber. Dual camera emission splitting systems filter defined wavelength ranges into two monochrome CCD cameras, thereby simultaneously capturing two spatially identical but fluorophore-specific images. Subsequently, psuedocolored one-channel images are combined into a single real-time merged sequence that can reveal multiple target molecules on cells moving rapidly across a region of interest.

Dual camera emission splitting systems for two-color fluorescence microscopy generate real-time image sequences with exceptional optical and temporal resolution, a requirement of certain live cell assays including parallel plate flow chamber adhesion assays. When software is employed to merge images from simultaneously acquired emission channels, pseudocolored image sequences are produced.

Capture simultanément en temps réel des images en deux canaux d&#39;émission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: Applications à l&#39;adhésion cellulaire

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

Électrique Cell-substrat Impedance Sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universal à main en trois dimensions optoacoustique sonde d&#39;imagerie pour Deep Tissue angiographie humain et des études précliniques fonctionnels en temps réel

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

À main photoacoustique clinique, système d’imagerie pour l’imagerie animale petit Non invasif en temps réel

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Mesure des métalloprotéinases de la matrice cellulaire Global et l’activité métabolique des Hydrogels 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...