Ce travail a été financé par des subventions du NIH R01 CA107469, CA125577 R01, et U01CA154224 CG Kleer, l&#39;Université du Centre de soutien de cancer du Michigan.

1. Préparation du matériel et de la culture des médias <ol><li> Facteur de croissance dégel réduite (GFR) Matrigel à 4 ° CO / N. </li><li> Réchauffez médias complètes pour la lignée cellulaire nécessaire à 37 ° C. MCF10A-ATCC spécifié médias; F-12 du milieu de HME-Ham supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal, 1 ug / ml d&#39;hydrocortisone, 5 ng / ml d&#39;insuline, 10 ng / ml de facteur de croissance épidermique, et la toxine du choléra 100 ng / ml; F-12 les médias SUM 149-Ham additionné de 5% de FBS, 2 pg / ml d&#39;hydrocortisone et 5 ug / ml d&#39;insuline; et MDA-MB-231-10% FBS-DMEM </li><li> Prérefroidir une chambre diapositive 8 de bien sur la glace. </li><li> Préparer tissu capot et fournitures culture. </li></ol> 2. Trois dimensions de la culture en Chambre de 8 puits diaporama <ol><li> Manteau de chaque puits de la diapositive 8 puits avec 40 pi de GFR Matrigel. Ajouter le Matrigel dans le centre de la diapositive et s&#39;est ensuite propagée à l&#39;aide d&#39;une pipette P200. Essayez de répartir aussi équitablement que possible, en évitant les bulles et, étalée qui peut conduire àformation de ménisque. </li><li> Incuber les lames à 37 ° C sous 5% de CO 2. Alors que le Matrigel se solidifie, trypsiniser les cellules, recueillir et tourner à 150 xg dans le tissu de la culture centrifugeuse pendant 4 min. </li><li> Compter les cellules et diluer à 12 500 cellules / ml dans du milieu complet de la ligne de cellule respective. Ajouter GFR Matrigel à 2% et ajouter 400 ul à chaque puits d&#39;une lame de chambre de pré-revêtue de Matrigel. </li><li> Incuber les lames dans le CO 2 incubateur. Donner de nouveaux changements de médias complets chaque 4 e jour jusqu&#39;à 15 jours. </li><li> Le traitement avec des inhibiteurs pharmacologiques: Pour les études d&#39;inhibiteur ajouter des inhibiteurs de petites molécules pour le milieu complet au moment de placage suivie par des changements fraîches de médias supplémenté avec les inhibiteurs de tous les trois jours, tandis que la croissance des cellules sur Matrigel GFR. </li><li> Le traitement avec la protéine purifiée: <ol><li> Plaquer les cellules suivant les étapes 2.1 à 2.3. Permettre aux cultures de se développer pendant 4 jours, puis par starvati sériquespendant 16 heures. </li><li> Au jour 5, traiter les cellules avec une concentration appropriée de protéine purifiée dans 0,1% de FBS complété médias pour les cellules privées de sérum. Donnez changement de milieu frais avec la protéine purifiée après 2 jours. </li><li> Au jour 10 de remplacer le milieu conditionné avec des milieux complets HME. Permettre aux cultures de croître pendant encore 5 jours. </li></ol></li><li> Immunofluorescence des structures acineuses cultivées sur Matrigel: <ol><li> Préparer 2% de paraformaldehyde, 0,5% de Triton X-100 et de la glycine 100 mM dans 1 x PBS, pH 7,4. Préparer le tampon d&#39;immunofluorescence (IF tampon) qui comprend de 1 x PBS contenant 0,1% d&#39;albumine de sérum bovin, 0,2% de triton X-100, 0,05% de Tween-20. </li><li> Utiliser un embout de pipette P200 pour aspirer soigneusement le milieu conditionné. </li><li> Fixer les structures acineuses avec 2% de paraformaldehyde fraîchement préparé à la température ambiante (RT) pendant 20 min. </li><li> Perméabiliser les cellules avec 0,5% de Triton X-100 pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Laver la cultures trois fois avec 100 mM de glycine, de 10 à 15 min pour chaque lavage. </li><li> Bloquer les cellules avec 10% de sérum de chèvre dans un tampon, appelé bloc primaire, pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Incuber les cultures avec un anti-souris 20 pg / ml de chèvre F (ab &#39;) 2, fragment dans un tampon de bloc primaire pendant 30 min. Cette étape est importante pour bloquer les espèces d&#39;IgG de souris immunoréactives dans le Matrigel. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps primaire dans la seconde solution de blocage (bloc primaire 20 pg / ml d&#39;anticorps de chèvre anti souris F (ab &#39;) 2 fragment) O / N à 4 ° C. </li><li> Laver trois fois avec un tampon IF pour 10-15 min chacun avec doux balancement. </li><li> Incuber avec des anticorps secondaires conjugués fluorescents dans un tampon pour 45 min. </li><li> Laver pendant 3x pendant 10 min chacun avec un tampon IF avec doux balancement. </li><li> Monter les lames avec le réactif anti-fade contenant DAPI pour visualiser les noyaux. </li><li> Laisser sécher les lames O / N à la température ambiante. </li><li> acquisition de l&#39;image: Acquérir les images confocale au km de la coloniedsection de cellules cultivées sur le dessus de Matrigel. Pour plus d&#39;informations acquérir une série de sections optiques sur toute la longueur de la structure de cellules acineuses par Z empilage. </li></ol></li></ol> 3. Trois dimensions de la culture dans 2 puits Chambre diapositives pour Immunoblotting <ol><li> Prérefroidir une chambre diapositive 2 de bien sur la glace. Suivez les étapes 2.1-2.4 l&#39;extension des réactifs pour la 2-bien diapositive par exemple manteau de chambre avec 160 ul de Matrigel et ajouter 1,6 ml de cellules / Matrigel mélanger dans chaque puits de la lame 2 puits. </li><li> Récolter les structures acineuses du Matrigel en utilisant le kit de récolte des cellules de culture 3D disponibles dans le commerce en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Diluer le lavage de la cellule et de récolte de cellules tampons à 1x et prérefroidir à 4 ° C. Le lavage et le délogement de Matrigel doivent être effectuées sur de la glace. </li><li> Laver les structures acineuses 3x à l&#39;aide du tampon de lavage des cellules. </li><li> Recueillir les acini en tubes de 15 ml à centrifuger en utilisant bu de récolte de cellulesffer suivie d&#39;une incubation de 30 min sur un agitateur à 4 ° C. Mélangez bien avec une suspension pipette de 1 ml. Cela va rompre le Matrigel en petits morceaux et libérer la plupart des cellules dans le tampon de la récolte des cellules. </li><li> Sédimenter les cellules à 200 xg dans une centrifugeuse de culture. Retirer la couche flottante d&#39;hydrogel de le culot cellulaire avec une pointe de pipette P200. </li><li> Remettre en suspension les lysats dans un tampon d&#39;échantillon SDS fournies avec le kit. Tampon de lyse RIPA peut également être utilisé. </li></ol> 4. Quantification de vs malin phénotype du sein bénigne <ol><li> Cultiver les cellules en triple pour chaque ensemble de traitement suivant les étapes 2.1 à 2.4. </li><li> Prendre des images de contraste de phase des structures acineuses de chaque puits à 5X ou 10X résolution en utilisant un microscope à contraste de phase fixée à un levier de vitesses de glissement et un ordinateur. Prendre les images en déplaçant le coulisseau d&#39;une trame à l&#39;autre et couvrant la totalité du puits de la lame ainsi chambré. </li><li> Compter le nombre total de structures acineuses,le nombre de simple acini plat rond et le nombre de structures multiacinar ou des structures de plus en plus au hasard manquent d&#39;organisation et de processus de branchement qui en découlent. </li><li> Calculer le pourcentage de simples structures acineuses plat rond vs structures malignes et l&#39;intrigue que le graphique de la colonne. Calculer la signification par le test t de Student. </li></ol>

<ol>
	<li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+in+breast+development+and+disease.">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li><li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors.">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).</li><li>Rosen, P. P., Rosen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosen's breast pathology. , (2008).</li><li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay.">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li><li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression.">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li><li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1/p38+pathway,+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer.">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li><li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-&#946;+receptor.">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-&#946; receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts.">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth,+progression,+and+metastasis+to+bone.">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li><li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells.">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li><li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes.">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons décrit ici la culture tridimensionnelle de cellules épithéliales mammaires sur une membrane basale reconstituée, et l&#39;utilité de ce système par rapport à la différence entre le phénotype malin bénigne du sein. Ce système peut également être utilisé pour la culture de différents types à partir d&#39;autres tissus glandulaires cellulaires et a été rapporté comme ayant été utilisé avec succès pour la culture épithéliale prostatique, l&#39;épithélium bronchique, et les cellules épi...

Trois culture tridimensionnelle (3D) de cellules épithéliales mammaires sur la membrane basale reconstituée est un important système modèle pour étudier le phénotype et le complexe de signalisation associée sein normal et le cancer du sein 2,3. L&#39;unité fonctionnelle du sein est l&#39;unité lobulaire conduit terminal (TDLU) qui se compose d&#39;un petit conduit qui se ramifie en acini. Les acini sont des structures hautement organisées, composées de deux couches de cellules, les cellules épithéliales et myoépithéliales, qui sont entourés par une membrane basale 5. Les caractéristiques les plus distinctives des acini normaux sont polarisation cellulaire, l&#39;attachement à la membrane basale sous-jacente et les contacts cellule-cellule spécialisés. Cette organisation complexe est perturbé dans les carcinomes invasifs. Les cultures 2D largement utilisés, où les cellules sont cultivées en monocouche, ne permettent pas la formation d&#39;acini. Ainsi, la culture monocouche manque en proposant un système pour capturer la relation complexe entre les cellules épithélialesdans le sein normal et leur dérégulation dans le cancer du sein. Cultures épithéliales monotypique fonctionnelles des cellules mammaires ont été développés dans plusieurs laboratoires 2,3. Culture 3D implique la croissance des cellules mammaires sur Matrigel, qui est un extrait solubilisé dérivé de cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm et est disponible dans le commerce. D&#39;autres substrats 3D comme le collagène I sont également utilisés. Les cellules du sein peuvent être cultivées en 3D 3D par dosage incorporé, où les cellules sont mises en culture dans du Matrigel embarqué 2. Alternativement, les cellules peuvent être cultivées en 3D sur test, aussi appelé test de superposition 3D, qui est rentable car elle nécessite moins de volume de Matrigel et facilite la surveillance en temps de déchéance de la formation de colonies par imagerie à contraste de phase et est idéal pour l&#39;imagerie in situ 2 -3. Le 3D-dessus essai a été utilisé pour définir la corrélation entre le phénotype et acineuses profil d&#39;expression génique 7. Culture 3D peut être effectively utilisé pour distinguer les cellules normales et bénignes de cancer invasif. Les cellules normales et bénignes du sein constituent croissance arrêté structures polarisées avec une lumière bien définis dans le centre sur Matrigel tandis que les cellules de carcinome invasif poussent abondamment et au hasard sans compensation de la lumière. E6/E7 immortalisé des cellules épithéliales mammaires humaines et lignée cellulaire MCF10A, qui est une lignée cellulaire immortalisée spontanément isolée d&#39;un patient de 36 ans avec des changements fibrokystique, ont été utilisés avec succès pour retrouver le phénotype bénigne du sein en 3D et 3,8 ont servi un système modèle pour étudier la fonction de suppresseur de tumeur oncogène et de plusieurs molécules 8,9. Ces cellules bénignes peuvent être conçues pour manipuler gène (s) d&#39;intérêt par la mise en place de lentivirus / rétrovirus. Si le gène (s) d&#39;intérêt est un gène suppresseur de tumeur, shRNA knockdown médié va conduire à une transformation maligne alors que si le gène d&#39;intérêt est une surexpression de l&#39;oncogène dans des cellules bénignesdevrait montrer un phénotype malin. Dans les deux cas, les structures acineuses formées en 3D peuvent capturer la transformation maligne. Cellules individuelles bénignes plaqués en 3D commencent à proliférer et former autour des structures sphériques. 5-8 jours par cet agrégat sphérique de cellules se différencier en une couche entourant polarisée de cellules qui est en contact avec le Matrigel, et une masse interne de cellules polarisées moins, qui manquent de contact avec le Matrigel. Dans les 10-15 prochains jours les cellules internes vont commencer à mourir par apoptose formant une lumière claire. Les cellules malignes se développeront perdre au hasard de leur polarité. Cellules hautement malignes forment habituellement structures de branchement. Ces différences dans le phénotype peuvent être capturés par temps imagerie en contraste de phase de déchéance et in situ par immunomarquage avec des marqueurs moléculaires pertinents. Les marqueurs les plus couramment utilisés sont les alpha 6-intégrine, un marqueur de la polarité de la base, en combinaison avec le marqueur de prolifération phospho-histone 3 et la apoptotmarqueur ic caspase-3. Ce dernier point est important de déterminer si il ya formation lumen dans le centre de la acini, une caractéristique des cellules normales et bénignes du sein. D&#39;autres marqueurs de polarité et de contact cellule-cellule comprennent GM130, la laminine, ERM, la E-cadhérine. Alternativement les lignées cellulaires de cancer du sein peuvent être conçues pour manipuler le gène d&#39;intérêt. Dans ce cas, le retour à un phénotype plus bénin arrêté la croissance peut être utilisé comme une lecture à distinguer du phénotype du cancer. Culture 3D peut également être utilisée avec précaution pour délimiter les voies de signalisation impliquées dans la transformation maligne de 10 à 11. Utilisation de l&#39;mentionnés ci-dessus se lit en inhibiteurs pharmacologiques, des anticorps bloquants ou des protéines recombinantes peut être utilisé être identifier à la signalisation moléculaire conduisant à la transformation maligne. Avec la poursuite des efforts de différents laboratoires, il est possible d&#39;extraire les cellules de la 3D à isoler l&#39;ARN et également préparer des lysats pour immuno et immuniténoprecipitation. Ces stratégies sont décrites dans un pas à pas et de manière détaillée dans le protocole.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced matrigel</td>
			<td style="width:83px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:167px;">Avoid repeat freeze thaw&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass hamber slides 8-well</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177402</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass chamber slides 2- well&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177380</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">goat anti mouse F(ab&#180;)2 fragment</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent conjugated Alexa antibodies</td>
			<td style="width:83px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Please look at molecular probes website</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:83px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">3D Culture Cell Harvesting kit</td>
			<td style="width:83px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">3448-020-k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Apha-6-integrin</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MAB1378</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-GM130</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610822</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">16-222</td>
			<td>1:100 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)</td>
			<td style="width:83px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">9661s</td>
			<td>1:50 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-E-cadherin</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610181</td>
			<td>1:200 dilution for IF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells

Les carcinomes du sein invasifs sont un groupe de tumeurs épithéliales malignes caractérisé par l&#39;invasion des tissus adjacents et la propension à former des métastases. L&#39;interaction des signaux entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement exerce une forte influence sur la croissance du cancer du sein et le comportement biologique 1. Cependant, la plupart de ces signaux de la matrice extracellulaire sont perdus ou leur pertinence est sous-lorsque les cellules sont cultivées dans deux cultures dimensions (2D) en monocouche. Au cours des dernières années, en trois dimensions (3D) de la culture sur une membrane basale reconstituée a émergé comme une méthode de choix pour récapituler l&#39;architecture tissulaire de cellules bénignes et malignes du sein. Les cellules cultivées en 3D conservent les signaux importants de la matrice extracellulaire et fournissent un système ex vivo 2,3 physiologiquement pertinent. Fait à noter, il existe des preuves de plus en plus ce qui suggère que les cellules se comportent différemment lorsqu&#39;ils sont cultivés en 3D par rapport à la 2D 4. Culture 3Dpeut être efficacement utilisé comme un moyen pour différencier le phénotype malin du phénotype bénigne du sein et de la signalisation cellulaire qui sous-tend moléculaire impliqué et 3. L&#39;une des caractéristiques distinctives des cellules épithéliales bénignes, c&#39;est qu&#39;ils sont polarisés de telle sorte que le cytoplasme apical est vers le lumen et le cytoplasme basal repose sur la membrane basale. Cette polarité apico-basale est perdue dans les carcinomes du sein invasifs, qui sont caractérisées par une désorganisation cellulaire et la formation de l&#39;anastomose et de ramification tubules qui s&#39;infiltre au hasard le stroma environnant. Ces différences histopathologiques entre glande bénigne et le carcinome invasif peuvent être reproduits en 3D 6,7. Utilisation des lecture-out appropriées comme la quantification de simples structures acineuses rondes, ou l&#39;expression différentielle des marqueurs moléculaires validées pour la prolifération cellulaire, la polarité et l&#39;apoptose en combinaison avec d&#39;autres techniques de biologie moléculaire et cellulaire, cultur 3De peut fournir un outil important pour mieux comprendre les changements cellulaires au cours de la transformation maligne et de la délimitation de la signalisation responsable.

Culture 3D peut être efficacement utilisé pour différencier le phénotype malin des cellules épithéliales mammaires humaines du sein bénigne. Cellules bénignes simples plaqués sur Matrigel poussent comme des structures sphériques organisés qui peuvent facilement être imagés comme unique acini plat rond dans un plan en utilisant l&#39;imagerie de contraste de phase. Les cellules malignes simples plaqués sur Matrigel poussent au hasard, montrent très haut indice de réfraction et sont difficiles à l&#39;ima...

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Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Trois culture tridimensionnelle de cellules épithéliales mammaires sur une membrane basale reconstituée est un procédé utile de rappeler l&#39;architecture in vivo du sein bénigne, et pour différencier le phénotype malin du phénotype bénignes du sein. Surtout, ce système peut être appliqué pour étudier les carcinomes invasifs dans d&#39;autres tissus.

Trois Cultures dimensionnelles: un outil pour étudier l&#39;architecture normale Acinaire vs transformation maligne des cellules mammaires

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.8K vues.  University of Michigan Comprehensive Cancer Center.  Trois culture tridimensionnelle de cellules épithéliales mammaires sur une membrane basale reconstituée est un procédé utile de rappeler l'architecture in vivo du sein bénigne, et pour différencier le phénotype malin du phénotype bénignes du sein. Surtout, ce système peut être appliqué pour étudier les carcinomes invasifs dans d'autres tissus. 

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Recherche

Médecine

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

A Tissue Culture Modèle tridimensionnel pour étudier primaire moelle osseuse humaine et de ses affections malignes

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantification du cancer du sein cellulaire envahissement aide d&#39;un (3D) du modèle en trois dimensions

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Utilisant le virus adéno-associé comme un outil pour étudier les obstacles dans la maladie de la rétine

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

L&#39;utilisation de l&#39;essai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensionnelle Alginate-perle culture de cellules humaines adénome hypophysaire

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Utilisation de Saccadometry avec la stimulation cérébrale profonde pour l&#39;étude normale et pathologique fonction cérébrale

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based three-chamber bags (3CBs) and soybean-oil-based compounded bags (CoBs) in hospitalized adult patients. We designed a multicenter, randomized, prospective, open-label, noninferiority protocol to compare the efficacy, safety, and distribution of olive-oil-based 3CBs and soybean-oil-based CoB formulations in adult Chinese patients requiring PN during surgical intervention. Subjects were randomized to receive either one of the study treatments using an interactive voice or web-based recognition system in accordance with the randomization code. Randomization was further stratified based on the study site and surgical category. Both treatment groups received similar amounts of calories and protein. In addition, the two study treatments contained a similar composition of the amino-acid component. The only difference between the two PN formulations was the lipid constitution. The duration of administration of study treatments was a minimum of 5 days up to a maximum of 14 days after the surgical procedure. The primary efficacy endpoint was serum prealbumin levels on day 5 of the study. Noninferiority was proved if the anti-log of the lower bound of the 95% confidence interval (CI) of the treatment difference was at least 0.80. Other efficacy measures included treatment preparation time; duration to achieve tolerability of oral nutrition; associated infectious complications; length of hospitalization; and laboratory assessment of markers of nutrition, inflammation, metabolism, and oxidative stress. A total of 458 patients were enrolled in the study. The results showed that olive-oil-based 3CBs were non-inferior to soybean-based CoBs, besides being well tolerated. The infection rate was found to be significantly lower in the olive-oil-based 3CB group. Thus, this study may be used as a reference for future research on lipid emulsion and 3CBs.

Here, we present a protocol for a study comparing the efficacy, safety, and delivery of olive-oil-based 3CB and soybean-oil-based CoB formulations in adults requiring parenteral nutrition. The results revealed that olive-oil-based 3CBs is non-inferior and well tolerated compared to soybean formulations.