Ce travail a été financé par des subventions des Instituts nationaux de la santé, Institut national du cancer (1R21CA141039), BD Biosciences Subvention de recherche, la subvention de la Société américaine du cancer recherche institutionnelle (IRG # 58-006-53), au Centre de l&#39;Université de Purdue pour le cancer recherche, et les Instituts du programme Initiatives de recherche Alberta Cancer Board de recherche en santé du Canada. MP a été soutenu par le National Institutes of Health, National Cancer Institute, Programme de stages de prévention du cancer (R25CA128770; PI: D. Teegarden) administré par le Centre des sciences oncologique et le Centre de recherche Discovery Learning à l&#39;Université Purdue.

Une. Préparation à l&#39;avance <ol><li> Gardez pipettes sérologiques stériles et embouts de pipette à 4 ° C. Dépannage: gels Matrigel à température ambiante (RT); l&#39;aide de pipettes froid et conseils vous empêcher Matrigel de gélification lors de la configuration de la culture. </li><li> Décongeler une bouteille de Matrigel à 4 ° C pendant la nuit. </li></ol> 2. Préparation des réactifs <ol><li> Préparation de la solution de fibronectine stock: Faire un / ml solution de fibronectine de stock 1 mg par dissolution de 100 mg fibronectine humaine dans 100 ml d&#39;eau distillée. Une fois la fibronectine a dissous, filtre stérile, aliquote, et conserver à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 6 mois. Dépannage: Si la fibronectine ne se dissout pas rapidement incuber la solution pendant quelques minutes dans un jeu de bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Préparation de 10x PBS: Dissoudre 80 g de chlorure de sodium NaCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2 g de KCl et 2,4 g de KH 2 PO <sub&gt; 4 dans 1 litre d&#39;eau distillée. Réglez le pH à 7,4, filtre stérile, et stocker à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 6 mois. </li><li> Préparation du tampon de neutralisation 20: Préparer une solution contenant 100 mM de HEPES à 2x tampon phosphate salin (PBS) en utilisant 1 M HEPES et 10x PBS solutions mères. Ajuster le pH de la solution à 7,0. Stocker à 4 ° C pendant 2-3 mois. </li><li> Préparation de la solution 2 mg / ml de queue de rat de collagène de type I: Faire une solution à 2 mg / ml de collagène I dans le tampon de neutralisation (étape 2.3). Vortex la solution à basse vitesse et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Comme ce collagène est très visqueux, d&#39;éviter la génération de bulles d&#39;air lors du pipetage. Il est recommandé de préparer la solution de collagène I frais à chaque fois. Conserver la solution sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparation de revêtement endo-osseux (REND): Mélanger 1 mg / stock fibronectine ml avec 2 mg / ml de collagène I actions (étapes 2.1 et 2.4) à une concentration finale de 77 pg / ml et 29 pg / ml, respectivement, en 1x et# 160; PBS stérile. Mélanger et conserver à 4 ° C pendant 1 mois. </li><li> Préparation de reconstruit la matrice osseuse (RBM): <ol><li> Prérefroidir 1,5 ml microtubes sur la glace. Gardez toutes les solutions de la matrice sur la glace en tout temps. </li><li> Mélanger 4 parties Matrigel (concentration Matrigel varie de lot à lot, mais les variations ont été jugés négligeables), 2,5 parties de 1 mg / ml de fibronectine et une partie de 2 mg / ml de collagène I sur la glace d&#39;abord pipetage Matrigel en le tube à l&#39;aide des embouts de pipette froid puis ajouter la fibronectine et le collagène I. Matrigel va commencer solidification à des températures supérieures à 4 ° C, afin de travailler rapidement lors du pipetage du Matrigel. Mélanger la matrice très doucement par pipetage de haut en bas, d&#39;éviter d&#39;introduire des bulles. Gardez les tubes sur la glace tout en mélangeant le FrP. </li></ol></li><li> Préparation du milieu de croissance de la moelle osseuse (BMGM): Ajoutez 500 ml d&#39;BMGM contenant 6,2 x 10 ~ 4 M de CaCl2, 10 -6 M de succinate de sodium, 10 -6 M d&#39;hydrocortisone, 20% de plasma humain (normale ou maligne provenant de donneurs sains ou de patients), et 1% de pénicilline / streptomycine dans un milieu RPMI-1640. CaCl 2, le succinate de sodium, et des suppléments d&#39;hydrocortisone peuvent être conservés à -80 ° C pendant&gt; 6 mois à 1 000 x solutions mères. Lors de la croissance de lignées cellulaires, du sérum bovin fœtal (FBS) peut être remplacé par du plasma humain. </li><li> Préparation de 10% du formol tamponné neutre (FBN): Ajouter la solution de formaldéhyde des stocks de 37% à 1x PBS à 10% v / v Bien mélanger et stocker à température ambiante pendant 2-3 semaines abri de la lumière. </li><li> Préparation de 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA): Peser quantité appropriée de BSA et le dissoudre dans du PBS 1x. Conserver à 4 ° C et utiliser dans 1 semaine. Solution de BSA a tendance à être contaminé s&#39;il est conservé au réfrigérateur pendant de longues périodes. En variante, la solution de BSA peut être réparti en portions aliquotes et congelé à -20 ° C pour une conservation à long terme. Éviter les cycles de gel-dégel. </li><li> Préparation de la solution de récupération de cellule (CRS): Assurez-EDTA 5 mM, vanadate de sodium à 1 mM (Na &lt;sub&gt; 3 VO 4) et 1,5 mM de fluorure de sodium (NaF), solution dans du PBS 1x. Filtre stérile et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à 6 mois. </li></ol> 3. Embarqué 3-D de la culture de cellules BM humain non malignes et malignes <ol><li> Purifier les cellules mononucléaires BM primaires par Ficoll-Plaque gradient centrifugation selon les instructions du fabricant. Étape facultative: les cellules peuvent être étiquetés avec 0,25 uM diacétate de carboxyfluorescéine, succinimidylester (CFSE) selon les instructions du fabricant pour suivre la prolifération des cellules tout au long de la période de culture. Dépannage: Si les cellules meurent après coloration CFSE, titrer la quantité de CFSE que la concentration dépend du type de cellule; 0,25 uM fonctionne bien pour les cellules mononucléaires BM primaires. </li><li> Ajouter 65 ul de solution déchirent dans chaque puits d&#39;une culture de tissus traités plaque de 48 puits. Étendre la solution uniformément pour recouvrir toute la surface du puits et incuber pendant&gt; 30min à température ambiante. </li><li> Préparer la suspension de cellules à une densité de 0,5 x 10 6 cellules dans 10 ul de 1 x PBS par puits d&#39;une plaque à 48 puits. Dans un tube de centrifugation de 1,5 ml de mélange de la suspension de cellules avec 100 pi de matrice FrP par puits. Mélanger les cellules et la matrice FrP par pipetage de haut en bas; éviter d&#39;introduire des bulles. Maintenir le mélange cellule / matrice sur de la glace pour éviter la gélification de la matrice. Remarque: le système FrP est entièrement modulable, de mettre en place le système dans un format non 48 puits, ajuster les quantités de tous les réactifs (matrices et moyennes) sur la base de la surface de la plaque utilisée. À l&#39;échelle le nombre de cellules devant être plaqué en conséquence. </li><li> Aspirer le déchirent restant et ajouter le mélange cellules / matrice dans le centre d&#39;un puits. Rapidement, étaler le mélange cellules / matrice pour couvrir toute la surface du puits de façon uniforme. Placer la plaque pendant 30-60 min à 37 ° C, 5% CO 2 incubateur de culture tissulaire pour permettre à la matrice de se solidifier. Ne pas secouer ou disTurb la plaque pendant l&#39;incubation. Dépannage: Pour empêcher la distribution inégale des cellules dans FrP, bien mélanger avant le plaquage. Mélanger après chaque 5 ème bien plaqué les cellules pour éviter la décantation au fond du tube. Une fois plaqué, les cellules ne tombent pas au fond du puits du fait de la tension de surface dans la matrice. Dépannage: Pour empêcher la distribution inégale des cellules dans FrP, bien mélanger avant le plaquage. Mélanger après chaque 5 ème bien plaqué les cellules pour éviter la décantation au fond du tube. Une fois plaqué, les cellules ne tombent pas au fond du puits du fait de la tension de surface dans la matrice. </li><li> Préchauffer BMGM dans un bain-marie réglé à 37 ° C. </li><li> Après 30 minutes, vérifiez que la matrice a mis correctement, il va former un gel mou comme couche qui ne bouge pas lorsque la plaque est incliné. Superposer la couche cellulaire / matrice avec 1 ml de chaud BMGM. Pour éviter tout doucement la déchirure de la pipette la matrice de support (distribution goutte-à-goutte) à l&#39;aideune pipette sérologique. Placer la culture FrP assemblées en un 37 ° C, 5% CO 2 incubateur de culture tissulaire et la culture pendant la période de temps souhaitée. Remarque: la viabilité des cellules est maintenue pendant au moins 30 jours sans changer moyen, si le changement moyen est nécessaire de changer seulement 50% de milieu à chaque fois. Étape critique: Il est essentiel que le milieu ne fait pas froid que la température froide peut perturber la matrice déjà mis. Prenez soin de ne pas injecter le milieu sur le dessus de la matrice au risque de rupture de la couche de matrice molle. Dépannage: Si la viabilité des cellules dans le système FrP est faible, la densité cellulaire peut avoir à déterminer expérimentalement lorsque l&#39;on travaille avec des cellules autres que les cellules mononucléaires primaires de ponctions BM. Lorsque l&#39;on travaille avec des lignées cellulaires, de diminuer le nombre de cellules de 10 fois, que des lignées cellulaires immortalisées prolifèrent plus rapidement que les cellules primaires. </li></ol> 4. Imaging &quot;En-matrice» <ol><li><strong&gt; La microscopie optique <ol><li> L&#39;image des cellules cultivées directement dans FrP utilisant fond clair, contraste d&#39;interférence différentiel (DIC), confocale ou d&#39;autres techniques d&#39;imagerie qui permettent l&#39;imagerie à longue distance que la matrice est d&#39;environ 1 mm d&#39;épaisseur. Utilisez la fonction Z-stack disponible sur la plupart des microscopes à l&#39;image toute la culture de haut en bas. </li></ol></li><li> Immunofluorescence Astuce: Pour le protocole d &#39;immuno-dessous éviter l&#39;aspiration des solutions coloration / lavage, au lieu incliner la plaque et enlever solutions aide d&#39;une pipette. <ol><li> Retirez le BMGM en utilisant une pipette et laver 2-3x avec 100 pl / lavage / puits de PBS 1x RT. Assurez-vous que suffisamment de PBS est utilisé pour couvrir toute la surface du puits. </li><li> Fixer les cellules de la matrice en ajoutant 100 pl / puits (pour une plaque à 48 puits) de 10% NBF pour 15 min à température ambiante. Retirer FBN et laver les cellules deux fois avec 100 pl / lavage / puits de PBS 1x RT. Remarque: Évitez d&#39;utiliser FBN froid comme il peut liquéfier la matrice. </li><li> Retirer du PBS, ajouter 1% de BSA pendant 1 heure à température ambiante ou à 4 ° C pendant une nuit afin de bloquer la liaison non spécifique d&#39;anticorps. </li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps primaire dans 1% de BSA à la dilution nécessaire. Dilution variera pour chaque anticorps, vérifiez auprès du fabricant ou titrer pour déterminer la concentration d&#39;anticorps optimal. Ajouter 100 ul / puits de solution d&#39;anticorps primaire et incuber selon les instructions du fabricant. Étape cruciale: Toutes les incubations impliquant des anticorps conjugués à des fluorophores ou des colorants fluorescents doivent être effectuées dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps primaire et laver 3 fois avec PBS 1x pendant 5 min. </li><li> Pour la coloration par immunofluorescence indirecte, l&#39;incubation avec un anticorps secondaire conjugué à la sonde fluorescente pendant 1 h à RT. Diluer les anticorps dans 1% de BSA à une concentration suggéré par le fabricant. </li><li> Retirez le secondairesolution ntibody et laver 3 fois avec PBS 1x pendant 5 min. Dépannage: Pour éviter un bruit de fond lors de l&#39;imagerie, titrer les anticorps secondaires conjugués à fluorescence et utiliser la plus faible concentration que fournit le signal adéquat. Si un bruit de fond est toujours un problème, augmenter le nombre et la durée des étapes de lavage, ou utiliser des anticorps primaires directement conjugués, et passer à l&#39;étape 4.2.6. </li><li> Pour colorer les noyaux ajouter 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) solution de coloration nucléaire, à la dilution suggéré par le fabricant, et incuber pendant 7-10 min à température ambiante. </li><li> Retirer la solution de coloration nucléaire et laver 2 fois avec PBS 1x pendant 5 min. </li><li> Retirez le PBS à partir du dernier lavage et ajouter une goutte de milieu de montage (série régulière), sur l&#39;échantillon de préserver fluorescence. L&#39;image en utilisant les paramètres d&#39;excitation / émission appropriées sur un microscope à fluorescence ou confocal. Remarque: L&#39;imagerie doit être fait dans les 2 jours de colorationpour éviter la dégradation de la matrice et la perte de l&#39;intégrité GR et une perte de signal fluorescent. Si ce n&#39;est pas imagée immédiatement, les échantillons colorés doivent être conservés à 4 ° C, à l&#39;abri de la lumière, jusqu&#39;à ce que l&#39;imagerie. </li></ol></li></ol> 5. Isolement de cellules à partir de FrP <ol><li> Retirez délicatement milieu sans déranger la couche de matrice. Ne pas aspirer. </li><li> Laver les cellules avec 2x stérile 1x PBS. Ne pas aspirer. </li><li> Ajouter 0,5 ml de CRS glacées à chaque puits et enlever la couche de matrice entière avec les cellules, par pipetage vigoureusement de haut en bas. Recueillir les cellules, la matrice, et CRS dans un tube de 1,5 ml. Placez sur la glace. </li><li> Ajouter un supplément de 0,5 ml CRS le même puits et de recueillir tous les documents restants. Transfert à la même microtube. </li><li> Vortex le mélange de cellules, la matrice et du SRC et incuber sur de la glace pendant 1 heure. cellules Vortex toutes les 15 min pour faciliter la libération de la matrice. </li><li> Vérifier le mélange après 1 h, sans grumeaux visiblesde la matrice doit être présent. Dépannage: si touffes de matrice sont encore visibles après 1 h, les cellules de transfert / matrice / mélange CRS à un tube plus grand, ajouter plus de 2-5 ml de CRS, et incuber pendant un 30-60 min supplémentaire. </li><li> Centrifuger les cellules dans CRS à 1000 rpm pendant 5-10 min à 4 ° C. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS froid 1x. </li><li> Centrifuger à 1000 rpm pendant 5-10 min et éliminer le surnageant. Répétez le lavage PBS une fois de plus. </li><li> Le second lavage PBS achève la récupération des cellules de matrice et des cellules isolées peut être utilisé pour toutes les applications en aval telles que l&#39;isolement d&#39;ADN / ARN / protéine, la cytométrie en flux, la transplantation in vivo, etc. </li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêts.

Le modèle FrP fournit un système complet où la composition cellulaire de la BM est maintenue ex vivo pendant 30 jours. BM cellules cultivées dans FrP auto-stratifier selon leur fonction imitant de près l&#39;architecture BM trouvé in vivo. En outre, il s&#39;agit du premier système qui permet l&#39;expansion de l&#39;myélome multiple clone 8. Les étapes les plus critiques pour assurer la croissance robuste des cellules BM et le succès global de la culture sont les suivantes: 1) pou...

La culture de tissus a été développé pour étudier le comportement des cellules dans un environnement contrôlé pour minimiser la variabilité systémique lorsque l&#39;on compare différents processus dans les organismes intacts. Cette méthode a été créé dans le début des années 1900 et 1,2 réfère à une technique où explants de tissus ont été cultivées ex vivo dans un plat en verre. Au milieu des années 1900 le système a été adapté pour cultiver des cellules dispersées plutôt que des fragments de tissus intacts, et de la culture de tissus »et de« culture cellulaire »est devenu synonyme de 3. Dans de tels systèmes de culture de cellules classiques cellules sont cultivées sur la surface de la matière plastique de culture de tissu recouvert avec un milieu de croissance supplémenté avec divers facteurs de croissance. Deux types de cultures sont apparues sur la base de la capacité d&#39;adhérence de cellules différentes: la culture de cellules adhérentes, dans laquelle les cellules se fixent et se répandent sur le plastique de culture de tissus et les cultures non adhérentes, où les cellules sont propagées en suspension. Depuis les premiers jours de celluleculture, plusieurs lignées de cellules immortelles ont été créées, telles que les cellules HeLa 4, la première ligne de cellules de cancer humain. Ces lignées cellulaires sont capables de proliférer indéfiniment en culture cellulaire, et la plupart ne nécessitent pas de traitement spécial pour maintenir la viabilité. L&#39;approche réductionniste des méthodes de culture de cellules d&#39;origine a été conçu pour simplifier le système autant que possible en incluant uniquement les composants minimum requis pour maintenir la viabilité et la prolifération cellulaire. Cependant, les approches de culture de cellules ne parviennent pas à soutenir simplifiées ex vivo la plupart des types de cellules humaines primaires avec durée de vie finie. Par conséquent, de nouveaux systèmes de culture sont conçus pour se rapprocher autant que possible le microenvironnement tissulaire, permettant ainsi explants cellulaires de se développer dans des conditions physiologiques. Contrairement aux approches traditionnelles réductrices / de culture cellulaire, en 3 dimensions (3-D) des systèmes de culture sont en train de devenir une méthode privilégiée pour la culture efficacement diversdes lignées cellulaires humaines et des cellules primaires d&#39;étudier les mécanismes impliqués dans la suite, la santé et la maladie, dans le contexte d&#39;un micro-environnement favorable. Ces systèmes 3-D sont généralement mis en place en utilisant des matrices et / ou reconstruits milieu supplémenté avec des facteurs de croissance, afin de récapituler le microenvironnement tissulaire pour étudier les types d&#39;intérêt cellulaires. Le premier de ces trois dimensions (3-D) des modèles de culture a été développé pour étudier le développement de la glande mammaire. À fournir des cellules avec des conditions natives des cellules épithéliales mammaires ont été incorporés dans le Matrigel, le collagène IV et la source de la matrice extracellulaire (ECM), de la laminine-riche, et recouvert avec un milieu de croissance. Dans ces conditions, les cellules épithéliales mammaires formés grappes ressemblant acini mammaire, et lors d&#39;une stimulation avec des hormones lactogènes, ces acini sécrétées caséine et d&#39;autres protéines du lait, en l&#39;lumena creux des structures d&#39;acini-like. Caséine sécrétion n&#39;a pas été observée dans les cultures classiques, même après plus de prolactine 5, Mettant l&#39;accent sur le rôle des micro-en préservant les caractéristiques morphologiques et phénotypiques des cellules. Une autre démonstration de la perte de la fonction cellulaire normale lorsque les cellules sont retirées du cadre de leur micro-environnement physiologique est une démonstration que sans micro-environnement favorable, les kératinocytes ne parviennent pas à former épiderme stratifié 6. Un certain nombre d&#39;autres modèles 3-D ont été créés pour permettre aux ex vivo propagation de cellules primaires 7,8. Le rôle crucial des micro-environnement dans le comportement des cellules a été élégamment démontrée dans une étude où les cellules épithéliales mammaires formés &quot;inside-out&quot; acini lorsqu&#39;elles sont cultivées dans du collagène I matriciel, par rapport à la acini correctement polarisé qui ont été formés dans le Matrigel. Cette perte de la morphologie correcte s&#39;est inversée lorsque les cellules myoépithéliales laminine productrices ont été ajoutés aux cultures de collagène I 9. En outre, microenvironnement correct est nécessaire pour la précisiongénotype manifestation. Cultivées dans un plat, des cellules de cancer du sein MCF7 transfectées avec une cellule-cellule molécule d&#39;adhésion CEACAM1 se comportent exactement les mêmes que les cellules négatives de CEACAM non transfectées. Toutefois, lorsqu&#39;elles sont cultivées en Matrigel, en contact avec ECM structures ressemblant à des tumeurs, de forme de type sauvage MCF7 tandis que les cellules MCF7 transfectées avec CEACAM1 reviennent à un phénotype et forme acini normale avec lumena creux, comme cela a été établi avec l&#39;épithélium mammaire bénigne 10. De même, le blocage de l&#39;intégrine β1-dans les cellules cancéreuses du sein ne modifie pas leur comportement dans des conditions de culture standard, mais la même expérience réalisée dans des cultures en 3-D montre que le blocage de l&#39;intégrine β1-revient des cellules malignes à un phénotype normal 11. Par conséquent, les micro-environnement tissulaire n&#39;est pas seulement nécessaire pour maintenir la viabilité des cellules, mais également de conserver un fonctionnement correct des cellules. En plus de fournir un système dans lequel le comportement des cellules peut être étudiée dans des conditions physiologiquess, cultures 3-D fonctionner comme moyen robuste et fiable pour les essais précliniques de nouveaux traitements 8,12,13. La culture de cellules en 3-D permet le criblage de composés expérimentaux dans les conditions de l&#39;environnement médiation pharmacorésistance 14, où la contribution de la cellule-cellule et cellule-ECM adhésion pourrait être évaluée. En outre, la toxicité hors cible de nouveaux composés peut être déterminée par incorporation de multiples compartiments cellulaires de différents tissus. Ces écrans peuvent être effectuées plus rapidement et sont plus rentables que les études comparables in vivo 8. Nous présentons ici une configuration d&#39;un modèle 3-D de reconstitution de la moelle osseuse (RBM) où les cellules normales et malignes de la moelle osseuse (BM) prolifèrent ex vivo dans un système imitant de près le microenvironnement de la BM humaine. Les précédentes tentatives de culture de cellules primaires humaines BM dans les cultures 2-D, liquide ou co-cultures adhérentes avec diverses composantes de la BM stromaOu 3-D, des cultures d&#39;agar semi-solides ont rencontré un succès limité en raison de leur incapacité à fournir les cellules avec les composants du micro-environnement tissulaire de 15 à 18. Dans ces systèmes, les cellules BM primaires avaient une mauvaise viabilité et n&#39;ont pas réussi à proliférer ex vivo. Un autre système dans lequel les cellules progénitrices BM humaines sont cultivées dans les co-cultures avec des sphéroïdes cellules stromales BM est un système 3-D, où la viabilité des cellules souches hématopoïétiques et la prolifération a été maintenue pendant au moins 96 h 19. Cependant, bien que très bénéfique pour la compréhension de la biologie progéniteur hématopoïétique, ce système ne récapituler pas fidèlement le micro-environnement de la BM en raison de l&#39;absence de composants de la MEC, par conséquent, ce qui limite son utilité. Le modèle décrit ici FrP présente un système complet où les deux compartiments cellulaires et extracellulaires de la BM humaine sont reconstruits in vitro. Nous montrons que les cultures RBM peut soutenir la croissance ex vivo de cellules BM humains normaux, comme nousll que les cellules isolées de patients atteints de divers troubles hématologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen/Life technologies</td>
			<td style="width:108px;">C34554</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NG1884448</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Matrigel basement membrane matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:328px;">Rat tail collagen type I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:203px;">Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4648</td>
			<td style="width:203px;">For TRAP staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">SigmaFast BCIP/NBT tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5655</td>
			<td style="width:203px;">For alkaline phosphatase staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss confocal LSM 510 microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Zeiss 510 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss Axiovert 200M inverted microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">MetaMorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for Axiovert 200M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">FACSort flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">CellQuest Pro software&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Software for the analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies

La culture de tissus a été un outil précieux pour étudier de nombreux aspects de la fonction de la cellule, du développement normal de la maladie. Les méthodes de culture cellulaire classiques reposent sur la capacité des cellules, soit à attacher à un substrat solide d&#39;une boîte de culture tissulaire ou de croître en suspension dans un milieu liquide. Des lignées de cellules immortelles multiples ont été créées et cultivées à l&#39;aide de telles approches, cependant, ces méthodes ne parviennent souvent lorsque des cellules primaires besoin d&#39;être cultivées ex vivo. Un tel échec a été attribué à l&#39;absence de composants de la matrice extracellulaire appropriées du micro-environnement tissulaire à partir des systèmes classiques où la culture de tissu en plastique est utilisé en tant que surface pour la croissance cellulaire. La matrice extracellulaire est un composant intégral de la micro-environnement tissulaire et sa présence est indispensable pour le maintien des fonctions physiologiques telles que la polarisation des cellules, la survie et la prolifération. Nous présentons ici une méthode de culture des tissus en 3 dimensions où cel os primaire de la moellels sont cultivées dans une matrice extracellulaire formulé pour récapituler le microenvironnement de la moelle humaine (système RBM). Incorporé dans la matrice extracellulaire, les cellules sont alimentées en nutriments à travers le milieu supplémenté avec du plasma humain, fournissant ainsi un système complet où la survie et la prolifération cellulaires peuvent être maintenues pendant jusqu&#39;à 30 jours, tout en maintenant la composition cellulaire du tissu primaire. En utilisant le système FrP nous avons développé avec succès des cellules de moelle osseuse provenant de donneurs normaux primaires et les patients atteints d&#39;amylose, et diverses hémopathies malignes. Le système permet FrP directe pour la visualisation en temps réel, dans la matrice du comportement cellulaire et évaluation de l&#39;efficacité préclinique de nouveaux agents thérapeutiques. De plus, les cellules peuvent être isolées à partir de la GR et ensuite utilisés pour la transplantation in vivo, le tri cellulaire, cytométrie de flux, et de l&#39;acide nucléique et l&#39;analyse des protéines. Pris dans leur ensemble, le procédé FrP fournit un système fiable pour la croissance de l&#39;os primaire Marrow cellules dans des conditions physiologiques.

Comme les cellules de moelle osseuse primaires sont incapables de proliférer dans des conditions de culture tissulaire standard, le système RBM a été créé pour imiter étroitement le microenvironnement osseux, en fournissant un système de culture de cellules et d&#39;élargir BM ex vivo. Les principaux composants de la matrice extracellulaire BM, la fibronectine, collagène de type I, le collagène IV, la laminine et 21, ont été incorporés dans la matrice FrP de fournir l&#39;échafaudage s...

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A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Dans les procédés de culture standards cellules sont retirées de leur environnement physiologique et cultivées sur la surface en plastique d&#39;un plat. Pour étudier le comportement de cellules primaires de moelle osseuse humaine, nous avons créé un système de culture en 3-D, où les cellules sont cultivées dans des conditions récapitulant le microenvironnement du tissu natif.

A Tissue Culture Modèle tridimensionnel pour étudier primaire moelle osseuse humaine et de ses affections malignes

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K vues.  Purdue University.  Dans les procédés de culture standards cellules sont retirées de leur environnement physiologique et cultivées sur la surface en plastique d'un plat. Pour étudier le comportement de cellules primaires de moelle osseuse humaine, nous avons créé un système de culture en 3-D, où les cellules sont cultivées dans des conditions récapitulant le microenvironnement du tissu natif. 

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Recherche

Médecine

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Culture primaire de l&#39;homme vestibulaire schwannomes

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Trois Cultures dimensionnelles: un outil pour étudier l&#39;architecture normale Acinaire vs transformation maligne des cellules mammaires

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantification du cancer du sein cellulaire envahissement aide d&#39;un (3D) du modèle en trois dimensions

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Fémorale aspiration de moelle osseuse chez des souris en direct

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

En trois dimensions modèle de co-culture tumeur stromale-Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensionnelle Alginate-perle culture de cellules humaines adénome hypophysaire

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Three-Dimensional Culture Assay pour explorer des cellules cancéreuses invasives et Tumor Satellite Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...