Nous sommes reconnaissants au Dr Stephen Robinson et Mme Hania Czerwinska (Monash University) pour l&#39;offre généreuse de cultures d&#39;astrocytes.

1. Déterminer ascorbate intracellulaire dans les cellules cultivées <ol><li> culture cellulaire et la récolte <ol><li> Cultivez suspension (par exemple érythroleucémique humaine, K562) ou des cellules adhérentes (par exemple, les astrocytes primaires) en utilisant des procédures standard de culture 19-21,32,38. Remarque: pour assurer cellules contiennent ascorbate, charger les cellules en culture avec de l&#39;ascorbate soit comme l&#39;ascorbate ou DHA 33,39. </li></ol></li><li> Créez un extrait cellulaire contenant de l&#39;ascorbate- <ol><li> Incuber un nombre approprié de tampon phosphate salin de suspension (PBS) à la chaux ou de cellules adhérentes avec 450 pi de glacée cellulaire perméabilisation tampon [CPB; 0,1% (p / v) de saponine dans du PBS; 4 ° C]. Remarque: Déterminer le nombre de cellules nécessaires pour obtenir une valeur d&#39;absorbance dans la plage linéaire du dosage (voir ci-dessous) de façon empirique par l&#39;utilisateur final. Remarque: les extraits de tissus peuvent également être utilisés (voir discussion pour plus de détails). </li><li> Agitacellules te sur la glace pendant 10 minutes pour assurer la lyse cellulaire complète. </li><li> Créer un extrait intracellulaire contenant de l&#39;ascorbate-clarifiée par élimination des débris cellulaires par centrifugation du lysat brut à 16 000 xg pendant 5 min dans une microcentrifugeuse réfrigérée (4 ° C). </li><li> Retirez délicatement 4 x 100 aliquotes de chaque échantillon et ajouter à une séquence horizontale de puits dans une plaque 96 puits à fond plat qui contient soit 25 pl / puits de PBS (&quot;-AO&quot;) uniquement ou 25 pl / puits de 45,5 U / ml solution mère de L-ascorbate-oxydase (AO) dans du PBS (&quot;+ AO&quot;). Remarque: cela devrait être fait en parallèle avec la préparation des normes (voir ci-dessous). </li></ol></li><li> Ascorbate standard courbe construction (doit être construit à nouveau pour chaque essai) <ol><li> Préparer une solution stock de 10 mM d&#39;acide ascorbique dans PBS glacé. Remarque: Vérifier la concentration d&#39;ascorbate par spectrophotométrie en utilisant une cuvette de quartz avec un 1cm de longueur de chemin à 265 nm (coefficient d&#39;extinction = 14,5 mM -1 cm -1) 40. </li><li> Préparer avec soin une série de normes d&#39;ascorbate entre 0 et 20 uM. </li><li> En parallèle à l&#39;étape 1.2.4, retirez soigneusement 4 × aliquotes 100 ul de chaque norme et ajouter à une séquence horizontale de puits dans une plaque 96 puits à fond plat qui contient 25 pl / puits de PBS (&quot;-AO») ou une 45,5 U / ml de solution de AO dans du PBS (&quot;+ AO&quot;). Note: 100 pi des normes d&#39;ascorbate ci-dessus contiennent 0-2 nmol d&#39;ascorbate. S&#39;il vous plaît noter que le but de l&#39;AO est de contrôler la contribution de réducteurs non-ascorbate de ferricyanure réduction. </li></ol></li><li> Déterminer ascorbate intracellulaire - Étape 1: éliminer sélectivement l&#39;ascorbate et quantitativement oxyder ascorbate de ferricyanure <ol><li> Orbitale mélanger la plaque de 96 puits à 550 rpm à température ambiante pendant 5 min dans l&#39;obscurité en recouvrant la plaque en aluminium. Remarque: Tson étape devrait oxyder tout ascorbate dans les puits &quot;+ AO&quot; à DHA. Les puits &quot;-AO&quot; devraient être affectés. </li><li> Ajouter 50 ul de 3,5 mM de ferricyanure de potassium (ci-après dénommé &quot;le ferricyanure») dans du PBS à chaque puits. La finale [ferricyanure] = 1 mM. Remarque: Utilisez un multipipettor. </li><li> Orbitale mélanger la plaque à 550 rpm à température ambiante pendant 5 min dans l&#39;obscurité. Remarque: Cette étape doit conduire à la réduction de ferricyanure en ferrocyanure par l&#39;ascorbate dans un rapport stoechiométrique de deux molécules de ferricyanure réduits par une molécule d&#39;ascorbate oxydé. </li><li> Ajouter immédiatement 25 pi d&#39;une solution fraîchement construit contenant 50% (v / v) d&#39;acide acétique et 30% (p / v) d&#39;acide trichloroacétique (TCA). Remarque: Utilisez un multipipettor. </li></ol></li><li> Déterminer ascorbate intracellulaire - Etape 2: quantifier la quantité de ferrocyanure formé 37 <ol><li> Ajouter 100 ul de solution de ferrocyanure 37 détermination de each bien. Note: Une solution de travail doit être faite immédiatement avant utilisation: 2 ml de 3 M d&#39;acétate de sodium (pH 6,0); 0,5 ml d&#39;acide acétique glacial (~ 17,4 M d&#39;acide acétique); 2 ml de 0,2 M d&#39;acide citrique; 2 ml de 3,3 mM FeCl 3 à 0,1 M d&#39;acide acétique; 1 ml de 30 mM Ferene-S. Le volume final de cette solution de travail doit être de 7,5 ml. </li><li> Orbitale mélanger la plaque dans l&#39;obscurité à 550 tours par minute pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Lire les valeurs d&#39;absorbance des puits à 593 nm (c&#39;est à dire le maximum d&#39;absorbance du Fe (II) (Ferene-S) 3 complexe). </li><li> Calculez le montant de l&#39;ascorbate intracellulaire nmoles ascorbate par million de cellules en soustrayant d&#39;abord les A 593 valeurs nm pour les puits de la &#39;+ AO&#39; des correspondants - puits &quot;AO&quot; pour chaque échantillon, puis l&#39;interpolation de la courbe standard de l&#39;ascorbate (voir l&#39;étape 1.3 ). Lors de la construction de la courbe standard, tracer cette «valeur de la différence» pour chaque norme sur le montant des ascorbmangé par puits. </li></ol></li></ol> 2. Détermination de l&#39;ascorbate-efflux de cellules en culture <ol><li> culture cellulaire et la récolte <ol><li> Cultivez suspension ou de cellules adhérentes comme ci-dessus (voir l&#39;étape 1.1). Remarque: effectuer le dosage ci-dessous dans un format plat de 24 puits avec la suspension et les cellules adhérentes pour obtenir les meilleurs résultats. </li><li> cellules en suspension Resuspendre, ou de superposer les cellules adhérentes, avec 400 ul de pré-chauffé une solution saline tamponnée par HEPES, avec ou sans calcium et magnésium, et contenant 5 mM de D-glucose (HBS / D; pH 7,3, 37 ° C) dans des puits d&#39;une plaque de 24 puits. Ajouter le même volume de HBS / D pour puits sans cellules spécifiées sur chaque plaque de 24 puits à examiner. Remarque: ce dernier servira de contrôles exempts de cellules pour la réaction de base (voir ci-dessous). </li></ol></li></ol> 3. Déterminer le montant de l&#39;ascorbate Paru <ol><li> Les solutions mères suivantes doivent être préparées à l&#39;avance: 120U / ml AO dans HBS / D (préparer frais); 2,4 mM Ferene-S dans HBS / D; 120 uM FeCl 3 et 600 um Na-citrate dans HBS / D (préparer immédiatement de solutions mères plus concentrées). </li><li> Pour démarrer la réaction de ferrireduction (volume final par puits devrait être 600 pi), ajouter les volumes de réactifs aux puits individuels contenant déjà 400 pi de HBS / D suivants: <ol><li> Ajouter 50 ul de AO (120 U / ml) ou HBS / D pour le jumelage des puits en triple exemplaire. La concentration finale doit être de 10 AO U / ml. Remarque: Étiquette jumelé puits comme &quot;- AO» et «+ AO&quot;. </li><li> Mélanger les plaques avec un mélange orbital douce pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 50 ul de 2,4 mM Ferene-S dans tous les puits. La concentration finale Ferene-S devrait être de 200 uM. Mélanger les plaques comme ci-dessus pendant 5 minutes à 37 ° C. </li><li> Ajouter 50 ul de fraîchement préparé 120 uM citrate ferrique. La finale en fer et concentrations de citrate devraient être 10 uM fer et 50 uM citrate. Mélangez bien. </li></ol&gt; </li><li> En trois puits de contrôle triple, aspirer le milieu de recouvrement et ajouter 600 ul HBS / D contenant 0,1% de saponine. Remarque: Ceux-ci serviront de «100% des cellules lyse&quot; contrôles pour une lactate déshydrogénase (LDH) version d&#39;essai qui se déroulera en parallèle (voir ci-dessous). </li><li> Incuber pendant 60 min à l&#39;obscurité à 37 ° C. </li><li> A la fin de l&#39;essai d&#39;efflux-ascorbate, aspirer rapidement 500 ul de chaque puits et ajouter marquée de manière appropriée à des puits dans une plaque à 24 puits. Note: pour les cellules en suspension, éliminer initialement les cellules par centrifugation à 4 ° C. </li><li> Ajouter 300 aliquotes du surnageant à une plaque de 96 puits et ensuite lire à 593 nm. </li></ol> 4. Détermination de l&#39;ascorbate extracellulaire <ol><li> Lire les valeurs d&#39;absorbance des puits à 593 nm. </li><li> Calculer la quantité d&#39;ascorbate extracellulaire comme l&#39;ascorbate nmoles par mg de protéine (ou par million de cellules), comme décrit pour la détermination de l&#39;ascorbate intracellulaireà l&#39;étape 1.5.4. Remarque: l&#39;utilisateur final doit optimiser les conditions pour que l&#39;ascorbate de presse n&#39;est pas limitée par l&#39;ascorbate intracellulaire. </li></ol> 5. Détermination de la LDH de sortie <ol><li> Avec les 200 ul restants de la solution extracellulaire à partir de chaque échantillon, effectuer un dosage de libération de LDH 32,41 pour déterminer l&#39;étendue de la lyse cellulaire. Remarque: le calcul en% de la LDH libérable totale. Déterminer LDH libéré à partir des échantillons qui ont été traités avec 0,1% de saponine. </li></ol>

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R., Czerwinska, H., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Na+/H++exchangers+and+intracellular+pH+in+regulating+vitamin+C-driven+electron+transport+across+the+plasma+membrane.">A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane.</a> Biochem. J. 428, 191-200 (2010).</li><li>Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+for+transport+and+efflux+of+ascorbate+and+dehydroascorbate.">Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).</li><li>Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electron+spin+resonance+spectra+of+radical+intermediates+in+the+oxidation+of+ascorbic+acid+and+related+substances.">The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).</li><li>Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detoxification+of+exogenous+hydrogen+peroxide+and+organic+hydroperoxides+by+cultured+astroglial+cells+assessed+by+microtiter+plate+assay.">Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplasma+membrane+electron+transport+comes+in+two+flavors.">Transplasma membrane electron transport comes in two flavors.</a> Biofactors. 34, 191-200 (2009).</li><li>Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+the+effects+of+cytochalasin+B+on+transport+and+motile+processes.">Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).</li><li>May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+decreases+oxidant+stress+in+endothelial+cells+caused+by+the+nitroxide+tempol.">Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol.</a> Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).</li><li>Avron, M., Shavit, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+method+for+determination+of+ferrocyanide.">A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide.</a> Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans ce document, nous présentons deux dosages colorimétriques des microplaques rapides, précis et relativement sensibles pour la détermination de l&#39;ascorbate dérivé de compartiments intra-et extracellulaires dans les cellules cultivées. Les analyses peuvent être complétées par l&#39;accès aux équipements et réactifs de laboratoire standard. Le réactif que modérément coûteux requis pour le dosage est AO, qui est essentielle, car elle donne un degré élevé de spécificité analyte vers <span class=...

La découverte de la nature chimique de l&#39;acide ascorbique (vitamine C), et son identification comme le «facteur anti-scorbutique&quot; longtemps cherché, par Albert Szent-Györgyi et d&#39;autres dans les documents publiés de 1928 à 1934 1 étaient événements marquants dans l&#39;histoire de la biochimie. En effet, ces découvertes ont contribué à Szent-Györgyi est attribué le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1937. L&#39;ensemble toujours croissant de rôles pour l&#39;ascorbate en physiologie animale et végétale, ainsi que la santé humaine, continuent à être les sujets de scientifique active enquête et de controverse. L-ascorbate est un réducteur physiologique abondante et cofacteur enzymatique dans des systèmes de mammifères, et contribue à de nombreuses réactions enzymatiques impliquant bien définies hydroxylation du collagène, de la carnitine et de la norépinéphrine la biosynthèse, le métabolisme de la tyrosine et de l&#39;hormone de peptide amidation 2. Curieusement, evide de montagence suggère que l&#39;ascorbate joue un rôle dans la stimulation d&#39;autres dioxygénases de fer-dépendants, tels que les hydroxylases prolyl et asparaginyle impliquées dans le ciblage et l&#39;hydroxylation des facteurs inductibles par l&#39;hypoxie (HIF) et 1α 2α 3. Un rapport récent suggère que l&#39;ascorbate joue un rôle dans la maturation des lymphocytes T en affectant la chromatine déméthylation via son activité en stimulant les hydroxylases nucléaires, Jumonji C (JmjC) protéines de domaine; ce dernier qui semble exiger ascorbate de pleine activité 4. En effet, la stimulation de ces enzymes par ascorbate semble se produire par un mécanisme similaire à la stimulation par l&#39;ascorbate de collagène et les HIF hydroxylases. Parmi d&#39;autres effets classiques, ascorbate contribue de manière significative à l&#39;anti-oxydation cellulaire en tant que chaîne de tomber en piégeur de radicaux soluble dans l&#39;eau 5 et au recyclage de la membrane plasmique α-tocophérol (vitamine E) par l&#39;intermédiaire de la réduction du radical α-tocophéroxyles 6, which est important dans la protection contre peroxydation des lipides membranaires 7. Il est important, bien que la plupart des mammifères sont capables de novo la synthèse hépatique de l&#39;ascorbate de D-glucose, les primates supérieurs, des cobayes et des chauves-souris dépendent de sources alimentaires de vitamine 8. Cela est dû à l&#39;inactivation du gène GULO, les orthologues de non affectées chez les mammifères qui codent pour l&#39;enzyme, γ-gulono-lactone oxydase 9-13. Cette enzyme est requise pour la réaction finale dans la biosynthèse de l&#39;ascorbate de 13 glucose. Après absorption de transporteur à médiation par de la lumière intestinale chez l&#39;homme, l&#39;ascorbate est distribué dans tout le corps par le système circulatoire. La vitamine se trouve généralement dans sa forme réduite à des concentrations millimolaires intracellulaire (à l&#39;exception notable des érythrocytes dans laquelle les concentrations sont généralement similaires à la concentration plasmatique en vigueur), et au concentré micromolesentrations (par exemple 50-200 pM) dans la plupart des liquides extracellulaires 14,15. Dans des conditions physiologiques, l&#39;ascorbate subit typiquement une oxydation à un électron réversible au radical ascorbyle libre (AFR, également connu sous le nom monodehydroascorbate ou semidehydroascorbate). Alors que l&#39;AFR est un radical relativement stable 16, en l&#39;absence de son rapide à un électron réduction enzymatique de retour à l&#39;ascorbate, deux RAS peut encore dismuter à un ascorbate et un déshydroascorbate (DHA) 9,13,17. A l&#39;intérieur de la cellule, le produit d&#39;oxydation à deux électrons de l&#39;ascorbate, le DHA, peut être rapidement ramené en arrière à l&#39;ascorbate et de la glutathion-NAD (P) H-enzymatique de charge et des réactions non enzymatiques 13. S&#39;il est classiquement admis que seulement le rôle important de l&#39;ascorbate dans le métabolisme du fer est de stimuler l&#39;absorption alimentaire de fer non hémique 18, nous et d&#39;autres avons fourni des preuves dece qui suggère que l&#39;ascorbate trongly joue un rôle considérablement élargi dans le métabolisme de ce métal. Tout d&#39;abord, l&#39;ascorbate qui est libérée par les cellules de l&#39;ascorbate-remplie semble jouer un rôle important dans la modulation de l&#39;absorption du fer non lié à la transferrine par les cellules 19,20, et la preuve très récente indique que l&#39;ascorbate module également l&#39;absorption du fer lié à la transferrine par des cellules 21, cette dernière, qui correspond à une importante absorption physiologique de fer-voie 22. Ascorbate est essentiel pour la fonction normale du système nerveux central chez les mammifères 23,24. En collaboration avec le cortex, de l&#39;hypophyse, du thymus, de la rétine et du corps jaune surrénale, le cerveau contient des concentrations élevées de l&#39;ascorbate par rapport à d&#39;autres tissus de l&#39;organisme 23,25-27. De plus, l&#39;exposition à la fois les astrocytes et les cellules 28,29 analogues à des neurones 30 de glutamate est connu pour déclencher la libération de l&#39;ascorbate dans l&#39;espace extracellulaire, où l&#39;ascorbatee est pensé pour aider à protéger les neurones contre la dysfonction neuronale induite par le glutamate 31. Bien que le mécanisme exact de induite par le glutamate-ascorbate de presse des astrocytes est inconnue, nous avons récemment apporté des preuves indiquant l&#39;implication de la cellule gonflement causé par une capture de glutamate par le glutamate des astrocytes et de l&#39;aspartate transporteur (GLAST, également appelée acide aminé excitateur transporteur isoforme 1 [EAAT1 ] chez l&#39;homme) et l&#39;activation consécutive de osmolyte et d&#39;anions canaux de volume sensible (VSOACs) qui sont perméables à de petits anions organiques tels que l&#39;ascorbate 32. Les identités moléculaires des conduits de membranes plasmatiques impliquées dans la formation VSOAC restent à identifier 33,34. Bien que de nombreux essais ont été développées pour la détermination de l&#39;ascorbate dans des échantillons biologiques, qui comprennent les dosages spectrophotométriques, fluorimétriques et 35,36 chromatographiques, il existe une grande variabilité dans la spécificité, la sensibilité, interference par les contaminants chimiques, la gamme linéaire efficace et la stabilité de l&#39;analyte du point de terminaison. En outre, d&#39;autres facteurs importants qui influent sur le choix de test sont la rapidité, la facilité d&#39;utilisation et l&#39;accès à un équipement relativement spécialisé, comme une chromatographie liquide à haute performance (CLHP) appareil. Ici, nous présentons un dosage simple et hautement spécifique microplaque colorimétrique pour la détermination de l&#39;ascorbate intracellulaire dans des cellules cultivées, ainsi que d&#39;un essai séparé pour la détermination de l&#39;ascorbate-efflux de cellules en culture. Le dernier test a pour but de contourner le problème de la sous-estimation de l&#39;ascorbate de presse à partir de cellules en raison de ré-absorption rapide de l&#39;ascorbate libéré par les transporteurs d&#39;ascorbate de sodium-dépendant (SVCTs). Bien que ces deux méthodes ont fait leur apparition dans certaines de nos publications précédentes 19,20,32,37,38, ce manuscrit fournit un ensemble explicite des instructions et des lignes directrices pour leur exécution effective.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Nunc 96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:135px;">Thermo</td>
			<td style="width:127px;">269620</td>
			<td style="width:132px;">Any flat-bottom 96-well plate can be used</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:284px;">Refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5415D</td>
			<td style="width:132px;">A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:74px;width:284px;">Refrigerated bench-top centrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5810R</td>
			<td style="width:132px;">Swing-bucket</td>
		</tr>
		<tr height="260">
			<td height="260" style="height:260px;width:284px;">Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer</td>
			<td style="width:135px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:284px;">Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">General-purpose buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:284px;">MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:284px;">HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2&#8226;2 H2O, 0.8 mM MgSO4&#8226;7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">General chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Highest purity preparations should be obtained</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30790</td>
			<td style="width:132px;">Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">C6762</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions prepared in DMSO or ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Ascorbate oxidase (AO)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A0157</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Potassium ferricyanide (FIC)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">455989</td>
			<td style="width:132px;">Trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5&#8242;,5&#8242;&#8242;-disulfonic acid disodium salt)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">92940</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Sodium L-glutamate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Saponin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">47036</td>
			<td style="width:132px;">Prepare a 0.1% stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">3 M sodium acetate (pH 6.0)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.2 M citric acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:284px;">3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">30 mM ferene-S</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stock solutions for ascorbate-efflux assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">AO (120 U/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">2.4 mM ferene-S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and specific microplate assay for the determination of intra- and extracellular ascorbate in cultured cells

La vitamine C (ascorbate) joue de nombreux rôles importants dans le métabolisme cellulaire, dont beaucoup ont seulement venir à la lumière au cours des dernières années. Par exemple, dans le cerveau, l&#39;ascorbate agit d&#39;une manière neuroprotecteur et neuromodulateur qui implique vélo ascorbate entre les neurones et les astrocytes vicinaux - une relation qui semble être essentiel pour le cerveau ascorbate homéostasie. En outre, la preuve émergente suggère fortement que l&#39;ascorbate a un rôle considérablement élargi dans la régulation du métabolisme du fer cellulaire et systémique que classiquement reconnu. La reconnaissance croissante du rôle intégrante de l&#39;ascorbate dans la physiologie cellulaire et organismique normale et déréglementé exige une gamme de moyen-débit et haute sensibilité des techniques analytiques qui peuvent être exécutées sans avoir besoin d&#39;équipement spécialisé très coûteux. Ici, nous fournissons des instructions explicites pour un débit moyen, essai de microplaques spécifique et relativement peu coûteux pour la détermination de boe ascorbate intra-et extra-cellulaire dans une culture cellulaire.

Détermination de l&#39;ascorbate intracellulaire dans les cellules de suspension de culture Dans le premier essai (figure 1), l&#39;ascorbate intracellulaire est déterminée, à la suite de l&#39;ascorbate-spécifique (c.-à-AO-sensible) la réduction du ferricyanure en ferrocyanure, à l&#39;aide de la détermination hautement sensible de ferrocyanure par un mode opératoire déjà publié 37. La détection de l&#39;ascorbate est basée sur la colorimétr...

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A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Ascorbate joue de nombreux rôles importants dans le métabolisme cellulaire, dont beaucoup ont seulement mis en lumière au cours des dernières années. Nous décrivons ici un débit moyen, dosage de microplaques spécifique et peu coûteux pour la détermination de l&#39;ascorbate à la fois intra-et extra-cellulaire dans une culture cellulaire.

Une microplaque de dosage rapide et spécifique pour la détermination de l&#39;ascorbate intra-et extracellulaire dans les cellules cultivées

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

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Research

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Biology

13.4K vues.  University of Sydney.  Ascorbate joue de nombreux rôles importants dans le métabolisme cellulaire, dont beaucoup ont seulement mis en lumière au cours des dernières années. Nous décrivons ici un débit moyen, dosage de microplaques spécifique et peu coûteux pour la détermination de l'ascorbate à la fois intra-et extra-cellulaire dans une culture cellulaire. 

Vidéo: A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Comptage et détermination de la viabilité des cellules cultivées

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Recherche

Biologie

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Test clonogénique: cellules adhérentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Détection de intracellulaire Gene Expression dans des cellules vivantes de murin, humain et porcin Origine utilisant des nanoparticules marquées par fluorescence

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Un rapide, méthode évolutive pour l&#39;isolement, l&#39;étude fonctionnelle, et l&#39;analyse de la matrice extracellulaire de cellules dérivées

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Expression transitoire et localisation cellulaire des protéines recombinantes dans les cellules d&#39;insectes Cultured

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

Essai de co-immunoprécipitation des protéines nucléaires endogènes de cellules cultivées dans des Conditions hypoxiques

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...