This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

Toutes les expériences animales conformes aux Instituts nationaux de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par l&#39;Université Wake Forest de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité. Les couples reproducteurs pour SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] modèle de souris ont été obtenus à partir de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). De type sauvage (WT) femelles et les mâles SOD1G93A non transgénique [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] ont été élevés pour générer des souris SOD1G93A et littermates WT non transgéniques qui ont été utilisés dans les expériences. 1. Les modèles pour les enquêtes <ol><li> La culture cellulaire <ol><li> Maintenir des cellules de rein embryonnaires humaines (HEK-T293), les cellules dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum inactivé à la chaleur bovin foetal, 1% de pénicilline-streptomycine et 1% de L-glutamine, à 37 ° C dans 5% de CO2. </li><li> Cultiver les cellules dans des flacons T75 et leur permettre d&#39;atteindre 90% de confluence. </li><li> Effectuer le fractionnement cellulaire par traitement à la trypsine (0,25% de trypsine-EDTA) pendant 3-5 minutes à 37 ° C dans 5% de CO 2 </sub&gt;, L&#39;inactivation de la trypsine avec un volume égal de milieu cellulaire, et la centrifugation des cellules pendant 5 minutes à 700 xg à 4 ° C. </li><li> Aspirer les médias et resuspendre le culot cellulaire dans des milieux de culture. </li><li> cellules de semences dans le ballon ou la plaque appropriée 7 x 10 4 cellules dans un flacon T75 48 heures avant la cytokine traitement. Cela devrait donner ~ 70% de la densité au moment du traitement. </li><li> cellules de mourir de faim de sérum 24 heures plus tard en aspirant les médias et le remplacer par le même volume de milieu sans sérum (DMEM, stérile). </li><li> Préparer TNF-α, IL1-β, IFN-γ et, à partir de poudre lyophilisée avec de l&#39;eau ultra-pure à une concentration de travail de 5 pg / ul, 10 ng / pl et 10 ng / pl, respectivement et les ajouter aux puits / flacons. </li><li> Traiter de sérum de cellules privées par l&#39;addition de cytokines solubilisés directement dans le milieu de culture cellulaire de flacons appropriés. Les traitements consistaient en des cytokines individuelles, un cocktail de tous les trois (dénommé &quot;* 3&quot;), ou sterile eau comme témoin (dénommé &quot;0&quot;). </li><li> Incuber les cellules traitées pendant 24, 48 ou 72 heures avant que l&#39;évaluation et la récolte. </li></ol></li><li> L&#39;évaluation de viabilité cellulaire <ol><li> Ajouter une solution à 5 mg / ml d&#39;acide 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) dans 1 x PBS. </li><li> Pour les plaques à 12 puits, ajouter 100 ul de solution de MTT à chaque puits et mélanger doucement en tournant pour assurer une distribution uniforme. </li><li> Incuber les plaques pendant 15 min-1 heure à 37 ° C dans 5% de CO 2, et vérifiez sous un microscope pour la présence de coloration violette. Si aucun violet est présente, agiter à nouveau et permettent aux cellules de incuber dans des intervalles de 5 min jusqu&#39;à ce que le violet est observé. La quantité de temps nécessaire doit être déterminé par chaque chercheur. </li><li> Aide d&#39;une pipette à répétition, ajoutez 700 pi de MTT solvant (HCl 4 mM et 0,1% de NP40 dans l&#39;isopropanol) à chaque puits et basculer la plaque (s) à la température ambiante pendant 5 à 10 min, ou jusqu&#39;à ce que la couleur pourpre avait laissé les cellules . Si pourprecouleur ne sort pas des cellules, ajouter un 200 pi supplémentaires de solvant et de continuer à tourbillonner. </li><li> Pour l&#39;analyse, prendre 100 pi de chaque puits et la placer dans une plaque de 96 puits et lire sur un lecteur de plaque à l&#39;aide de 570 nm et une longueur d&#39;onde de 630 nm de référence, cependant 595 nm est également acceptable tant que les mesures sont prises à des paramètres cohérents. </li></ol></li><li> modèle animal de la SLA <ol><li> Toutes les expériences animales conformes aux Instituts nationaux de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par l&#39;Université Wake Forest de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité. Les couples reproducteurs pour SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] modèle de souris ont été obtenus à partir de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). De type sauvage (WT) femelles et les mâles SOD1G93A non transgénique [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] ont été élevés pour générer des souris SOD1G93A et littermates WT non transgéniques qui ont été utilisés dans les expériences. </li><li> Effectuer génotypage avec des amorces standards contre SOD1 mutante 25. </li></ol></li></ol> 2. Isolement des mitochondries NOTE: Il est important de travailler rapidement et de garder tout sur la glace tout au long de la procédure. <ol><li> Préparation du tampon d&#39;isolement des mitochondries (MIB), un tampon d&#39;isolement de la moelle épinière (SC MIB) et de tampon expérimental (EB) <ol><li> Préparer les solutions d&#39;achat d&#39;actions suivantes à l&#39;avance pour MIB et EB. </li><li> Ajouter 1 M Tris / MOPS en dissolvant 12,1 g de base Tris dans 70 ml de H 2 O. Ajouter MOPS sèches pour obtenir pH à 7,4. Réglez le volume à 100 ml final. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C. </li><li> Faire une M Kphos en mélangeant 80,2 ml de K 2 HPO 4 et 19,8 ml de KH 2 PO 4. Entreposer à la température ambiante. </li><li> Ajouter 0,2 M EGTA / Tris en ajoutant 3,8 g de l&#39;EGTA à 10 ml de H 2 O. Ajouter 1 M Tris / MOPS jusqu&#39;à dissolution, ~ 30-40 ml. Ajuster à 50 ml, filtre stérile et stocker à température ambiante. Notez que le pH sera de 6,7 ~. </li><li> Faire une M glutamate en faisant 10 ml deSolution 1 M d&#39;acide glutamique. Filtre stériliser et stocker 4 ° C. </li><li> Faire une Malate M en faisant 10 ml d&#39;une solution M d&#39;acide malique. Ajouter Tris / MOPS à 50 mM. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C. </li><li> Assurez-MIB à une concentration de saccharose 200 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, et 1 mM d&#39;EGTA / Tris. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C. </li><li> Assurez-MIB SC à une concentration de 250 mM de saccharose, 20 mM de HEPES-KOH pH 7,5, 10 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 1 mM d&#39;EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM de DTT, et cocktail inhibiteur de protease. </li><li> Assurez-EB à une concentration de 125 mM de KCl, 10 mM de Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM de glutamate, malate de 2,5 mM, 1 mM de phosphate de K, pH 7,4, 10 mM d&#39;EGTA et / Tris. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C. </li></ol></li><li> la préparation de l&#39;équipement avant la récolte des cellules. <ol><li> Rincer un petit récipient en verre et l&#39;homogénéisation pilon trois fois à l&#39;eau stérile et placer sur la glace. </li><li> Recueillir des éléments nécessaires comme une perceuse standard, SCRA cellulairepers, 1,5 ml, 15 ml et 50 ml tubes et des solutions. </li></ol></li><li> Les mitochondries Isolation <ol><li> Les cellules cultivées <ol><li> Pour chaque type d&#39;échantillon, utiliser deux flacons T175 de cellules. </li><li> Veiller à ce que les cellules sont ~ 90% de confluence et l&#39;utilisation dans des expériences de contrôle, ou plaque et traiter comme décrit ci-dessus à l&#39;étape 1.2. </li><li> Sur la paillasse, les médias Aspirer et laver les cellules adhérentes deux fois avec 15 ml de PBS 1x chaque fois. </li><li> Aspirer le tampon et racler flacons pour éliminer les cellules adhérentes à partir du fond du flacon. </li><li> Ajouter 15 ml de PBS 1x à chaque flacon, tourbillon, et transfert à individuels tubes de 15 ml et le lieu coniques sur la glace. </li><li> Une fois raclage est fait, centrifuger les tubes pendant 5 min à 700 xg, 4 ° C en utilisant une centrifugeuse dessus de table en utilisant un rotor à godet oscillant. </li><li> Aspirer les surnageants de chaque pastille et remise en suspension dans 1 ml de MIB. </li><li> Combiner les deux suspensions et de transférer à un petit récipient en verre pour l&#39;homogénéisation. </li><li> Ajouter MIBdans le récipient jusqu&#39;à ce que le tampon atteint la première ligne. Homogénéiser les cellules avec le pilon attachés à une perceuse à vitesse moyenne pendant trois passes. Assurez-vous que le navire est sur la glace lors de cette étape, ne pas enlever le pilon au-dessus du liquide et d&#39;utiliser une vitesse constante avec des passes continues. </li><li> Transférer la solution homogénéisée dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Aspirer la solution dans une seringue de 3 ml en utilisant un 1 ½ aiguille de calibre 18 pouces et l&#39;expulser dans le tube conique sur glace avec une aiguille de calibre 27 ½ pouces. Veiller à expulser la solution contre la paroi interne du tube à utiliser que la force de rupture de la membrane cellulaire. </li><li> Répéter les étapes de seringue pour un total de cinq fois. </li><li> Transférer la solution dans un tube conique de 15 ml et on centrifuge pendant 5 minutes à 600 xg, 4 ° C dans une centrifugeuse de dessus de table au moyen d&#39;un rotor à godet oscillant. </li><li> Retirez délicatement le surnageant et répartir entre trois tubes de 1,5 ml. REMARQUE: Mitochondria sont dans le surnageant après cette première rotation à basse vitesse, tandis que les membranes cellulaires et les cellules non rompues sont rassemblées en un culot. </li><li> Tubes à centrifuger dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min. </li><li> surnageants de Aspirer et combinent les pastilles dans 100 ul MIB et placent immédiatement sur la glace. NOTE: Les mitochondries sont dans le culot après cette spin-haute vitesse. Les mitochondries sera généralement de maintenir leur potentiel de membrane pour ~ 2-3 ions glace après isolement et sont plus stable comme une solution de réserve concentrée dans MIB. </li></ol></li><li> isolement de mitochondries à partir de tissu de souris <ol><li> Anesthésier la souris selon le protocole IACUC. Définir un vaporisateur à 5,0% pour induire une anesthésie. A confirmé que l&#39;animal est anesthésié par un manque de réflexe pincée de pied ou réflexe clignotent lorsque l&#39;œil est approché ou tapoté avec un coton-tige. Garder la souris sous anesthésie à toute la procédure chirurgicale en le mettant à l&#39;évaporateur entre 1,5% et 2,0%. </li><li> Excise le foie et la moelle épinière de chaque animal et le lieu séparément dans le froid de la glace 1x PBS - / - pour rincer toute trace de sang. </li><li> Pour le foie, le tissu transférer à un plat peser sur la glace et les couper en petits morceaux à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir frais pendant 1 min. </li><li> Ajouter tissus et tampon approprié (MIB pour le foie ou SC MIB pour la moelle épinière) à la cuve jusqu&#39;à ce tampon atteint la première ligne. Homogénéiser le tissu avec le pilon à la main pendant cinq passes. Assurez-vous que le navire est sur la glace lors de cette étape, ne pas enlever le pilon au-dessus du liquide et d&#39;utiliser une vitesse constante avec des passes continues. </li><li> Transférez les homogénats pour nettoyer tubes de 15 ml. </li><li> Tubes à centrifuger dans un rotor à angle fixe à 750 xg, 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Enregistrer les surnageants dans des tubes propres et placer sur la glace. REMARQUE: Les mitochondries sont dans le surnageant après cette première rotation à basse vitesse, tandis que les membranes cellulaires et les cellules non rompues sont rassemblées en un culot. </li><li> Remettre en suspension les pastilles de la moelle épinière in 500 pi de SC MIB. </li><li> Re-homogénéiser chacun trois fois, seulement à mi-chemin le remplissage avec de la cuve SC MIB cette fois. </li><li> Transférer le nouveau homogénat dans un tube frais. </li><li> Centrifuger le rotor dans un angle fixe à 750 xg, 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Moissonneuse ces nouveaux surnageants, qui contiennent plus de mitochondries, le premier surnageant de chaque échantillon. </li><li> Tubes à centrifuger dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min. </li><li> surnageants de Aspirer et remettre en suspension les boulettes de foie dans 500 pi de MIB et les pellets de la moelle épinière dans 50 ul SC MIB et placer immédiatement sur la glace. NOTE: Les mitochondries sont dans le culot après cette spin-haute vitesse. Les mitochondries sera généralement de maintenir leur potentiel de membrane pour ~ 2-3 ions glace après isolement et sont plus stable comme une solution de réserve concentrée dans MIB. </li><li> Effectuer un dosage de la concentration de protéine pour estimer la concentration de la solution dans les mitochondries. Suivre les instructionss à l&#39;aide d&#39;un kit commercial Protein Assay ou méthode similaire 26. Les concentrations typiques de mitochondries sont les suivants: 2 flacons T175 rendements ~ 2 mg / ml, une foie de souris ~ 3-5 mg / ml, et une moelle épinière de souris ~ 1-3 mg / ml. </li></ol></li></ol></li><li> c dosage de Cytochrome utilisant une R &amp; D Rat / Souris Cytochrome c Quantikine ELISA Kit (adapté du protocole fourni par le fabricant). <ol><li> Immédiatement avant la mise en place des réactions, diluer mitochondries à 0,5 mg / ml concentration travailler avec EB et distribuer mitochondries dilués dans 1,5 ml tubes pour les réactions (généralement de 30 à 50 pi de mitochondries par tube). </li><li> Ajouter soit EB ou le DMSO, à 1% du volume total, les mitochondries dilué et incuber les réactions sur la paillasse pour 7-10 min. Ces réactions sont stables pendant jusqu&#39;à 30 minutes à la température ambiante si une période de temps plus longue est nécessaire. </li><li> Pellet mitochondries par centrifugation dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min et soigneuxLy séparer le surnageant et placer chacun dans un séparées tubes de 1,5 ml. REMARQUE: Tubes peut soit être congelé à -20 ° C pour une analyse ultérieure ou utilisé immédiatement. </li><li> Déterminer la libération de cytochrome c par une comparaison de la concentration de cytochrome c dans le culot et le surnageant 27. <ol><li> Préparer les échantillons en solubilisant les pastilles dans le volume initial de la réaction avec 0,5% de TX-100 dans du PBS 1x. </li><li> Pour chaque échantillon, préparer deux puits de la plaque ELISA, une pour le culot solubilisé et maintenant une pour le surnageant du mélange réactionnel par addition de 100 ul de conjugué de cytochrome c (utiliser directement de la bouteille) plus 100 ul de 0,5% Tx- 100 dans PBS 1x, et puis tout de la pastille ou le surnageant échantillon. </li><li> Vortex doucement la plaque un réglage bas (niveau 2-4) pendant 20 secondes pour mélanger, couvrir et laisser incuber pendant 1 heure, 37 ° C. </li><li> Ensuite, laver la plaque quatre fois avec le tampon de lavage dilué selon le fabriles instructions er. Retirer tout excès de solution en appuyant sur les puits sur une serviette en papier. </li><li> Ensuite, ajouter 150 ul de 1: 1 A + B solution de développement dans chaque puits et incuber la plaque pendant 20 à 30 min à l&#39;obscurité à température ambiante. </li><li> Enfin, ajouter 50 ul de solution d&#39;arrêt à chaque puits et prendre des lectures d&#39;absorbance à 540 nm en utilisant un lecteur de microplaques. Calculer la quantité de libération du cytochrome c en comparant la quantité de cytochrome c dans le culot par rapport surnageant pour chaque réaction. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Évaluation de la fonction mitochondriale (Dys) <ol><li> Immédiatement avant les réactions sont mises en place, diluer mitochondries à 0,5 mg / ml concentration de travail avec EB et placés dans des tubes de 1,5 ml pour les réactions (typiquement de 30 à 50 ul de mitochondries sont utilisés par tube). </li><li> Traitements mitochondriales <ol><li> Ajouter des traitements appropriés (contrôle EB, 1 uM FCCP mélangé avec 50 nM valinomycine, 10 uM roténone, 5 uM oligomycine, 2 mM de KCN, ou 200 uM d&#39;ADP, des concentrations finales) pour séparer les réactions à 1/10 du volume total des mitochondries dilué. Incuber les réactions sur la paillasse pendant 7 min. NOTE: Des précautions doivent être prises lors de la manipulation de ces substances que l&#39;ingestion accidentelle ou absorption par la peau pourrait être nocif. </li><li> Diluer TMRE, reconstitué dans de l&#39;eau stérile à une concentration de travail de 100 um et stocké à -20 ° C, à 2 uM et ajouter un volume égal au volume de réaction mitochondrial. </li><li> Incuber les réactions sur la paillasse pendant 7 min. </li><li> Pellet mitochondries par centrifugation dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min. </li><li> la moitié de la charge du volume de surnageant de chaque échantillon sur une plaque 396 puits et lire fluorescence. NOTE: excitation et d&#39;émission de longueurs d&#39;onde TMRE doivent être optimisés selon les instructions du fabricant en utilisant le volume et la plaque qui sera utilisé pourle dosage. Utilisation d&#39;une plaque de 384 puits standard noir avec 25 ul de 1 uM TMRE (concentration finale de réaction), le signal le plus fort a été obtenu en utilisant des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation / émission &#160; 485 nm / 535 nm. </li><li> Calculer la différence de pliage entre la fluorescence commande (EB) et chaque traitement en divisant la valeur de fluorescence relative (RFU) obtenu à partir du lecteur de plaques pour l&#39;échantillon expérimental par la RFU de l&#39;échantillon de contrôle. </li></ol></li></ol>

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A., Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+dependence+and+ABT-737+sensitivity+in+acute+lymphoblastic+leukemia.">BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 111, 2300-2309 (2008).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+complex+I+inhibitor+rotenone+induces+apoptosis+through+enhancing+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production.">Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).</li><li>Hynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+drug-induced+mitochondrial+toxicity+using+fluorescence-based+oxygen-sensitive+probes.">Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes.</a> Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).</li><li>Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+optical+oxygen+sensing:+protocols+and+critical+analyses.">Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses.</a> Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+permeabilization+in+apoptosis.">Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis.</a> Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+BCL-2+family+members.">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.</a> Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).</li><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li><li>Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+cytochrome+oxidase+and+succinoxidase+in+the+cytoplasm+of+the+mammalian+liver+cell.">The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).</li><li>Marques-Fernandez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFalpha+induces+survival+through+the+FLIP-L-dependent+activation+of+the+MAPK/ERK+pathway.">TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e493 (2013).</li><li>Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity:+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li><li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture:+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li><li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model.">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader.">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li><li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader.">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li><li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry.">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li><li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion.">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le traitement des cellules HEK-293T avec les cytokines recombinantes provoque des quantités modérées de la mort cellulaire de plus de 48 h (Figure 1). La quantité de la mort cellulaire induite par TNF-alpha traitement est similaire aux études précédemment rapportées 30 et la viabilité cellulaire diminue après co-administration de multiples cytokines qui sont supérieures à des quantités sommatives avec toute cytokine seule est également conforme à la littérature 31,32.</su...

Les cellules vivantes Energy Bank métabolique dans la forme de graisses et d&#39;hydrates de carbone et utilisent cette énergie pour la biosynthèse, transport membranaire et le mouvement. De l&#39;énergie est obtenue dans le cytosol à travers la transformation des sucres alimentaires en ATP directement pendant la glycolyse. Cependant, la principale source de la production d&#39;ATP dans une cellule est exploitée dans les mitochondries par la chaîne respiratoire mitochondriale 1. L&#39;architecture des mitochondries fournit l&#39;orientation spatiale nécessaire pour la production d&#39;ATP et efficace. Les mitochondries possèdent une double membrane séparées par un espace intermembranaire et ensemble avec la matrice, le compartiment mitochondrial plus à l&#39;intérieur, la maison des composants et de coordonner les réactions chimiques intervenant dans la génération d&#39;ATP. La membrane intérieure contient une série de complexes de protéines membranaires qui constituent la chaîne respiratoire ainsi que de l&#39;ATP synthase, le complexe protéique qui réunit ADP et Pi pour la formation d&#39;ATP. L&#39;aubergemembrane du RE est pliée en crêtes et des électrons sont transmis le long des complexes de la chaîne respiratoire par l&#39;intermédiaire du cytochrome c, un porteur d&#39;électrons soluble qui se déplace entre des complexes dans l&#39;espace intermembranaire. Comme les électrons se déplacent, l&#39;oxydation des équivalents réducteurs se produit et des ions hydrogène sont pompés à partir de la matrice de l&#39;espace intermembranaire. Comme conséquence de la forte concentration d&#39;ions dans l&#39;espace intermembranaire, un gradient électrochimique construit résultant dans un potentiel de membrane à travers la membrane mitochondriale interne (Δψ) 2. L&#39;oxygène est l&#39;accepteur final d&#39;électrons de la chaîne de transport d&#39;électrons et des ions hydrogène se écouler à travers les ATP synthases à partir de l&#39;espace intermembranaire revenir à la matrice, et, ce faisant directement provoquer la formation d&#39;ATP. Ce procédé tel que décrit dans son ensemble est connu comme la phosphorylation oxydative. Les plis de la crêtes augmentent la surface de la membrane interne, ce qui permet le transport d&#39;électrons maximale et la production d&#39;ATP à l&#39;intérieurchaque mitochondrie. Les protéines, des enzymes et d&#39;autres molécules impliquées dans la phosphorylation oxydative sont dérivés de deux gènes nucléaires et mitochondriales. Les mitochondries contiennent leur propre ADN circulaire, codant pour 13 protéines, ainsi que les ARNt et les ARNm nécessaires pour la production d&#39;ATP 3. Cependant, beaucoup plus de protéines sont nécessaires et sont donc codées dans le noyau. La plupart de ces protéines nucléaires codés sont ciblés sur la matrice mitochondriale par l&#39;utilisation de préséquences à l&#39;extrémité N-terminale de la protéine précurseur, et leur importation est entraînée en partie par Δψ 4,5. Au-delà de la contribution aux bioénergétique d&#39;une cellule, les mitochondries influencent également les principaux processus métaboliques telles que le TCA et le bêta-oxydation, la signalisation cellulaire par régulation de calcium, ainsi que d&#39;un rôle clé dans l&#39;apoptose 6. Plus précisément, pendant les périodes de stress cellulaire, les protéines famille Bcl-2 qui résident sur ou interagissent à la membrane externe mitochondriale peut causer mitochondrialperméabilité de la membrane externe (MOMP) 7,8. Au cours de la MOMP, le cytochrome c et d&#39;autres protéines sont libérées dans le cytosol, et avec plusieurs protéines cytosoliques former un complexe appelé apoptosome 9,10. Le apoptosome active caspases qui vont à cliver les protéines cellulaires et de l&#39;ADN pendant la phase d&#39;exécution de l&#39;apoptose. Dès que MOMP se produit, ΔΨ est effondré et la production d&#39;ATP arrêtée. Ainsi, la fonction mitochondriale, comme l&#39;apoptose est déclenchée est compromise et des changements dans ΔΨ peut être corrélée à la santé cellulaire mitochondriale et 12. Alors que l&#39;apoptose est un critère d&#39;évaluation dans de nombreux modèles de la maladie, la fonction mitochondriale et la modification de ΔΨ peut aussi fournir des informations précieuses sur l&#39;origination et / ou progression de la maladie. Par exemple, des changements structurels et fonctionnels mitochondriaux ont été documentés au cours de maladies neurodégénératives 13,14. Dans la première partie du protocole, isolation des mitochondries intactes qui conservent leur ΔΨ est décrite. Des cellules HEK-293T ont été exposées à différentes concentrations et combinaisons de TNF-α recombinant, IL1-β et IFN-γ pour induire l&#39;apoptose. Ces cytokines ont été choisis parce qu&#39;ils sont fréquemment signalés à être élevée dans les échantillons primaires septiques humaines 15 et la voie extrinsèque de l&#39;apoptose peut être déclenchée par l&#39;interaction de se lier à son récepteur TNF-α 6. Comme il existe des variations subtiles nécessaires pour isoler les mitochondries fonctionnelles de tissus primaires par rapport à des cellules en culture, et parce que de nombreuses recherches utilise des animaux, le protocole décrit également comment isoler les mitochondries de foie et la moelle épinière antérieure de la sclérose latérale (ALS) modèle de souris. La seconde partie du protocole a été conçu pour contrôler des perturbations au potentiel de la membrane mitochondriale en utilisant un colorant fluorescent sensible au potentiel d&#39;un lecteur de plaque fluorescente. Différences entre le statut cellulaire (à savoir, en bonne santé vs malsaine) se différencient par la quantification de la résistance de ΔΨ de mitochondries isolées conjointement avec des agents de découplage, des inhibiteurs de la chaîne respiratoire, des inhibiteurs et des ionophores complexes, lesquels provoquent une dissipation du potentiel de la membrane mitochondriale. La sain les mitochondries, plus le changement de ΔΨ lors d&#39;un traitement avec des inhibiteurs mitochondriaux, par conséquent, la réponse des mitochondries peut être utilisé comme un indicateur de la fonction mitochondriale (dys). Utilisation des mitochondries isolées plutôt que dans l&#39;évaluation in situ de la fonction offre la preuve définitive que d&#39;une pathologie ou de traitement module directement changements à l&#39;organite 16-18. Bien qu&#39;il existe des méthodes de la littérature pour isoler les mitochondries de cellules en culture, ils sont vagues 17 et / ou utilisent de l&#39;équipement spécialisé 16. Ce protocole décrit en détail la méthode d&#39;isolement et estfacilement adaptable à d&#39;autres lignées cellulaires, y compris les tissus et les cultures primaires 13,14,19,20. De nombreuses études de mitochondries isolées utilisent les mêmes découpleurs et inhibiteurs mitochondriaux utilisés dans ce protocole, mais avec une électrode Clark (21 est un exemple représentatif de nombreux articles dans la littérature), qui est encore un morceau très spécifique et spécialisée de l&#39;équipement. En outre, cette méthode traditionnelle a des limitations telles que faible débit et haute complexité 22,23 et nécessite une quantité importante de mitochondries (~ 500 ug / réaction). Dans ce protocole, la fluorescence TMRE potentiel de membrane de la sonde de détection est utilisé en conjonction avec un lecteur de plaque fluorescente, qui est une machine standard dans de nombreux laboratoires. TMRE est largement considéré car il pénètre rapidement les cellules et les mitochondries isolées et peut être utilisé à de faibles concentrations 24. Plusieurs réactions peuvent être rapidement mis en place en tandem et lots analysés en utilisant ce protocole. En outre, la réactions nécessitent une petite quantité beaucoup de mitochondries isolées (~ 10 pg / réaction). En exigeant moins de matériaux, échantillons de tissus ou de culture cellulaire plus petits peuvent être utilisés comme point de départ pour l&#39;isolement de mitochondries, plusieurs répétitions ou réactions peuvent être mis en place, et assez matériel potentiellement pour d&#39;autres expériences de mitochondries isolées telles que la production d&#39;ATP, la consommation d&#39;oxygène, ou l&#39;importation les dosages sont possibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:137px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8304</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trisma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCN</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td align="right">6379</td>
			<td>Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8717-25mg</td>
			<td>Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>1x regular (high glucose).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3002101</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td>US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Protien Assay Dye (5x)</td>
			<td style="width:137px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:163px;">500-0006</td>
			<td>Any protein assay can substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BSA</td>
			<td style="width:137px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">BP1600-100</td>
			<td>Make 2mg/mL stock in water for protein assay.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTT powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2128</td>
			<td>Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tergitol solution (NP-40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NP40S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human IL-1B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PCH08014</td>
			<td>Once opened store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IFN-gamma</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td>PHC4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Dulbeccos PBS (-/-)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:163px;">D8537</td>
			<td>Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytochrom c ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DTC0</td>
			<td>Human for HEK-293T cells.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Le traitement des cellules HEK-293T avec 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, et 75 ng / ml d&#39;IFN-γ (* 3) pour 24 à 48 heures conduit à des quantités progressives de la mort cellulaire (Figure 1A ). La viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant des dosages MTT et démontre qu&#39;il existe toujours ~ diminution de 10% de la viabilité cellulaire à un traitement de 24 heures et environ 20% de diminution de traitement 48 h. Les cellules traitées avec des concentrations similair...

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Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

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Biology

39.2K vues.  Elon University. Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress. 

Vidéo: Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

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Biologie

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purification des mitochondries de cellules de levure

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection de l&#39;hippocampe gyrus denté de souris adulte

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca2+ et du courant calcique de type L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris pour les tests respirométriques

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Isolement et analyse fonctionnelle de l’endothélium artériolaire du parenchyme cérébral de souris

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative stress has been suggested as a mechanism resulting in GEC dysfunction in the pathogenesis of some glomerular diseases. Historically the isolation of GECs from in vivo models has been notoriously challenging due to difficulties in isolating pure cultures from glomeruli. GECs have complex growth requirements in vitro and a very limited lifespan. Here, we describe the procedure for isolating and culturing conditionally immortalized GECs with fluorescent mitochondria, enabling the tracking of mitochondrial fission and fusion events. GECs were isolated from the kidneys of a double transgenic mouse expressing the thermolabile SV40 TAg (from the Immortomouse), conditionally promoting proliferation and suppressing cell differentiation, and a photo-convertible fluorescent protein (Dendra2) in all mitochondria (from the photo-activatable mitochondria [PhAMexcised] mouse). The stable cell line generated allows for cell differentiation after inactivation of the immortalizing SV40 TAg gene and photo-activation of a subset of mitochondria causing a switch in fluorescence from green to red. The use of mitoDendra2-GECs allows for live imaging of fluorescent mitochondria&#39;s distribution, fusion, and fission events without staining the cells.

The article describes the method for isolating conditionally immortalized glomerular endothelial cells from the kidneys of transgenic mice expressing the thermolabile simian virus 40 and photo-activatable mitochondria, PhAMexcised. We describe the procedure for glomeruli isolation from whole kidneys using beads, digestion steps, seeding, and culturing of GECs-CD31 positive.

Isolement de cellules endothéliales glomérulaires de souris immortalisées conditionnellement avec des mitochondries fluorescentes

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...