Cette étude a été financée par la Fondation Mcihael J. Fox pour la recherche 2011 Innovations de réaction rapide de Parkinson Programme de bourses. Les bailleurs de fonds n&#39;ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

Avant la chirurgie assurez-vous que toutes les procédures à effectuer sont approuvés par IACUC et des autorités éthiques ou juridiques supplémentaires et utilisent des pratiques de traitement sans cruauté des animaux. Cela comprend l&#39;utilisation des conditions de chirurgie stériles, anesthésier la souris en utilisant IACUC méthode approuvée, la lubrification des yeux de souris avec une pommade vétérinaire pendant la chirurgie, et fournir des soins post-opératoires. Ne pas procéder à une chirurgie s&#39;il ya une question de savoir si les aspects de la procédure sont approuvés. Toutes les procédures effectuées ici ont été approuvés par l&#39;Université institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux Comité Boston. 1. Préparation des animaux et fournitures chirurgicales <ol><li> Autoclave tout instrument chirurgical qui sera utilisé au cours de la chirurgie. </li><li> Assurez-vous que toutes les techniques qui doivent être effectués sont approuvés par les organismes de réglementation animaux. </li></ol> 2. Récolte de la muqueuse du greffon <ol><li> Choisissez une souris génétiquement identiques du même âge quela souris expérimentales et euthanasier dans une méthode IACUC approuvé (ici: l&#39;asphyxie isoflurane suivie par dislocation cervicale). </li><li> Avec des ciseaux chirurgicaux, enlever la peau autour de la région nasale de la tête de la souris exposer le crâne. </li><li> Avec une perceuse pneumatique, marque avec trois lignes de deux qui flanquent latéralement la région nasale et une troisième en ligne avec les yeux qui relie les deux lignes perpendiculairement. </li><li> Forer vers le bas sur le ventre, afin de séparer la cloison nasale du tissu environnant. Un chemin plus large permettra d&#39;éviter des dommages à la membrane de la muqueuse mais il sera également plus difficile d&#39;isoler la membrane. Une coupe étroite près de la ligne médiane est recommandé. </li><li> Utilisez des ciseaux pour couper la cloison libre de tout tissu adhéré et le stocker dans une solution saline stérile. A cette époque, la greffe peut être nettoyé pour enlever les tissus connecté. La situation idéale est d&#39;avoir des membranes muqueuses endommagées exposés des deux côtés de la cloison cartilagineuse. Un grarrière peut fournir membrane pour deux souris à condition que la surface de la membrane est suffisant pour couvrir les sites de craniotomie. Il est recommandé que la greffe est utilisée le plus rapidement possible et le chercheur passe à l&#39;étape 3 dès que le greffon est isolé. </li></ol> 3. L&#39;implantation chirurgicale de greffe muqueuse <ol><li> Utilisant des procédures standard, aseptiques murins chirurgicales, anesthésier et monter une souris dans le cadre stéréologique. Utilisez environ 2% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène pur à l&#39;aide d&#39;une machine d&#39;anesthésie rongeur. </li><li> Immobiliser la souris dans un appareil stéréotaxique avec des barres d&#39;oreille et un support de nez. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux et frotter le cuir chevelu avec de la bétadine et 75% d&#39;éthanol pendant trois tours. Utilisation de ciseaux ou une tondeuse à cheveux, enlever la fourrure sur la tête. Exposer le crâne avec une lame de rasoir et le niveau de la tête. Effectuer une craniotomie au-dessus de l&#39;emplacement du cerveau qui sera dosé. Par exemple, lorsque vous ciblez le striatum couper un 1,25 mmdiamètre trou circulaire dans le crâne (centré à l&#39;AP: 1,00 mm; ML: 0,88 mm) à l&#39;aide d&#39;un marteau-piqueur. Mouiller la zone percée avec une solution saline stérile et utiliser une lame de rasoir pour enlever le crâne. </li><li> Retirez délicatement la durée à l&#39;aide de la pointe d&#39;une aiguille. En outre, ceci peut être accompli par l&#39;application d&#39;une quantité minimale de colle pour tissus de la surface durale humide. Une fois que cette couche a durci, le déplacement latéral d&#39;une pointe de lame de rasoir peut être utilisé pour retirer la membrane. </li><li> Placer la membrane de la muqueuse au-dessus de la surface du cerveau en prenant soin extrême afin de maintenir le côté tourné à l&#39;opposé de l&#39;épithélium de la plaie. Ceci est mieux fait en transférant la totalité de la cloison sur la surface du crâne à proximité du site de craniotomie avec des pincettes. Avec la pointe d&#39;une paire de ciseaux chirurgicaux, tirez la membrane hors du cartilage et sur la surface du crâne et du cerveau. Ne laissez pas dessécher la membrane ou de toucher avec n&#39;importe quel matériau absorbant. La greffe devrait généreusement chevaucher tous les bords osseux de la craniotomie site. </li><li> Couvrir la greffe d&#39;un morceau stérile de nitrile. Ceci agit de façon à empêcher l&#39;adhérence de la peau pour la greffe au cours de la guérison. Le nitrile doit être suffisamment large pour couvrir la totalité de la membrane de la muqueuse. Coupez membrane excessive si nécessaire. Éviter tout mouvement du nitrile une fois qu&#39;il est entré en contact avec le greffe. </li><li> Fermer la peau avec un 5-0 suture stérile course et laissez la souris récupérer pendant 3-7 jours avant de passer à l&#39;étape suivante. Prenez soin de ne pas perturber la barrière de nitrile ou la greffe de muqueuse lors de la fermeture de la peau. </li></ol> 4. Administration de dosage Solution <ol><li> Après avoir assuré la souris anesthésiée dans le cadre stéréotaxique, couper le fil de suture avec des ciseaux et enlever l&#39;excès de peau autour du crâne. </li><li> Retirer la barrière de nitrile et de nettoyer la surface du crâne. Utilisez salines et des cotons-tiges stériles pour nettoyer la zone jusqu&#39;à ce que le greffon est visible. Il peut être nécessaire de couper la greffe avec un rasoir si a augmenté plus grande que la desired surface. </li><li> Si l&#39;expérience sera de plus de quelques jours, il est sage d&#39;implanter au moins deux vis de crâne de renforcer l&#39;implant de la tête. </li><li> Placer le puits au-dessus de la greffe de sorte que les bords sont en contact avec le crâne. Appliquer l&#39;adhésif à base de cyanoacrylate à la jonction entre le puits et le crâne. Remplir le puits avec une solution saline stérile et assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de fuites. Les puits sont fabriqués à partir des aiguilles de seringues coupées. </li><li> Appliquer la colle d&#39;os sur le crâne d&#39;assurer le bien en place. </li><li> Retirer la solution saline à partir du puits avec une pipette. Laver les puits à plusieurs reprises pour vérifier que la colle n&#39;a pas divulgué po Ajouter la solution désirée; dans ce cas, 50 pi de dextran fluorescent est utilisé. On s&#39;attend à ce que les composés solubles dans l&#39;eau d&#39;une polarité similaire se comporteront les mêmes que le dextrane. Délivrance de composés hydrophobes ou de suspensions n&#39;a pas été explorée avec cette méthode. </li><li> Boucher le haut du puits à l&#39;aide d&#39;un morceau circulaire de nitrile obtenu à l&#39;haut avec de la colle cyanoacrylate. Assurez-vous que la colle n&#39;entre pas en contact avec le contenu des puits. </li></ol> 5. Analyse des transmuqueuse <ol><li> Après que la quantité désirée de temps s&#39;est écoulé, anesthésier les souris et échanger les contenus des puits avec une solution de colorant bleu d&#39;Evan. Ce colorant est utilisé pour vérifier que la greffe était intact. </li><li> Après 30 min, anesthésier la souris lourdement, enlever la solution de colorant, et euthanasier par décapitation. </li><li> Supprimer manuellement l&#39;implant et retirer le cerveau à l&#39;aide des ciseaux chirurgicaux. Veillez à maintenir la greffe en place. </li><li> Une fois retiré, le flash-geler le cerveau dans une solution d&#39;isobutane refroidi dans un bain de glace sèche. </li><li> Incluez le cerveau dans Optimal Cutting Temperature (OCT) solution et tranche à 50 um. </li><li> Placer les tranches souhaités directement sur une lame de microscope. </li><li> L&#39;image de la tranche en utilisant un microscope à fluorescence dès que la solution PTOM ne s&#39;est séché. </li></ol>

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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+to+the+central+nervous+system:+Mechanisms+and+experimental+considerations.">Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations.</a> J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).</li><li>Illum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+drug+delivery-possibilities,+problems+and+solutions.">Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions.</a> J. Control. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+cerebrospinal+fluid+leak+repair:+An+animal+model+to+test+feasibility.">Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility.</a> Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).</li></ol>

Benjamin S. Bleier MD est l&#39;inventeur de plomb provisoires méthodes de délivrance de médicaments pour le système nerveux central de recouvrement de brevet.

L&#39;étape la plus difficile de la procédure décrite ici est la réussite du transfert d&#39;une membrane muqueuse de taille adéquate sur la surface du cerveau. Cette étape est faite beaucoup plus facile si la cloison nasale récolté est assez grand et bien nettoyée. Si la partie ventrale de la cloison est tronqué, une nouvelle greffe devrait être obtenu. L&#39;angle de perçage doit être perpendiculaire à la tête de la souris pour faire en sorte que la membrane de la muqueuse n&#39;est pas endommagé par l...

Le traitement d&#39;une maladie neurologique ou psychiatrique est gravement entravée par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui empêche plus de 95% de tous les agents pharmaceutiques potentiels d&#39;atteindre le système nerveux central 1-3. Par exemple, il a été démontré dérivé des cellules gliales facteur neurotrophique (GDNF) pour être efficace dans le traitement de la maladie de Parkinson lorsqu&#39;il est injecté directement dans le cerveau, mais est inefficace lors de la livraison systémique parce qu&#39;il ne peut pas pénétrer dans le 4-6 du Bureau. Nombreux approché ont été développées pour tenter de contourner ce problème. L&#39;amélioration de l&#39;administration systémique de neurotheraputics a été démontrée à l&#39;aide de conjugués médicament contenant des anticorps sélectifs pour des protéines de transport situés sur l&#39;endothélium capillaire cérébral; Mais cette méthode n&#39;a pas été montré pour être applicable à une large gamme de produits pharmaceutiques 7,8. En outre, l&#39;ouverture osmotique du Bureau a été utilisé cliniqueallié, mais ce procédé souffre d&#39;un dosage systémique du médicament, par opposition à une livraison plus direct vers la région du cerveau d&#39;intérêt 9. Des efforts considérables ont été mis en optimisation de la prestation transnasal dans l&#39;espoir de cibler directement le cerveau 10-12. Bien que certains succès ont été réalisés, des résultats probants ont été obtenus seulement pour les médicaments qui possèdent des récepteurs endogènes, tels que l&#39;insuline 13,14. En outre, le mécanisme de livraison transnasal a été controversée des preuves suggérant entrée indirecte dans le cerveau via l&#39;absorption de neurone olfactif ou par la circulation sanguine 11. , Livraison transcrânienne directe en utilisant des cathéters implantables ont été réalisés, mais cette procédure est très invasive et associée à de nombreuses complications 15,16. A ce jour, il n&#39;existe pas de méthode générale, peu invasive pour délivrer des composés de poids moléculaire élevé dans le cerveau. Présenté ici est une procédure chirurgicale murinqui crée une interface semi-perméable avec le cerveau. Ceci est réalisé en greffant un explant de membrane muqueuse 17 sur un défaut de craniotomie chirurgicale chez une souris. En utilisant cette procédure, il a été montré que les composés solubles allant jusqu&#39;à 500 kDa peuvent être délivrés dans le système nerveux central (directement dans le parenchyme du cerveau ainsi que dans le liquide céphalo-rachidien) à la fois dans le temps et d&#39;une manière dépendante de la masse moléculaire 18. Cette méthode de contourner le Bureau est un modèle pour les réparations de défauts de la base du crâne chez l&#39;homme qui utilise des greffons vascularisés muqueuses pour réparer les trous dans le crâne après la chirurgie endoscopique transnasal 19,20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:848px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:220px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:263px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">mice</td>
			<td style="width:220px;">Taconic</td>
			<td>C57BL/6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:220px;">Piramal Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Student Fine Scissors</td>
			<td style="width:220px;">Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">pneumatic drill</td>
			<td style="width:220px;">MTI Dental</td>
			<td style="width:119px;">333-CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">drill bit</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">forcepts</td>
			<td style="width:220px;">Fine Science Tools</td>
			<td>91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">0.9% Sodium Chloride Injection USP</td>
			<td style="width:220px;">Abbott Laboratories</td>
			<td>4925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Polystyrene Detri Dish</td>
			<td style="width:220px;">Fisher</td>
			<td>08-757-12</td>
			<td>for temporarily storing graft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bead Sterilizer</td>
			<td style="width:220px;">Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxygen/Isoflurane System</td>
			<td style="width:220px;">SurgiVet</td>
			<td>V720100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Temperature Control System</td>
			<td style="width:220px;">Physitemp</td>
			<td style="width:119px;">TCAT-2LV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td style="width:220px;">KOPF</td>
			<td style="width:119px;">Model 940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eye Ointment</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Electric shaver</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td style="width:220px;">Fisher</td>
			<td>23-400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7.5% Provadone Iodine</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Betadine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Surgical Blade Stainless</td>
			<td style="width:220px;">Feather</td>
			<td style="width:119px;">2976#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Scalpel Handle - #3</td>
			<td style="width:220px;">Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3% Hydogen Peroxide</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for cleaning the skull</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td style="width:220px;">3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305176</td>
			<td>needle tip cut off and used as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">nitrile gloves</td>
			<td style="width:220px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td>G4162</td>
			<td>for well closure and protection of graft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-0 Nylon Suture Thread</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Student Halsey Needle Holder</td>
			<td style="width:220px;">Fine Science Tools</td>
			<td>91201-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">cyanoacrylate adhesive</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>commecially available super glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dental Cement Kit, 1 lb, Pink Opaque</td>
			<td style="width:220px;">Stoelting</td>
			<td>51458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">isobutane (2-methylbutane)</td>
			<td style="width:220px;">Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td>for dry ice bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">dry ice</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

heterotopic mucosal engrafting procedure for direct drug delivery to the brain in mice

Livraison d&#39;agents thérapeutiques dans le cerveau est entravée par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui restreint le passage de composés polaires et de haute masse moléculaire et de la circulation sanguine dans le tissu cérébral. Certains succès de livraison directe chez l&#39;homme a été atteint par l&#39;implantation de cathéters transcrânienne; Cependant cette méthode est très invasive et associée à de nombreuses complications. Une alternative moins invasive consiste à doser le cerveau à travers un implanté chirurgicalement, la membrane semi-perméable telle que la muqueuse nasale qui est utilisé pour réparer des défauts de la base du crâne après la chirurgie endoscopique transnasale tumorale d&#39;élimination chez les humains. transfert des médicaments bien que cette membrane serait effectivement contourner la BBB et diffuser directement dans le cerveau et le liquide céphalorachidien. Inspiré par cette approche, une approche chirurgicale chez la souris a été développée qui utilise une membrane muqueuse septale donneur greffé sur un défaut chirurgical Bureau extra. Ce modèle a été démontré efficacementpermettre le passage de composés de haut poids moléculaire dans le cerveau. Depuis de nombreux médicaments candidats sont incapables de traverser la BHE, ce modèle est utile pour effectuer des essais précliniques de nouveaux traitements pour les maladies neurologiques et psychiatriques.

L&#39;obtention d&#39;un assez grand cloison nasale explant est crucial pour les étapes ultérieures. Ceci peut être réalisé par perçage à l&#39;emplacement sur ​​le crâne de la souris donneuse représenté sur la figure 1a. Coupant le long de ce chemin va produire un explant de la taille suffisante comme le montre la Figure 1b. Si la profondeur de perçage n&#39;est pas assez profond, la greffe sera tronquée et il sera difficile d&#39;obtenir une membrane suffisamment grand...

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Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice

Un modèle de souris de la reconstruction de la base du crâne humain endoscopique a été développé qui crée une interface semi-perméable entre le cerveau et le nez en utilisant des greffes muqueuses nasales. Cette méthode permet aux chercheurs d&#39;étudier à la livraison du système nerveux central de la thérapeutique de haut poids moléculaire qui sont par ailleurs exclus par la barrière hémato-encéphalique lorsqu&#39;il est administré par voie systémique.

Heterotopic muqueuse procédure de greffe de médicaments Livraison directe au cerveau chez les souris

Delivery of therapeutics into the brain is impeded by the presence of the blood-brain barrier (BBB) which restricts the passage of polar and high ...

heterotopic-mucosal-engrafting-procedure-for-direct-drug-delivery-to

Research

JoVE Journal

Medicine

10.7K vues.  Boston University.  Un modèle de souris de la reconstruction de la base du crâne humain endoscopique a été développé qui crée une interface semi-perméable entre le cerveau et le nez en utilisant des greffes muqueuses nasales. Cette méthode permet aux chercheurs d'étudier à la livraison du système nerveux central de la thérapeutique de haut poids moléculaire qui sont par ailleurs exclus par la barrière hémato-encéphalique lorsqu'il est administré par voie systémiqu...

Vidéo: Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to stimulate microcirculation. The choice of delivery method for these agents is important because the route of administration profoundly affects the bioactivity and efficacy of these agents1,2. In this article, we demonstrate how to locally administer a substance in ischemic hindlimbs by using a catheterized osmotic pump. This pump can deliver a fixed volume of aqueous solution continuously for an allotted period of time. We also present our mouse model of unilateral hindlimb ischemia induced by ligation of the common femoral artery proximal to the origin of profunda femoris and epigastrica arteries in the left hindlimb. Lastly, we describe the in vivo cannulation and ligation of the infrarenal abdominal aorta and perfusion of the hindlimb vasculature with Microfil, a silicone radiopaque casting agent. Microfil can perfuse and fill the entire vascular bed (arterial and venous), and because we have ligated the major vascular conduit for exit, the agent can be retained in the vasculature for future ex vivo imaging with the use of small specimen micro-CT3.

We show here the in vivo insertion of an osmotic pump for constant local drug delivery and the creation of hindlimb ischemia in a mouse model. Moreover, the hindlimb vasculature is perfused with Microfil, a silicone radiopaque agent, to prepare for micro-computed tomography (micro-CT) imaging.

Osmotique Drug Delivery à hindlimbs ischémiques et la perfusion de la vascularisation avec Microfil pour Micro-en tomodensitométrie

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Recherche

Médecine

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

À libération lente Drug Delivery par Elvax 40W pour le Retina Rat: Implications pour le traitement des maladies chroniques

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Direct Mouse Trauma/Burn Model of Heterotopic Ossification

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical procedures. The majority of animal models used to study HO rely on the application of exogenous substances, such as bone morphogenetic protein (BMP), exogenous cell constructs, or genetic mutations in BMP signaling. While these models are useful they do not accurately reproduce the inflammatory states that cause the majority of cases of HO. Here we describe a burn/tenotomy model in mice that reliably produces focused HO. This protocol involves creating a 30% total body surface area partial thickness contact burn on the dorsal skin as well as division of the Achilles tendon at its midpoint. Relying solely on traumatic injury to induce HO at a predictable location allows for time-course study of endochondral heterotopic bone formation from intrinsic physiologic processes and environment only. This method could prove instrumental in understanding the inflammatory and osteogenic pathways involved in trauma-induced HO. Furthermore, because HO develops in a predictable location and time-course in this model, it allows for research to improve early imaging strategies and treatment modalities to prevent HO formation.

An Achilles tenotomy and burn injury model of heterotopic ossification allows for the reliable study of trauma induced ectopic bone formation without the application of exogenous factors.

Souris Direct Trauma / Graver Modèle d&#39;ossification hétérotopique

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical ...

Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies this model by avoiding challenging suture anastomoses of small vessels thereby reducing warm ischemia time. In comparison to abdominal graft implantation the cervical model is less invasive and the implanted graft is easily accessible for further follow-up examinations. Anastomoses are performed by pulling the ascending aorta of the graft over the cuff with the recipient&#8217;s common carotid artery and by pulling the main pulmonary artery over the cuff with the external jugular vein. Selection of appropriate cuff size and complete mobilization of the vessels are important for successful revascularization. Ischemia-reperfusion (I/R) injury can be minimized by perfusing the graft with a cardioplegic solution and by hypothermia. In this article, we provide technical details for a simplified and improved cuff technique, which should allow surgeons with basic microsurgical skills to perform the procedure with a high success rate.

The cuff technique shortens and facilitates the model of heterotopic cervical heart transplantation in mice by avoiding technically challenging suture anastomoses of small vessels. The technical details shown in this video paper should allow researches to establish this model in their laboratories.

Heterotopic col de l&#39;utérus chez la souris Transplantation cardiaque

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies ...

Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The simple murine AVF model was combined with intraluminal administration of drug solution to the venous endothelium at the same time as fistula creation. Technical aspects of this model are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The infra-renal aorta and IVC are dissected for clamping. After proximal and distal clamping, the puncture site is exposed and a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta and into the IVC. Immediately after the puncture, a reporter gene-expressing viral vector was infused in the IVC via the same needle, followed by 15 min of incubation. The intraluminal administration method enabled more robust viral gene delivery to the venous endothelium compared to administration by the external route. This novel method of delivery will facilitate studies that explore the role of the endothelium in AVF maturation and enable intraluminal drug delivery at the time of surgical operation.

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

Intraluminale Drug Delivery à la souris fistule artério-endothélium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Trans-Tympanic Drug Delivery for the Treatment of Ototoxicity

The systemic administration of protective agents to treat drug-induced ototoxicity is limited by the possibility that these protective agents could interfere with the chemotherapeutic efficacy of the primary drugs. This is especially true for the drug cisplatin, whose anticancer actions are attenuated by antioxidants which provide adequate protection against hearing loss. Other current or potential otoprotective agents could pose a similar problem, if administered systemically. The application of various biologicals or protective agents directly to the cochlea would allow for high levels of these agents locally with limited systemic side effects. In this report, we demonstrate a trans-tympanic method of delivery of various drugs or biological reagents to the cochlea, which should enhance basic science research on the cochlea and provide a simple way of directing the use of otoprotective agents in the clinics. This report details a method of trans-tympanic drug delivery and provides examples of how this technique has been used successfully in experimental animals to treat cisplatin ototoxicity.

We present a technique for localized administration of drugs through the trans-tympanic route into the cochlea. Drug delivery through this route would not interfere with the anti-cancer efficacy of the chemotherapeutic drugs such as cisplatin.

TRANS-tympanique de médicaments pour le traitement de l’ototoxicité

The systemic administration of protective agents to treat drug-induced ototoxicity is limited by the possibility that these protective agents could ...

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to numerous external influences including antibiotics use and diet, which impacts susceptibility to autoimmune and inflammatory diseases. Disorders such as Inflammatory Bowel Disease (IBD) are characterized by a massive influx of immune cells to the intestines. However, immune cells conditioned by the microbiota may additionally emigrate out of the intestines to influence immune responses at extra-intestinal sites. Thus, there is a need to identify and characterize cells that may carry microbial messages from the intestines to distal sites. Here, we describe a method to label cells in the colon of newborn mice in vivo that enables their identification at extra-intestinal sites after migration.

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

The protocol described here utilizes a photolabeling approach in newborn mice to specifically identify immune cells that emigrate from the colon to extra-intestinal sites. This strategy will be useful to study host-microbiome interactions in early life.

In Vivo Photomarquage des cellules dans le côlon pour évaluer le potentiel migratoire des cellules hématopoïétiques chez les souris néonatales

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

Novel Methods for Intranasal Administration Under Inhalation Anesthesia to Evaluate Nose-to-Brain Drug Delivery

Intranasal administration has been reported to be a potential pathway for nose-to-brain delivery of therapeutic agents that circumvents the blood-brain barrier. However, there have been few reports regarding not only the quantitative analysis but also optimal administration conditions and dosing regimens for investigations of nose-to-brain delivery. The limited progress in research on nose-to-brain pathway mechanisms using rodents represents a significant impediment in terms of designing nose-to-brain delivery systems for candidate drugs.
To gain some headway in this regard, we developed and evaluated two novel methods of stable intranasal administration under inhalation anesthesia for experimental animals. We also describe a method for the evaluation of drug distribution levels in the brain via the nose-to-brain pathway using radio-labeled [14C]-inulin (molecular weight: 5,000) as a model substrate of water-soluble macromolecules.
Initially, we developed a pipette-based intranasal administration protocol using temporarily openable masks, which enabled us to perform reliable administration to animals under stable anesthesia. Using this system, [14C]-inulin could be delivered to the brain with little experimental error.
We subsequently developed an intranasal administration protocol entailing reverse cannulation from the airway side through the esophagus, which was developed to minimize the effects of mucociliary clearance (MC). This technique led to significantly higher levels of [14C]-inulin, which was quantitatively detected in the olfactory bulb, cerebrum, and medulla oblongata, than the pipette method. This appears to be because retention of the drug solution in the nasal cavity was substantially increased by active administration using a syringe pump in a direction opposite to the MC into the nasal cavity.
In conclusion, the two methods of intranasal administration developed in this study can be expected to be extremely useful techniques for evaluating pharmacokinetics in rodents. The reverse cannulation method, in particular, could be useful for evaluating the full potential of nose-to-brain delivery of drug candidates.

Here, we describe two novel methods of stable intranasal administration under inhalation anesthesia with minimal physical stress for experimental animals. We also describe a method for quantitative evaluation of drug distribution levels in the brain via the nose-to-brain pathway using radiolabeled [14C]-inulin as a model substrate of water-soluble macromolecules.

Nouvelles méthodes pour l’Administration intranasale sous anesthésie par Inhalation pour évaluer des nez-de-Brain Drug Delivery

Intranasal administration has been reported to be a potential pathway for nose-to-brain delivery of therapeutic agents that circumvents the blood-brain ...