The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.

Préparation de l&#39;échantillon 1 <ol><li> B. Préparation d&#39; Les cellules subtilis pour l&#39;imagerie <ol><li> Inoculer 10 ml de bouillon Penassay (PAB, également connu sous le nom d&#39;antibiotiques Medium 3) avec une seule colonie de B. subtilis souche SU570 (168 ftsZ-GFP-spec :: trpC2 ftsZ) 16. Développer une nuit dans une faible vitesse (100 rpm) agitateur à 30 ° C. </li><li> Diluer la culture de la nuit à 0,05 A 600 (absorbance mesurée à 600 nm) dans PAB frais à 30 ° C avec une vitesse élevée (215 tpm) secouer et se développer jusqu&#39;à la phase mi-exponentielle (A 600 ~ 0,4). </li><li> Ajouter 2 g d&#39;agarose électrophorèse de qualité dans 100 ml 1x milieu de croissance (PAB) dans une bouteille en verre à bouchon à vis. Dissoudre la gélose à l&#39;autoclave. Ceci peut être stocké à 4 ° C pendant quelques mois, et au micro-ondes pour faire fondre l&#39;agarose en cas de besoin. Laisser reposer à la température ambiante. </li><li> Fixer un cadre adhésif (65 capacité de pl; voir le tableau des matériaux) sur un gla normess lame de microscope. Pour ce faire, retirez la feuille de polyester mince (chaque trame adhésive est placée entre deux feuilles de polyester, un mince et un épais, et a le centre carré enlevé) et appliquer la surface adhésive exposée du cadre à la surface de la lame de microscope. Cela crée effectivement un bien place sur le dessus de la lame. Laisser la feuille de polyester d&#39;une épaisseur fixée sur le châssis comme cela va empêcher la lamelle de collage dans les étapes ultérieures. </li><li> Faire fondre la solution d&#39;agarose dans un four micro-ondes jusqu&#39;à l&#39;ébullition et la pipette 67 ul dans le cadre de l&#39;adhésif. Immédiatement placer une lamelle sur le dessus pour créer une surface plane et le laisser à température ambiante pendant 5-10 min. Retirer la lamelle pendant 1-2 min tandis que l&#39;échantillon est récolté. </li><li> Récolter une aliquote de 1 ml de l&#39;échantillon et centrifuger à 5900 g pendant 30 s. Décanter le surnageant et remettre le culot dans 200 ul frais PAB. </li><li> Prendre 2,5 ml de l&#39;échantillon concentré et pipette sur une pré-prépapad agarose rouge. Étaler uniformément l&#39;échantillon le long de la surface plane de la plaquette d&#39;agarose. Retirez le cadre de l&#39;adhésif de la lame de microscope en utilisant des pinces sans toucher le coussin d&#39;agarose. </li><li> Transférer le bloc d&#39;agarose à partir de la lame de microscope pour une boîte de 35 mm de diamètre de Pétri avec un fond de la lamelle de verre. Inverser le tampon d&#39;agarose de telle sorte que la suspension de cellules et la lamelle de la boîte de Pétri sont en contact direct les uns avec les autres. Le fond de la boîte de Petri a un indice de réfraction de 1,525 pour l&#39;imagerie haute résolution. </li></ol></li><li> Préparation de Live S. Les cellules aureus pour l&#39;imagerie <ol><li> Inoculer 10 ml de bouillon L avec une seule colonie de S. aureus souche SA94 (SH1000 contenant charrue FtsZ-GFP et pGL485; Erm r, r cm) 25. Croître pendant une nuit à basse vitesse (100 tours par minute) du secoueur rotatif à 37 ° C. </li><li> Diluer la culture de la nuit à 600 0,05 A (absorbance mesurée à 600 nm) dans du bouillon L frais avec 0,05 mM d&#39;IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) pour induire la production de la protéine de fusion. </li><li> Incuber à 37 ° C à haute vitesse (215 rpm) à trembler et se développer jusqu&#39;à la phase de mi-exponentielle (A 600 ~ 0,4). </li><li> Suivez les étapes 1.1.3 - 1.1.8 comme décrit pour B. subtilis préparation des cellules vivantes. Remarque: Ajouter la concentration appropriée de l&#39;inducteur à la solution d&#39;agarose à l&#39;étape 1.1.3 pour les souches qui expriment une protéine de fusion fluorescente sous contrôle inductible. </li></ol></li></ol> 2 Préparation du microscope Cette méthode utilise un DeltaVision OMX (microscope optique, expérimental) 3D-SIM système d&#39;imagerie équipé d&#39;un module Blaze. Pour les essais décrits, un seul laser et une caméra sont utilisés. L&#39;éclairage et le chemin de lumière sont décrites dans la figure 1. Cette méthode suppose que le microscope a calibrage approprié, la fonction de transfert optique (FTO)fichiers et l&#39;entretien de collimation de la lumière effectués. <ol><li> Pour vivants des expériences d&#39;imagerie cellulaire, assurez-vous que l&#39;étape de chauffage est fixé au stade céramique et le collier objectif de chauffage est fixé à l&#39;objectif (60X 1,42 NA objectif de l&#39;huile). </li><li> Tourner sur les objectifs et la scène de chauffage d&#39;au moins 4 heures avant de l&#39;imagerie et de la rampe lentement la température à la position désirée à un taux maximum de 5 ° C / h. Il est recommandé de commencer ce processus, le soir avant de l&#39;imagerie et de la rampe à 3 ° C / 4 h. Pour les expériences de cellules vivantes avec B. subtilis, la plupart des expériences sont effectuées à 30 ° C. Pour S. aureus, toutes les expériences sont effectuées à 37 ° C. </li><li> Le jour de l&#39;expérience, mettez le système sur au moins 1 heure avant de l&#39;imagerie pour permettre au système et lasers stabilisation complète. Chargez le petit insert en scène de plat sur la scène chauffée à préchauffer. <ol><li> Allumez le poste de travail du contrôleur maître. </li><li> Allumez le workstat de traitement d&#39;imageion. </li><li> Mettez le refroidisseur de la caméra située sur le sol à l&#39;extérieur de l&#39;enceinte du microscope. </li><li> Allumez toutes les caméras sCMOS (même si elles ne seront pas toutes utilisées). </li><li> Intérieur de l&#39;enceinte de laser et de l&#39;électronique, tournez sur: <ol><li> châssis de contrôleur de l&#39;instrument. </li><li> Châssis Nanomotion. </li><li> Jena contrôleur de Z piézoélectrique. </li><li> Tous les contrôleurs de moteur 4 galvanomètre. </li><li> Primaire module de commande de laser. </li><li> Secondaire module de commande de laser. </li><li> Tous les postes de travail de la caméra. </li><li> Poste de travail OMXIC. </li></ol></li><li> Sur le poste de contrôleur de maître, ouvrez le logiciel OMX en cliquant sur l&#39;icône. Définissez le chemin de fichier pour l&#39;enregistrement des données dans un dossier de données approprié. </li><li> Pour initialiser le matériel, allez dans le menu Matériel, sélectionnez Matériel et cliquez sur le bouton Redémarrer matériel. Fermer la fenêtre. </li><li> Lancer la Softworx software.Turn sur les lasers nécessaires pour les expériences (488 nm). </li><li> Allumez l&#39;interrupteur à clé pour le verrouillage de sécurité laser. </li><li> S&#39;assurer que le tiroir de filtre dichroïque correcte est insérée sous l&#39;objectif. Pour la GFP, c&#39;est l&#39;étalon (ou fixe) tiroir. </li><li> Dans OMX SF, allez dans le menu Fichier, choisissez Paramètres, puis sélectionnez le tiroir fixe dans le menu déroulant tiroir. Fermer la fenêtre. </li><li> Procédez comme suit à partir de l&#39;écran principal du logiciel, dans la section Paramètres de lumière: <ol><li> Activez l&#39;appareil photo approprié pour le laser d&#39;excitation et un filtre d&#39;émission (FITC) caméra de la sélection du canal. </li><li> Vérifiez le mode d&#39;image est réglé sur séquentielle. </li><li> Vérifiez le Chemin de Lumière est situé à SI. </li><li> Vérifiez le mode est réglé à 95 MHz. </li><li> Vérifiez le laser 488 est sélectionné dans l&#39;excitation. </li><li> Réglez le <strong&gt; Taille de 512 x 512 pour la taille de la fenêtre et Binning de 1 x 1. </li></ol></li><li> Dans l&#39;onglet de l&#39;expérience, assurez-Type est défini à l&#39;IS dans le menu déroulant. </li><li> Assurez sectionnement est activé et que l&#39;espacement de la section optique est placé à 0,125. </li><li> Assurer le point de mise au point au moment où débute balayage est moyenne. </li></ol></li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Appliquer une goutte d&#39;huile à la partie supérieure de l&#39;objectif. 37 ° C, l&#39;huile de départ recommandée a un indice de réfraction de 1,518 pour correspondre au mieux l&#39;indice de réfraction du coussin de gel utilisé pour monter les cellules bactériennes à 37 ° C (voir l&#39;étape 1.1.3). </li><li> Placer le plat échantillon de Pétri contenant les cellules préparées dans l&#39;encart de la scène et couvrir avec le couvercle de chauffage circulaire. Abaissez la scène jusqu&#39;à ce que l&#39;huile atteigne le fond dele plat échantillon Petri. </li><li> Laisser le plat à la chaleur s&#39;équilibrer pendant 15 min dans le stade. Utilisation d&#39;un réglage d&#39;exposition faible de 5 ms ou moins (situé dans la section Paramètres de lumière), se concentrer sur l&#39;échantillon en utilisant les contrôles de la scène de positionnement nanométrique (dZ, situé dans la section Nano positionnement). Concentrons de haut en bas à travers l&#39;échantillon pour déterminer si la lumière est répartie uniformément au-dessus et en dessous du plan focal échantillon. Si la fonction d&#39;étalement de point n&#39;est pas encore (aberration sphérique), nettoyer le fond de la cuvette porte-échantillon et l&#39;objectif avec du chloroforme. Changer l&#39;huile et répétez cette étape jusqu&#39;à ce qu&#39;une correspondance n&#39;est trouvée entre l&#39;huile et l&#39;indice de réfraction échantillon pour minimiser l&#39;aberration sphérique. </li><li> Utilisation de 0,5 um dZ tailles de pas, marquer le haut et le bas de la pile d&#39;images. Retour à la moyenne de l&#39;échantillon. Cliquez sur le bouton Obtenir épaisseur dans l&#39;onglet de l&#39;expérience pour définir l&#39;épaisseur de l&#39;acquisition de l&#39;échantillon. Keep la hauteur de la pile à un minimum tout en veillant à ne pas couper le haut et le bas des Z-anneaux. Les épaisseurs typiques pour B. les échantillons sont subtilis 2-3 um. </li><li> Déterminer la valeur maximale de l&#39;intensité (Max) de l&#39;image de l&#39;échantillon avec les réglages d&#39;exposition et T% actuels. Cette valeur se trouve en dessous de la fenêtre d&#39;image. Pour l&#39;imagerie time-lapse, ajuster l&#39;exposition et% T pour obtenir une intensité maximale de 1,100-1,400 fond au-dessus de l&#39;image. Un minimum d&#39;intensité de fond au-dessus de 1000 est requise pour obtenir une reconstruction d&#39;image. Pour une image unique, augmenter l&#39;intensité maximale pour 4000-5000. </li><li> Activez la section Time-lapse dans l&#39;onglet de l&#39;expérience. Réglez le taux de trame requise et le temps total. Dans un fichier de données, entrez un nom de fichier approprié. Cliquez sur le bouton Exécuter pour commencer l&#39;acquisition d&#39;image. Remarque: L&#39;acquisition des images est terminé lorsque le gbar reen Progrès est terminé et un fichier journal apparaît pour l&#39;ensemble du dossier de données appropriée des données. </li></ol> 4 Vérification de la qualité des données <ol><li> Au début de l&#39;acquisition de l&#39;image, noter la valeur d&#39;intensité maximum de l&#39;image au début de l&#39;acquisition de l&#39;image de la première trame de la série chronologique. A la fin de l&#39;acquisition de la première image, vérifier qu&#39;il n&#39;y a pas eu une baisse de plus de 10% de l&#39;intensité du signal à travers le z-stack pour cette première image. S&#39;il n&#39;y a plus de ce niveau de photoblanchiment dans le premier point de temps, les données à travers les séries chronologiques seront de qualité insuffisante pour l&#39;analyse et l&#39;acquisition de séries temporelles peuvent être arrêtés. </li><li> A la fin de l&#39;acquisition de la série de temps, ouvrir le fichier image brute résultante avec .dv suffixe et de vérifier la diminution de l&#39;intensité de signal maximum depuis le début de la série temporelle de l&#39;image finale. Jeter les points dans le temps où il a abeillen plus de 30% photoblanchiment. </li></ol> 5. images Reconstruction 3D-SIM <ol><li> Dans le menu Processus, activer la fenêtre SI reconstruction. Utilisez les paramètres pré-existantes pour tous les paramètres. </li><li> Activez le bouton Utiliser la Manche de la FTO spécifique, et vers le jeu de filtre standard. Activez l&#39;utilisation spécifique du canal KO angles bouton et sélectionnez le jeu de filtre standard. </li><li> Faites glisser et déposez le (.dv) fichier brut dans l&#39;espace du fichier d&#39;entrée. Cliquez sur Créer. Le fichier de sortie aura le même nom que le fichier d&#39;entrée avec _SI ajouté à la fin. Remarque: Ce processus de reconstruction peut être exécuté comme une tâche en utilisant la fonction Générateur de tâches dans le menu du processus si plusieurs fichiers doivent être traitées. </li></ol> 6. exportation et l&#39;analyse des données <ol><li> Utilisez Imaris de visualiser des images en 3D en mode et ex dépasserdonnées d&#39;image portuaires comme tiff (300 dpi) ou des fichiers avi (pas de compression). mesures de taille dans Imaris peuvent être effectuées à l&#39;aide de l&#39;outil de mesure en mode surpasser. </li><li> Génération parcelles d&#39;intensité 3D de l&#39;anneau Z de 3D-SIM données d&#39;image: <ol><li> Examiner la répartition des FtsZ autour de l&#39;anneau de Z et de créer des tracés d&#39;intensité 3D <ol><li> Ouvrir un fichier d&#39;image 3D pour afficher les z-tranches individuelles. Utilisez l&#39;outil volume de téléspectateur, situé sous l&#39;onglet Affichage du menu pour recadrer une région d&#39;intérêt. </li><li> Entrez le numéro de la fenêtre pour cette image 3D dans la fenêtre de saisie et entrer un nouveau et inutilisé nombre de fenêtre dans la fenêtre de sortie. Le bouton de sélection région deviendra disponible pour la culture d&#39;un anneau Z individu d&#39;intérêt de l&#39;original 40 x 40 um champ de vision. </li><li> Ajuster l&#39;axe désiré et du degré de rotation de la patte de rotation. Cliquez sur le bouton Exécuter. Faites défiler le volume pour obtenir le point de vue désiré de l&#39;anneau Z. </li><li> Utilisez l&#39;outil Inspecteur de données et d&#39;ajuster til les dimensions de colonnes / lignes pour créer une nouvelle région d&#39;intérêt autour d&#39;un cycle individuel Z. Cliquer sur le centre de l&#39;image à la position de cette nouvelle région d&#39;intérêt. Les données d&#39;image de texte est généré automatiquement un tableau qui montre l&#39;intensité de fluorescence de chaque pixel à l&#39;intérieur de la région d&#39;intérêt. </li><li> Cliquez sur le bouton 3D graphique pour afficher d&#39;abord le tracé de l&#39;intensité. </li><li> Alternativement, les données d&#39;image de texte peuvent être exportés en cliquant sur le bouton de sauvegarde de données de tableau dans le menu fichier. </li><li> Copiez les données d&#39;image à partir du fichier texte enregistré dans une nouvelle feuille de calcul. Sélectionnez toutes les cellules dans la feuille de calcul et de créer un nouveau graphique 3D-Surface. Formater la 3D graphique de terrain de l&#39;intensité de la publication. </li></ol></li><li> Pour la lecture répétée de données time-lapse étapes 6.2.1.1 - 6.2.1.7 sur chacun des différents points dans le temps à partir du fichier d&#39;image 3D. </li></ol></li><li> Suivi Intensité de fluorescence moyenne au fil du temps <ol><li> Utilisez les données d&#39;image de texte pour suivre les fluorescenCE intensité au fil du temps dans une région d&#39;intérêt. </li><li> Sélectionner les cellules qui correspondent à la région d&#39;intérêt. </li><li> Calculer l&#39;intensité de fluorescence moyenne à chaque point de temps pour cette région d&#39;intérêt. </li><li> Utilisez les valeurs moyennes d&#39;intensité de fluorescence pour générer un graphique distinct. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Cell+Division+The+Mechanism+and+Its+Precison.">Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison.</a> Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19, 780-782 (1994).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).</li><li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Diffraction+Barrier+in+Fluorescence+Microscopy+by+Optical+Shelving.">Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving.</a> Phys Rev Lett. 98, 218103 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+modulated+excitation+microscopy:+Improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).</li><li>Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+enables+3D+STED+microscopy+in+aberrating+specimens.">Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens.</a> Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).</li><li>Urban, N. i. c. o. l. a. i. . T., Willig, K. a. t. r. i. n., Hell, S. t. e. f. a. n. . W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices.">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).</li><li>Strauss, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-SIM+Super+Resolution+Microscopy+Reveals+a+Bead-Like+Arrangement+for+FtsZ+and+the+Division+Machinery+Implications+for+Triggering+Cytokinesis.">3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis.</a> PLoS biol. 10, e1001389 (2012).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E+coli+cell+fission.">Advances in understanding E coli cell fission.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+physics+of+FtsZ+assembly+and+force+generation.">Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+in+Bacterial+Cytokinesis+Cytoskeleton+and+Force+Generator+All+in+One.">FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).</li><li>Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-ring+force+and+cell+shape+during+division+in+rod-like+bacteria.">Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Contractile+FtsZ+Rings+in+Liposomes.">Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).</li><li>Murphy, G. E., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography.">Electron cryotomography.</a> BioTechniques. 43, 413-415 (2007).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+plasmid-based+system+that+allows+rapid+generation+of+tightly+controlled+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus.">A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus.</a> Microbiology. 157, 666-676 (2011).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Dissection+of+Coordinated+Events+during+Malaria+Parasite+Invasion+of+the+Human+Erythrocyte.">Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte.</a> Cell Hos., &amp; Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).</li></ol>

This publication is sponsored by GE Healthcare.

Imagerie des cellules vivantes fluorescent est un outil puissant qui permet l&#39;observation de changements dynamiques dans les cellules au cours du temps. Imagerie en temps réel de la biologie de la cellule bactérienne a été difficile en raison de la petite taille de cellule et la capacité des cellules bactériennes pour résister à une exposition répétée à la lumière d&#39;excitation réduite. F3d-SIM a élargi les outils disponibles pour interroger toute la biologie cellulaire, mais il est nécessaire d&#39;effectuer attentivement cette technique comme des artefacts peuvent être introduites si elles sont mal mises en œuvre. Il ya un certain nombre de considérations importantes pour la bonne utilisation de cette technique. Comme il s&#39;agit d&#39;une méthode d&#39;imagerie de fluorescence à champ large qui repose sur l&#39;utilisation de la fonction d&#39;étalement de point de lumière émis l&#39;, l&#39;indice de réfraction inadéquation et l&#39;aberration sphérique de la lumière émise doit être évité afin de permettre la reconstruction d&#39;image précise. L&#39;utilisation de lamelles de 0,17 mm d&#39;épaisseur d&#39;une haute qualité pour éviter les variations de l&#39;intensité du signal en raison de la variabilité de l&#39;épaisseur du verre les couvertureslèvre est fortement recommandé. Il est extrêmement important d&#39;évaluer soigneusement l&#39;aberration sphérique de la lumière émise pendant les étapes initiales de toutes les expériences et ajuster l&#39;immersion indice de réfraction de l&#39;huile au besoin. Cela peut varier de jour en jour car il dépend à la fois la température et le milieu de montage / substrat de l&#39;échantillon. L&#39;utilisation de l&#39;huile incorrect entraînera inférieur reconstruction des images avec des artefacts, tels que des halos et des signaux d&#39;écho. A la fin du processus de reconstruction d&#39;image, pour chaque phase, une mesure de la qualité de la reconstruction peut être obtenue par le &quot;meilleur ajustement pour l&#39;angle kO&quot; pour chaque phase / angle de l&#39;illumination. Si cette valeur est inférieure à 1 pour chaque angle, la qualité de la reconstruction sera probablement élevé. Si cette valeur est supérieure à 6, il est plus probable que l&#39;image reconstruite contiendra des artefacts. Artefacts communs comprennent i) l&#39;apparition de bandes dans l&#39;image qui correspondà l&#39;un des angles de la grille. Cela peut entraîner à partir du signal de plus faible que l&#39;angle de la grille; ii) nimbe autour de structures. Cela peut résulter de niveaux très inégaux de signaux de structures lumineuses par rapport aux structures environnantes, un décalage de l&#39;indice de réfraction de l&#39;huile et de l&#39;échantillon ou peut être due à des structures dans l&#39;image de trop amorphe et ne contenant pas assez de «structure» d&#39;être reconnu par l&#39;algorithme; iii) «rayon de miel» qui résulte d&#39;un faible rapport signal bruit dans l&#39;image, généralement due à un signal de fond élevé; iv) les structures qui sont étirées / allongés dans xy qui peuvent être dues à indice de réfraction non-concordance de l&#39;huile et de l&#39;échantillon. Cet artefact est difficile de discerner pour un utilisateur inexpérimenté. Il est recommandé que les nouveaux utilisateurs consultent un chercheur expérimenté SIM pour obtenir des conseils sur l&#39;interprétation des images et l&#39;analyse quand on commence à utiliser cette technique. Comme avec toutes les expériences d&#39;imagerie des cellules vivantes fluorescentes, il est l&#39;importationant à équilibrer soigneusement l&#39;entrée de l&#39;énergie d&#39;excitation afin de minimiser le degré de photoblanchiment et la phototoxicité des cellules avec signal d&#39;émission suffisante nécessaire pour reconstruire des images avec artefact minime. Photoblanchiment excessive (supérieure à 30% sur une acquisition z-stack) aboutit à un modèle de segmentation dans l&#39;image reconstruite. Avec l&#39;utilisation de caméras sCMOS, images super-résolution peuvent être reconstruites avec succès à partir d&#39;images brutes avec le signal aussi faible que 1 000 chefs-dessus du fond de l&#39;émission. Cela peut permettre à de très courtes durées d&#39;exposition réduisant ainsi photoblanchiment et permettant la capture rapide pour chaque trame. Il augmente également la quantité de temps entre les trames pour les cellules de se remettre de l&#39;apport d&#39;énergie d&#39;excitation. En outre, comme le temps de capture pour chaque image individuelle peut être très court, le degré de l&#39;artefact introduit par &quot;flou de mouvement&quot; lors d&#39;une saisie individuelle est réduit par l&#39;utilisation de cette méthode. Cette variation de la 3D-SIM offre un certain nombre d&#39;autres avantages par rapport aux autres technologies disponibles de supermarchés et l&#39;imagerie haute résolution pour l&#39;imagerie en direct par les biologistes cellulaires bactériennes. L&#39;augmentation de 2 fois de la résolution dans toutes les trois dimensions et la capacité de l&#39;image allant jusqu&#39;à 30 um dans un échantillon permet l&#39;imagerie de cellules bactériennes (et de mammifères) ensemble au cours d&#39;une expérience. Des techniques telles que la localisation de molécules simples qui sont couramment effectuées dans l&#39;onde évanescente peut pas atteindre la profondeur de pénétration dans un échantillon, et ne proposent pas de renseignements sur des cellules entières. Les progrès récents qui permettent plus élevés des profondeurs d&#39;échantillonnage pour cette technique peut entraîner une meilleure résolution axiale de cellules entières. En outre, les techniques de localisation de molécule unique qui nécessitent des milliers d&#39;images brutes à acquérir sont également limitées dans le taux de trame qui peut être capturé et peut exiger compromis entre le taux de trame de capture et la résolution spatiale atteint ultime, comme la résolution spatiale dépend de la nombre de veillents enregistrées dans un espace défini. La diminution du nombre d&#39;images capturées se traduira par une résolution spatiale inférieure mais peut être suffisante pour atteindre la résolution temporelle nécessaire pour le processus biologique d&#39;intérêt. La quantité de temps entre les trames de recouvrement peuvent aussi devoir être augmentée pour réduire au minimum la phototoxicité des cellules vivantes en limitant ainsi la durée et la fréquence à laquelle la série peut être obtenu. Des techniques à haute résolution telles que la microscopie électronique (EM) ou électronique cryotomography (ECT) qui offre une meilleure résolution sur 3D-SIM (et d&#39;autres techniques de microscopie optique de super-résolution), mais doivent être effectuées sur des échantillons fixés. La fixation et le traitement peuvent introduire des artefacts et l&#39;absence d&#39;étiquetage peuvent rendre l&#39;interprétation difficile. ECT sans étiquette manque de contraste et peut atteindre des profondeurs de pénétration de l&#39;échantillon de l&#39;ordre de 500-200 nm 24, même si la protéine d&#39;intérêt peut être identifié, la structure de la protéine dans une cellule entière bactérienne ne peut être observée.Même lorsque l&#39;étiquetage peut être utilisé dans EM, comme avec immunologique, la formation d&#39;image est effectué uniquement en 2D. 3D est seulement réalisable avec sectionnement mince et la reconstruction de calcul des sections. Le sectionnement mince nécessite un technicien expérimenté mais peut être problématique et conduire à l&#39;artefact. Avec des cellules vivantes ou fixées, 3D-SIM n&#39;a pas besoin d&#39;être incorporé de manière spécifique et les cellules peuvent être rapidement préparés pour l&#39;imagerie dans un état proche natif. Cette méthode est relativement facile à mettre en œuvre par les chercheurs ayant une expérience minimale en microscopie à fluorescence. Expériences peuvent être réalisées dans les médias qui soutiennent la fonction des cellules saines tant qu&#39;il n&#39;a pas fluorescent ou générer excessive signal de fond. Pour les cellules bactériennes, ce qui peut permettre l&#39;utilisation de nombreux types de complexes et des milieux minimaux ou l&#39;utilisation de supports solides ou semi-solides à contrôler la motilité des cellules bactériennes. De nombreux biologistes qui ont déjà modifiés protéine fluorescente (FP) fusions et testé la fonctionnalité deces fusions peuvent prendre jusqu&#39;à cette technologie rapidement sans génie et la validation de nouvelles fusions PF photo-activables. Nous avons trouvé, à titre d&#39;observation générale, que S. aureus était plus sensible à photoblanchiment lors de l&#39;imagerie avec des fusions de PF que B. subtilis. Grâce à nos méthodes 3D-SIM d&#39;origine, où le motif de la grille a été généré par un réseau physique, nous n&#39;avons pas pu réaliser une imagerie des cellules vivantes avec un certain nombre de S. fusions aureus PF. Cependant, avec cette méthode F3D-SIM de pointe, nous avons réussi à l&#39;image de ces fusions de PF et de réaliser des séries courtes de temps pour capturer la dynamique de ces protéines marquées. C&#39;est probablement en raison des temps d&#39;exposition réduits nécessaires pour l&#39;imagerie et le temps entre les cadres a augmenté pour la récupération des cellules. OMX Blaze 3D-SIM est une technologie disponible sur le marché qui peuvent être assez facilement mis en œuvre dans un seul laboratoire ou un centre d&#39;imagerie de base. Des précautions doivent être prises pour effectuer la technique pour éviter les artifaits en raison de la préparation des échantillons pauvres ou pauvres capture d&#39;image. Une fois que la technique est maîtrisée, les études de la structure des protéines et de la dynamique de petits organismes tels que les bactéries peuvent être effectuées en fluorescence à une ou plusieurs couleurs.

Un certain nombre de différentes technologies d&#39;imagerie ont été utilisées au cours des années à étudier les bactéries, y compris divers électronique et des techniques de microscopie optique. Alors que la microscopie électronique offre une très haute résolution, soit une baisse de l&#39;ordre du nanomètre, la nécessité d&#39;un vide et l&#39;utilisation d&#39;agents de contraste est limitée à cette technique échantillons fixés et intégrés. Les artefacts peuvent également être introduits en raison de longue préparation de l&#39;échantillon et un praticien expérimenté est nécessaire pour préparer les échantillons, et d&#39;analyser et d&#39;interpréter les images obtenues. La microscopie optique présente les avantages de simplifier la préparation des échantillons et l&#39;application de plusieurs étiquettes avec une facilité relative par rapport à la microscopie électronique. En utilisant des protéines fluorescentes et des conjugués de colorant, la capacité d&#39;étudier les cellules vivantes avec la microscopie de fluorescence est également possible. Avec l&#39;amélioration de la stabilité du fluorophore et la protéine fluorescente taille / la structure conduisant à une diminution de la toxicité cellulaire, ainsi que des progrès dans la détection caméra technlogie, la microscopie de fluorescence à l&#39;aide à champ large et systèmes d&#39;imagerie confocale a considérablement élargi notre compréhension de la dynamique spatiale des cellules. Grâce à ces techniques, notre connaissance de la cellule bactérienne au cours des 20 dernières années a beaucoup progressé à une vue beaucoup plus détaillée qui révèle un niveau élevé de l&#39;organisation structurelle et de protéines dans la cellule bactérienne 1. Cependant, les méthodes classiques de la microscopie optique de diffraction sont limitées, ce qui signifie que la résolution intrinsèque est d&#39;environ la moitié de la longueur d&#39;onde de la lumière d&#39;excitation utilisée. Par conséquent, même avec le système le plus optimal en microscopie optique conventionnelle, la meilleure résolution latérale est d&#39;environ 220 à 250 nm et la résolution axiale est d&#39;environ 500 nm (pour une revue voir Schermelleh et al. 2). Pour les biologistes cellulaires bactériennes, en particulier, ce qui limite encore fortement notre compréhension de l&#39;organisation spatiale de ces cellules minuscules; étant seulement 1-2 pm de diamètremètre et 1-10 mm de longueur. Il ya aussi la nécessité pour les techniques de haute résolution qui peuvent être effectuées sur des cellules vivantes où le comportement dynamique spatiale d&#39;une protéine peut être analysé afin de compléter les données in vitro. Au cours de la dernière décennie, plusieurs techniques d&#39;imagerie par fluorescence super-résolution ont été développés. Super-résolution microscopie décrit les techniques d&#39;imagerie qui au moins le double de la résolution latérale obtenue par microscopie optique conventionnelle, permettant ainsi de surmonter la barrière de diffraction. Ces techniques de manipuler l&#39;éclairage et / ou l&#39;analyse de la lumière émise de créer de réelles augmentations de la résolution apparente. Il existe actuellement trois grands types de techniques de super-résolution - i) l&#39;émission stimulée épuisement microscopie 3 (STED); ii) une seule molécule microscopie localisation, y compris des techniques telles que la microscopie localisation photoactivation 4,5 (PALM), la microscopie optique de reconstruction stochastique <sup&gt; 6 (STORM), STORM directe 7 (dSTORM), et l&#39;état fondamental épuisement de molécule individuelle rendement de 8 (GDSIM); et iii) un éclairage structuré microscopie 12.09 (SIM). Techniques de localisation de molécule unique offrent les plus fortes hausses de la résolution latérale, vers le bas pour entre 10-40 nm dans des échantillons biologiques. Dans de nombreuses implémentations de simple microscopie localisation molécule, la profondeur de l&#39;échantillonnage est limitée à l&#39;onde évanescente et les mises en œuvre initiales de STED ont été également limitée dans la profondeur d&#39;échantillonnage. Toutefois, des améliorations, des progrès récents, tels que l&#39;utilisation de l&#39;optique adaptative, l&#39;exploitation de l&#39;astigmatisme dans la fonction d&#39;étalement de point à différents points focaux, la détection multi-plan et l&#39;aide de deux objectifs de déduire la position axiale de la lumière émise ont vu à la fois axial résolution et d&#39;échantillonnage des profondeurs à la fois molécule STED et localisation unique 13,14. taux d&#39;acquisition de données pour STED et techniques de localisation de molécule uniquesont également relativement lent en raison du grand nombre d&#39;images qui doivent être acquises pour la résolution maximale (jusqu&#39;à 50 000 pour les techniques de localisation). Cette acquisition de données lente ne se prête pas à l&#39;imagerie des échantillons vivants sans modifications personnalisées qui sont souvent assez cher. Ces deux techniques sont actuellement parfaitement adaptés pour des échantillons fixés (pour revue, voir 2,15), cependant, beaucoup de travail est fait pour remédier à cette limitation. Microscopie tridimensionnelle d&#39;illumination structurée (3D-SIM) est une technique à grand champ qui améliore à la fois la résolution latérale et axiale résultant des résolutions de l&#39;ordre de 110 et 280 nm, respectivement. La profondeur de l&#39;échantillonnage est de 30 um à partir de la lamelle couvre-objet, ce qui permet pour l&#39;imagerie de cellules entières. La variation de 3D-SIM développé par Sedat, Agard, et Gustaffsson sur l&#39;optique de microscope de laboratoire (OMX) plate-forme consiste à éclairer l&#39;échantillon avec un motif de grille connue qui est déplacé dans 15 différentspositions dans chaque plan z 9-11. Les franges dans les effets de moiré résultant qui sont créés dans l&#39;espace de fréquence en dehors de la région observable sont mesurés. L&#39;information à partir de l&#39;espace des fréquences est reconstruit calcul pour générer une image visible de super-résolution 10,11. La vitesse relative à laquelle les premières images peuvent être acquises en utilisant cette technique permet l&#39;imagerie des cellules vivantes. Cependant, il est important de noter que pour les processus biologiques qui se produisent sur une échelle de temps de quelques secondes, le taux des images brutes d&#39;acquisition est encore trop lente pour capturer les changements dynamiques. Pour des séries chronologiques avec un taux de secondes de capture, l&#39;acquisition répétée sans temps de récupération suffisant peut conduire à la phototoxicité et photoblanchiment, en particulier lors de l&#39;imagerie en direct de petites cellules bactériennes. Pour surmonter ces problèmes, les progrès récents pour rapide 3D-SIM (F3d-SIM) ont été développés. Nous décrivons ici un connu sous le nom OMX Blaze 16 c&#39;était introdu à la fin de 2011, ce qui crée de la technologie de l&#39;éclairage à motif sans l&#39;utilisation d&#39;un réseau physique que celui utilisé dans les systèmes antérieurs. L&#39;utilisation d&#39;interférence des faisceaux lumineux et de nouvelles technologies de l&#39;obturateur permet de créer de la lumière structurée sur l&#39;échantillon d&#39;une façon très rapide. La vitesse d&#39;acquisition des images a été encore améliorée avec l&#39;introduction de scientifiques complémentaires semi-conducteurs d&#39;oxyde de métal (sCMOS) caméras, surtout lorsqu&#39;on les compare aux caméras EMCCD existants. Ces changements ont donné lieu à un taux d&#39;acquisition d&#39;image possible d&#39;une image par seconde pour une profondeur de 1 um (512 x 512 pixels, 9 z tranches) échantillonnage, permettant le suivi des changements dynamiques dans les cellules qui se produisent en quelques secondes 16. La diminution de l&#39;exposition (excitation) fois apparents aux cellules en utilisant cette méthode permet de navigateur série de temps prolongée pour être capturée ou une augmentation du taux de captage direct. Ici, nous décrivons l&#39;application de la microscopie F3d-SIM pour examine la structure et le mouvement dynamique de l&#39;anneau cytokinétique Z dans les cellules de deux espèces bactériennes: l&#39;organisme modèle Bacillus subtilis en forme de tige et l&#39;agent pathogène humain cocciforme Staphylococcus aureus. FtsZ est une protéine du cytosquelette tubuline qui joue un rôle clé dans la division cellulaire chez les bactéries 17,18. Il se localise sur le site de division de recruter au moins 20 autres protéines de la division, en formant le dispositif de division 17,18, et est censé fournir la force de constriction des cellules 19-23. Ce procédé révèle que FtsZ est distribué de façon hétérogène dans le cycle de Z dans les deux organismes dans un agencement en forme de bourrelet; résoudre le problème de longue date si l&#39;anneau Z est une bande continue et uniforme autour de la cellule, comme visualisé par microscopie de fluorescence à champ large classique, ou une structure discontinue comme suggéré par cryo-tomographie (ECT) 24. Nous montrons comment la capacité de la 3D-SIM peut améliorer considérablement l&#39;examen de l&#39;espace minuscule (1diamètre um) des cellules rondes comme S. aureus qui divisent en trois plans perpendiculaires consécutives (x, y, z). études de time-lapse en utilisant ces techniques montrent que la structure de l&#39;anneau Z est dynamique, avec des changements de l&#39;organisation bruts dans l&#39;anneau, plutôt que les molécules FtsZ entrant et sortant d&#39;un échafaudage fixe 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Agarose I (Biotecnology grade)</td>
			<td style="width:161px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">0710-500G</td>
			<td style="width:167px;">Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64)</td>
			<td style="width:161px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T-13320</td>
			<td style="width:167px;">Lipophylic dye used for staining cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">1.5 ml microtube, graduated Natural</td>
			<td>Scientific specialties Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1210-00</td>
			<td style="width:167px;">Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Luria broth base, Miller&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">241420</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions. Add 2%?? after autoclaving&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">210932</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Adhesive frame</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ABGAB-0577</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microscope cover glass</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">111512-9</td>
			<td style="width:167px;">22x22 No 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom</td>
			<td style="width:161px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td style="width:167px;">Known as FluoroDish with this company. Dish: &#216;35mm, Glass: &#216; 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0378-25G</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lincomycin hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L6004-5MU</td>
			<td style="width:167px;">Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Erythromycin&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Boehringer Mannheim GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12390120-14</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Combined Orbital/Linear Shaking waterbath&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Grant scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">OLS-200</td>
			<td style="width:167px;">Shaking speed used for cultures: 215 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">UV visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">UV-1601</td>
			<td style="width:167px;">600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td style="width:167px;">Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15502-10G</td>
			<td style="width:167px;">Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">softWoRx software</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;">version 5.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris data analysis software</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td>
			<td style="width:119px;">version 7.0.0</td>
			<td style="width:167px;">Matlab XTensions included</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Blaze module fitted on OMX V3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss Axioplan 2&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)

Imagerie d&#39;échantillons biologiques à l&#39;aide de la microscopie à fluorescence a considérablement avancé avec les nouvelles technologies pour surmonter la barrière de la résolution de la diffraction de la lumière qui permet de super-résolution des échantillons vivants. Il existe actuellement trois grands types de techniques de super-résolution - stimulé l&#39;épuisement d&#39;émission (STED), la microscopie de localisation de molécule unique (y compris des techniques telles que PALM, STORM, et GDSIM) et la microscopie illumination structurée (SIM). Bien que les techniques de localisation STED et une seule molécule montrent les plus fortes hausses de la résolution, ils ont été plus lents à offrir des vitesses accrues d&#39;acquisition d&#39;image. Tridimensionnelle SIM (3D-SIM) est une technique de microscopie de fluorescence grand champ qui offre un certain nombre d&#39;avantages par rapport à la fois simple molécule localisation et STED. La résolution est améliorée, avec des résolutions axiales et latérales typiques de 110 et 280 nm, respectivement, et la profondeur de prélèvement maximale de 30 um à partir de la lamelle couvre-objet, ce qui permet del&#39;imagerie de cellules entières. Les récents progrès (rapide 3D-SIM) dans la technologie d&#39;augmenter le taux d&#39;images brutes de capture permet de capturer rapidement des processus biologiques qui se produisent en quelques secondes, tout en réduisant considérablement photo-toxicité et photoblanchiment. Nous décrivons ici l&#39;utilisation d&#39;un tel procédé à l&#39;image des cellules bactériennes hébergeant la protéine marquée par fluorescence cytokinétique FtsZ à montrer comment les cellules sont analysées et le type d&#39;information unique, que cette technique peut apporter.

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-résolution d&#39;imagerie de l&#39;Anneau Z cytokinétique en utilisant des bactéries vivantes 3D structuré rapide Illumination Microscopy (F3d-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

super-resolution-imaging-cytokinetic-z-ring-live-bacteria-using-fast

Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

19.8K vues.  University of Technology, Sydney. Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring. 

Vidéo: Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Recherche

Biologie

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open Source Analyse unique pour particules super-résolution Microscopie avec VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

État fondamental l’appauvrissement Super-résolution imagerie dans les cellules de mammifères

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Application de la microscopie vitesse haut débit Super-résolution en direct cil primaire

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux pour la microscopie d’illumination structurée time-lapse

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...