Parce que les bactéries sont si petites, les gens oublient souvent qu’ils sont des objets tridimensionnels. Notre protocole permet la reconstruction précise des formes des cellules plates et courbes. Ce protocole ne nécessite que de légères modifications à un microscope standard et ils sont facilement disponibles dans les scripts MATLAB.
Avant de commencer l’expérience placer deux piles de chacun des trois 20 par 20 millimètres de couverture glisse sur les extrémités opposées d’une seule diapositive microscope en verre. Pipette 200 microlitres de solution de garniture d’agarose sur la glissière et placent immédiatement et fermement une deuxième glissière sur la pile des glissements de couverture pour aplatir l’agarose. Après avoir permis à l’agarose de se solidifier pendant environ une minute à température ambiante, glissez soigneusement de la glissière supérieure et utilisez une grande extrémité d’une pointe de pipette de 200 microlitres pour découper les tampons individuels de cinq millimètres de diamètre du gel.
Lorsque tous les tampons ont été obtenus pipette la culture cellulaire E.coli plusieurs fois pour perturber les touffes de cellules et de s’assurer que les cellules sont réparties de façon homogène avant d’ajouter un microlitre de sous-culture sur chaque pad. Après avoir laissé sécher l’air des échantillons pendant cinq à dix minutes, confirmez que les gouttelettes ont été complètement absorbées dans les coussinets avant de placer un couvercle sur les coussinets. Ensuite, utilisez un coton-tige pour brosser doucement un scellant approprié autour du bord de la feuille de couvercle, en prenant soin de garder le scellant loin du haut de la feuille de couverture.
Immédiatement après l’étanchéité, placez la glissière sur une scène de microscope et après cinq minutes d’équilibrage thermique, utilisez les roues de mise au point au microscope pour mettre le milieu d’une cellule au point. Dans le logiciel de microscope associé sous ND Acquisition, cochez la case Z pour acquérir une pile Z et cliquez sur le bouton Accueil pour définir le milieu de la cellule comme point de départ. Réglez la taille step à 0,1 micromètre et la portée à quatre micromètres et assurez-vous que l’appareil Z est réglé sur la scène Piezo.
Il est essentiel qu’il y ait suffisamment de flou sur le dessus et le bas de la cellule de sorte que la cellule est presque indiscernable de l’arrière-plan. Réglez les canaux fluorescents sous la fenêtre lambda aux paramètres des molécules fluorescentes en cours d’image et confirmez que l’ordre de l’expérience est réglé sur lambda afin qu’une pile Z complète soit obtenue dans chaque canal de couleur avant de passer. Cliquez ensuite sur Exécuter dès maintenant pour commencer l’acquisition de l’image.
Lorsque toutes les images ont été acquises ouvrir les fichiers dans un logiciel d’analyse d’image approprié. Dessinez une boîte autour d’une cellule individuelle et dupliquez cette cellule deux fois, une fois pour chaque canal, en vous assurant que la case hyperstack duplicate est cochée, et changez le canal en une ou deux. Une fois que les deux piles sont disponibles, sélectionnez Images, Piles, Outils et Concatenate pour combiner les images.
Avec le canal protéique d’abord et le canal de forme en second. Après avoir sauvé la nouvelle image en tant que fichier TIFF faire un dossier à l’intérieur d’un dossier sur le bureau qui contient les images rogées et les cell_shape_settings_tri. fichier txt de shae-cellshape-public exampleData_tri.
Modifiez le cell_shape_settings_tri. fichier txt pour avoir les paramètres corrects pour l’expérience d’intérêt. Et exécutez la fonction Cell_shape_detector3dConvTriFolder avec la chaîne à l’emplacement du dossier suivie par le nombre de la cellule sur laquelle démarrer et le nombre de cellules qui doivent être exécutés.
Pour confirmer que les cellules ont été correctement reconstruites exécuter ScreenFits. Lorsque l’interface utilisateur graphique s’ouvre, cliquez sur le bouton Select Folder et sélectionnez le dossier avec les fichiers de données de reconstruction pour filtrer visuellement les reconstructions cellulaires individuelles. Pour toute cellule qui semble difforme ou qui n’a pas de couverture complète sélectionnez la boîte à côté de la reconstruction pour appendice FLAG au nom afin qu’il puisse être exclu de toute analyse en aval.
Exécuter l’enrichissementSmothingSpline pour créer un profil d’enrichissement de la concentration relative de la protéine d’intérêt en fonction de la courbure gaussienne à la surface. Sélectionnez ensuite chaque dossier avec le TRI qui vient d’être créé. fichiers tapis et sélectionnez le fichier de tapis courbe nouvellement créé.
Cette méthode est particulièrement utile lors du traitement des cellules courbes ou anormalement formées car une représentation 2D ne peut pas refléter la courbure des cellules avec précision. Dans cette expérience, une protéine de fusion fluorescente verte à la protéine bactérienne d’actine MreB a été générée pour étudier la localisation précise de la protéine d’actine dans les cellules sauvages et mutantes d’E.coli. En effectuant ces mesures en images capturées en 3D, les formes du type sauvage et des cellules mutantes rodZ ont pu être reconstruites.
La localisation de MreB a ensuite été déterminée pour être enrichie à de petites courbures gaussiennes, une caractéristique géométrique qui ne peut être mesurée en 3D d’une manière dépendante rodZ. N’oubliez pas de vous assurer que la pile Z est suffisamment grande pour que les cellules soient floues sur le dessus et le bas et que les cellules soient bien espacées les unes des autres. Nous montrons comment mesurer la localisation géométrique des protéines en 3D, mais d’autres informations peuvent être calculées à partir de ces données telles que la taille des assemblages de protéines tag.
