Grant: 5RO1GM086447-02.

1. Préparation des échantillons <ol><li> Inoculer milieu LB avec une seule colonie de la souche JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Cultivez la nuit dans un shaker à 37 ° C. </li><li> Diluer la culture 1:1000 dans M9 + minimes médias [sels M9, glucose 0,4%, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, acides aminés et vitamines MEM] et passer à la phase mi-log (DO600 = 0.2 à 0.3) en présence de chloramphénicol (150 ug / ml) à température ambiante (RT). </li><li> Provoquer la culture avec 20 uM d&#39;IPTG pendant 2 heures (voir note n ° 1). </li><li> Culture culot dans microcentrifugeuse (8.000 rpm, 1 min) et remettre en suspension dans un volume égal d&#39;M9 +; répétition. Après la remise en suspension seconde, poursuite de la croissance à la température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Fixer culture induite avec du paraformaldéhyde 4% dans du PBS (pH = 7,4) à température ambiante pendant 40 min. Culture Pellet et remettre en suspension dans un volume égal de PBS; répétition. Si l&#39;imagerie de cellules vivantes, sautez la fixation, la culture culot et remettre en suspension dans un volume égalde M9 - [sels M9, glucose 0,4%, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, Acides aminés MEM]; récidivistes. </li><li> Diluer perles d&#39;or 1:10 avec la culture remis en suspension. Appliquer l&#39;échantillon dans la chambre d&#39;imagerie préparé (voir étape 2.4). </li></ol> [1] Remarque: Le protocole d&#39;induction ci-dessus (étapes 1.1 à 1.3) a été optimisé pour le système d&#39;expression de la souche JB281. Conditions d&#39;induction détaillées peuvent varier pour d&#39;autres systèmes d&#39;expression ou protéines d&#39;intérêt. 2. Assemblée de la Chambre d&#39;imagerie <ol><li> Préparer une solution à 3% (p / v) d&#39;agarose à M9 -. Faire fondre l&#39;agarose à 70 ° C dans un bloc chauffant paillasse pendant 40 mn. Magasin d&#39;agarose fondu à 50 ° C pendant 5 heures. </li><li> Placer une lame de nettoyage microaqueduct dans la moitié supérieure de la chambre d&#39;imagerie avec les électrodes se faisant face vers le bas. Aligner le joint d&#39;étanchéité inférieur sur le coulisseau microaqueduct de manière à recouvrir les canaux de perfusion. </li><li> Appliquer ~ 50 pl de la fondue agarose vers le centre de la vitrediapositive. Immédiatement haut de la gouttelette gel d&#39;agarose avec un chiffon propre, sec lamelle. Laisser le gel se solidifier à la température ambiante pendant 30 min. <ol><li> Pour nettoyer des lamelles: organiser des lamelles dans un support en céramique et une sonication pendant 20 min à rotation bains d&#39;acétone, d&#39;éthanol et 1 M de KOH dans des bocaux en verre. Répétez cycle de trois fois, pour un total de 9 sonications, suivie d&#39;une sonication unique dH 2 O. Rangez les lamelles nettoyées en eau douce dH 2 O. Avant l&#39;utilisation, souffler lamelles sèches avec de l&#39;air filtré. </li></ol></li><li> Retirez délicatement la lamelle, laissant coussin de gel sur la diapositive microaqueduct. Ajouter immédiatement 1 ul d&#39;échantillon de culture cellulaire (voir l&#39;étape 1.6) vers le haut de la poche de gel. Attendre ~ 2 min, ce qui permet à la solution soit absorbée par le tampon de gel. Haut coussin de gel avec une vierge, lamelle sec. Assemblez la chambre d&#39;imagerie tout en suivant les instructions du fabricant. </li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Allumez le microscope, la caméra et le laser. Ouvrez MetaMorph douceware (Molecular Devices). </li><li> Placer appropriées d&#39;excitation / émission de filtres dans le trajet de formation d&#39;image (figure 1). </li><li> Définir des puissances laser et les paramètres d&#39;acquisition en conséquence. <ol><li> 488-nm laser = 15 mW (voir note n ° 2) </li><li> 561-nm laser = 75 mW </li><li> 405-nm laser = 2 mW ± filtre à densité neutre (Voir note n ° 3) </li></ol></li><li> Verrouiller chambre d&#39;imagerie dans l&#39;étage via l&#39;adaptateur étage complémentaire. </li><li> Désigner une région d&#39;imagerie appropriée (100x100 pixel) qui est homogène éclairé par les trois lasers. </li><li> Identifier une zone d&#39;échantillonnage qui contient des cellules et des marqueurs de confiance (billes d&#39;or) à proximité mais ne se chevauchent pas. </li><li> Focus sur la surface des cellules les plus proches de la lamelle. Acquérir une image à fond clair avec 50 ms de temps d&#39;intégration et de déplacer le focus 0,5 um dans l&#39;échantillon (Figure 3AI). </li><li> Acquérir ensemble l&#39;image de fluorescence verte avec l&#39;excitation de la 488-n<html> m laser en utilisant un temps de 50 ms intégration (Figure 3Aii). </li><li> Acquérir le streaming vidéo dans le canal rouge avec un éclairage continu à partir de 405-nm et 561 nm lasers. Pour les cellules fixes, un taux de 50 ms cadre est utilisé pour un total de 20.000 cadres (total ~ min 17) avec la puissance du laser 405-nm rampe d&#39;environ 10% tous les 1000 images (voir note n ° 4). Pour les cellules vivantes, un taux de trame de 10 ms est utilisée pour un total de 3.000 cadres (~ 30 s au total) avec une puissance laser 405 nm constante. </li><li> Déplacer le foyer arrière de la surface inférieure des cellules et d&#39;acquérir une autre image de champ clair que dans l&#39;étape 3,7. </li></ol> [2] Remarque: l&#39;intensité intégrée de la fluorescence verte d&#39;une cellule est directement proportionnelle au nombre total de FtsZ-mEos2 molécules exprimées dans la cellule. La puissance d&#39;excitation 488-nm et les paramètres d&#39;ensemble d&#39;acquisition de fluorescence doit être maintenue constante pour toutes les cellules de telle sorte que le rapport FtsZ-mEos2 niveaux d&#39;expression dans des cellules différentes peuvent être comparés. ontenu &quot;&gt; [3]. Remarque: Les cellules fixées sont imagés avec la densité neutre (ND) (figure 1, de composants optiques n ° 5) en place dans le but d&#39;atteindre un taux d&#39;activation lente, de sorte que chaque molécule individuelle peut être identifié avec précision le filtre ND est retiré lorsque l&#39;imagerie des cellules vivantes pour augmenter la vitesse d&#39;activation, tout en maintenant une faible probabilité de deux molécules étant activés simultanément dans une zone limitée par la diffraction. La vitesse plus rapide appliquée à imagerie des cellules vivantes est nécessaire de diminuer le temps d&#39;acquisition total, ainsi «geler» l&#39;O-ring en temps et en limitant l&#39;effet de photovieillissement de la cellule. [4] Remarque: Les numéros de trames acquises ont été optimisés pour notre système et dépendent de la structure cellulaire particulier, l&#39;étiquetage densité, taux d&#39;activation et si l&#39;évacuation de l&#39;ensemble du pool de fluorophores est important pour l&#39;analyse. Dans les cellules vivantes, il est important d&#39;obtenir un nombre suffisant de localisations dans une période aussi courte de time que possible pour éviter le flou de l&#39;image dû au bougé de la structure cellulaire. 4. Construction image PALM <ol><li> Déterminer la position de centre de gravité de chaque spot détecté. <ol><li> Chargez la pile d&#39;images dans Matlab (The MathWorks, Inc.) </li><li> Découper l&#39;empilement d&#39;image à une région autour d&#39;une cellule qui ne comprend pas tous les cordons repères. </li><li> Sélectionnez un seuil d&#39;intensité pour la détection endroit qui est au-dessus du niveau de fond, mais en dessous de la moyenne intensité de la tache. Nous tenons compte de la variation du niveau de fond tout au long d&#39;une expérience en calculant la moyenne de fonctionnement de l&#39;intensité maximale en utilisant un cadre de fenêtre 150. Le seuil d&#39;intensité pour chaque trame est ensuite interpolée à partir des valeurs moyennes de fonctionnement. </li><li> Soustraire le seuil respectif de chaque trame. Endroits potentiels sont identifiés comme trois pixels adjacents avec des intensités dessus du seuil. </li><li> Adapter l&#39;intensité de fluorescence de chaque point potentiel à un Gaussia bidimensionneln fonction [Equation 1] en utilisant un algorithme des moindres carrés non linéaire (figure 2). La précision de localisation de chaque point est calculée en utilisant le nombre total de photons détectés [équation 2]. N&#39;importe quel endroit mal-ajustement avec une précision de localisation supérieure à 20 nm (cellules fixes) ou 45 nm (cellules vivantes) est éliminée (voir note n ° 5). N&#39;importe quel endroit avec une intensité supérieure à deux volets de l&#39;intensité moyenne, probablement à cause de chevauchement des émetteurs, est également rejeté. </li><li> Pour les cellules fixes, retirer des observations répétées de la même molécule en faisant abstraction de toute tache dont le centre de gravité se trouve dans la position 45 nm de toute autre tache qui l&#39;a précédé de 6 trames ou moins. Pour les cellules vivantes, tous les points sont conservés. </li></ol></li><li> Calibrer la dérive échantillon en utilisant le mouvement de repère de calage. <ol><li> Cultures sur une zone de pixels 10x10 autour d&#39;un marqueur de repère. </li><li> Soustraire le seuil respectif déterminé en 4.1.3 de chaque trame. </li><li> Monter le profil d&#39;intensité dans chaquebâti par l&#39;intermédiaire des moindres carrés algorithme d&#39;ajustement en supposant une forme gaussienne bidimensionnelle. </li><li> Calculer le déplacement entre les positions des centroïdes par rapport à l&#39;image 1. </li></ol></li><li> Corriger la position du centre de gravité de chaque molécule unique identifié en 4.1 avec la dérive appropriée de l&#39;échantillon calculée en 4.2. Comparer les images en fond clair acquises en 3,7 et 3,10. Si les cellules sont observées à se déplacer par rapport aux balises de repère, les données sont jetés. </li><li> Superposer toutes les positions corrigées centroïde sur une seule image composée de pixels 15x15 nm. Tracer chaque molécule unique comme une unité de surface, à deux dimensions profil gaussien centré à la position de centre de gravité, avec un écart-type égal à la précision de localisation [Equation 2]. Il en résulte une carte de densité de probabilité, où l&#39;intensité d&#39;un pixel est proportionnelle à la probabilité de trouver une molécule dans ce pixel (Figure 3Aiv). </li><li> En comparant les images PALM aux images ensemble. <ol><li> Replot le centropositions id comme en 4.4, mais sur un plan de 150x150 pixels nm et un écart type égal à 250 nm. Cela génère une image qui imite PALM une image de diffraction limitée, qui peut être utilisé pour comparer l&#39;image de diffraction limitée ensemble, acquis en 3,8 (Figure 3Aiii). </li><li> Pour confirmer que les molécules détectées sont représentatifs de l&#39;ensemble de la population, comparer l&#39;image d&#39;ensemble reconstruite (Figure 3Aiii, étape 4.5.1) avec l&#39;image de fluorescence ensemble expérimental (Figure 3Aii, étape 3.8) pour confirmer que les deux images montrent des structures de forme similaire , l&#39;orientation et l&#39;intensité relative. </li></ol></li></ol> [5] Remarque: La précision de localisation minimum requis a été déterminé de manière empirique pour chaque méthode d&#39;imagerie en traçant les précisions de toutes les molécules d&#39;un échantillon donné et en choisissant un seuil approprié. 5. Analyse d&#39;images PALM <ol><li> Mesure de Z-Ring Width et diamètre. <ol><li> Faire pivoter l&#39;image de manière à PALM verticalement orienter l&#39;axe longitudinal de la cellule (figure 4A). </li><li> Cultures sur la région cellulaire contenant le O-ring. </li><li> Calculer l&#39;intensité cumulée par projection d&#39;une courbe d&#39;intensité le long de l&#39;axe de temps de la cellule. </li><li> Adapter le profil d&#39;intensité à une distribution gaussienne. La largeur de l&#39;anneau est défini comme le maximum moitié pleine largeur (FWHM) de la distribution gaussienne ajustée (Figure 4B). </li><li> Projeter le profil de l&#39;intensité cumulée 5.1.2 long de l&#39;axe court de la cellule. Le diamètre de l&#39;anneau est définie comme la longueur du profil d&#39;intensité (figure 4C). </li></ol></li><li> Tracé Densité FtsZ (voir note 6). <ol><li> Replot les positions centroïdes que dans (4,4), mais sans que le profil gaussien de telle sorte que chaque molécule unique est attribué une valeur de 1 et affecté à un seul pixel correspondant à sa position de centre de gravité. De cette façon, l&#39;intensité de chaquepixel représente le nombre total de molécules détectées dans ce pixel. L&#39;image PALM densité peut également être visualisée comme un tracé de contour (figure 5E). </li></ol></li><li> Détermination de la résolution spatiale. <ol><li> Théoriquement, réalisables résolution spatiale: créer un PSF représentant pour la totalité de l&#39;échantillon en utilisant la précision de localisation moyenne déterminée de toutes les molécules détectées et calculer la FWHM (équation 3). </li><li> Expérimentalement atteint une résolution spatiale: calculer le déplacement moyen entre les observations répétées de la même molécule. </li></ol></li></ol> [6] Note: Nous avons utilisé une réflexion interne totale PALM (TIR-PALM, figure 1 et 5) pour restreindre l&#39;activation et d&#39;excitation à une couche mince (~ 200 nm) au-dessus de l&#39;interface cellule / verre. de sorte que seules les molécules FtsZ associés à la membrane le plus proche de la lamelle sera détecté.

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. 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Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Images PALM contiennent des informations sur compte molécules et fonctions au sein d&#39;une cellule, ce qui permet une analyse détaillée de la répartition et l&#39;agencement des molécules de protéines cibles qui est difficile à obtenir par d&#39;autres moyens. Ci-dessous, nous présentons les précautions qui doivent être prises pour en extraire des informations quantitatives précises tout en maintenant la pertinence biologique des images PALM. Nous explorons également les informations qui peuvent être obte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 50 x MEM acides aminés </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM Vitamines </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46 à 102-RF </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 16% </td><td> Electron Sciences Micrsocopy </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> GTG Agarose SeaPlaque </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 perles d&#39;or nm </td><td> Microsphères-Nanosphères </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 imagerie Chambre </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Adaptateur étape </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope inversé </td><td> Olympe </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> NA 1,45, 60x Objectif </td><td> Olympe </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD caméra </td><td> Andor Technology </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm laser saphir </td><td> Cohérent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm laser saphir </td><td> Cohérent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laser CUBE 405-nm </td><td> Cohérent </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

La division cellulaire bactérienne nécessite l&#39;assemblage coordonné de plus de dix protéines essentielles à midcell 1,2. Au cœur de ce processus est la formation d&#39;une superstructure en forme d&#39;anneau (O-ring) par la protéine FtsZ au plan de 3,4 division. Le Z-ring se compose de plusieurs protofilaments FtsZ simple brin, et de comprendre l&#39;agencement des protofilaments à l&#39;intérieur de l&#39;O-ring donnera un aperçu du mécanisme de Z-anneau de montage et de sa fonction en tant que générateur de 5,6 vigueur. Cette information est resté inaccessible en raison des limites actuelles de la microscopie par fluorescence et par microscopie électronique conventionnelle. Microscopie à fluorescence conventionnelle est incapable de fournir une image à haute résolution de l&#39;O-ring en raison de la limite de diffraction de la lumière (~ 200 nm). Electron cryotomographic imagerie a détecté dispersés dans les petites protofilaments FtsZ C. cellules crescentus 7, mais est difficile à appliquer à des cellules plus grandes telles queE. coli ou B. subtilis. Nous décrivons ici l&#39;application d&#39;une méthode de super-résolution microscopie à fluorescence, microscopie Localisation photoactivé (PALM), pour caractériser quantitativement l&#39;organisation structurelle de l&#39;E. coli O-ring 8. PALM offre à la fois l&#39;imagerie à haute résolution spatiale (~ 35 nm) et un étiquetage spécifique pour permettre une identification sans ambiguïté des protéines cibles. Nous avons étiqueté FtsZ avec la protéine fluorescente mEos2 photoactivable, qui passe du vert fluorescence (excitation = 488 nm) au rouge fluorescence (excitation = 561 nm) lors de l&#39;activation à 405 nm 9. Au cours d&#39;une expérience PALM, simples FtsZ-mEos2 molécules sont activées stochastiquement et les positions correspondantes barycentre des molécules individuelles sont déterminées avec une précision &lt;20 nm. Une image de super-résolution de l&#39;O-ring est ensuite reconstruite par superposition des positions des centroïdes de tous détectés FtsZ-mEos2 molécules. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En utilisant cette méthode, nous avons constaté que l&#39;O-ring a une largeur fixe de ~ 100 nm et est constitué d&#39;un faisceau lâche de protofilaments FtsZ qui se chevauchent les uns avec les autres en trois dimensions. Ces données fournissent un tremplin pour d&#39;autres études sur les changements du cycle cellulaire dépendant de la 10 Z-ring et peut être appliquée à d&#39;autres protéines d&#39;intérêt.

Illustré à la figure 3Aiv est un bidimensionnelle, de super-résolution de rendu de l&#39;anneau Z-générée à partir de la méthode d&#39;imagerie PALM décrit ci-dessus. Ci-dessous, nous résumons les informations qualitatives et quantitatives qui peut être obtenu de leur part. Qualitativement, nous avons observé que l&#39;O-ring est une structure irrégulière qui adopte plusieurs configurations (bande unique ou d&#39;un arc hélicoïdal) qui ne sont pas distinguée...

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Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Nous décrivons une méthode de super-résolution d&#39;imagerie pour sonder l&#39;organisation structurelle de la FtsZ torique bactérienne, un appareil essentiel pour la division cellulaire. Cette méthode est basée sur des analyses quantitatives de photoactivées localisation de microscopie (PALM) images et peut être appliquée à d&#39;autres protéines du cytosquelette bactérien.

Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

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Research

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Biology

11.7K vues.  The Johns Hopkins University School of Medicine. Nous décrivons une méthode de super-résolution d'imagerie pour sonder l'organisation structurelle de la FtsZ torique bactérienne, un appareil essentiel pour la division cellulaire. Cette méthode est basée sur des analyses quantitatives de photoactivées localisation de microscopie (PALM) images et peut être appliquée à d'autres protéines du cytosquelette bactérien.

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Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Cryotomography électrons des cellules bactériennes

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

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Biologie

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-résolution d&#39;imagerie de l&#39;Anneau Z cytokinétique en utilisant des bactéries vivantes 3D structuré rapide Illumination Microscopy (F3d-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Préparation, imagerie, et la quantification de la surface bactérienne motilité dosages

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open Source Analyse unique pour particules super-résolution Microscopie avec VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

État fondamental l’appauvrissement Super-résolution imagerie dans les cellules de mammifères

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Application de la microscopie vitesse haut débit Super-résolution en direct cil primaire

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.