The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.

NOTE: Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés et réalisés en conformité avec les normes de l&#39;Université de Tel Aviv Sackler School of Medicine institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité (IACUC). 1. Préparation conditionné médias <ol><li> Graine 2 x 10 6 cellules U-87 MG dans une plaque de culture de 10 cm dans un volume de 8 ml du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et une solution de pénicilline / streptomycine / nystatine à 1%. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C; 5% de CO 2 jusqu&#39;à la réalisation complète de confluence à 48 h. </li><li> Utiliser une seringue de 10 ml, retirer tout support de la plaque et filtrer à travers un filtre de 0,45 um dans un tube de 15 ml. </li><li> Sans lavage de la plaque de cellules, ajouter 1 ml de solution de trypsine (0,25%) et incuber. </li><li> Lorsque toutes les cellules sont décollées, inactiver la trypsine en utilisant au moins 5 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et préformer un nombre de cellules. </li><li<html> &gt; Compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre ou un autre dispositif de comptage de cellule et calculer le nombre de cellules selon le procédé de comptage utilisé. NOTE: Il sera utilisé plus tard afin de normaliser la concentration CM. </li><li> Transférer le CM à un verre ballon à fond rond et on concentre sous vide poussé évaporateur rotatif. Afin d&#39;accélérer le processus, augmenter la température du bain à 37 ° C, si on le souhaite. Continuez jusqu&#39;à ce que le CM réalise une texture pâteuse. </li><li> Reprendre le CM de chaque plaque de culture dans 400 ul de solution saline. Lorsque vous utilisez plus d&#39;une plaque, utiliser un volume équivalent. Par exemple, pour deux plaques de culture, utiliser 800 pi. Utilisez chaque plaque pour 4 souris. </li><li> Afin de comparer différentes lignées cellulaires ou des traitements, ajuster le volume en fonction du rapport de cellule reçue à l&#39;étape 1.6. Par exemple, si une plaque 1.5x contient plus de cellules, ajouter 200 ul de solution saline pour les 400 ul de pré-existants. Ce sera le CM ajusté </li></ol>title &quot;&gt; 2. ECM-mimétique Gel Plug-inoculation à des souris <ol><li> Avant l&#39;inoculation du gel de ECM-mimétique à des souris, préparer les matériaux suivants: <ol><li> Les facteurs de croissance réduits gel de ECM-mimétique sans phénol (décongeler une nuit, un jour avant l&#39;expérience, à 4 ° C sur de la glace). </li><li> Rasoir électrique. </li><li> Kétamine et de xylazine pour anesthésier les souris. </li><li> Glacée 1000 conseils ul stériles. </li><li> Glacée seringue de 1 ml et 27 g d&#39;aiguilles. </li></ol></li><li> Préparer pour chaque souris un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 80 ul ajustés CM et garder sur la glace. </li><li> Pour chaque tube, ajouter 600 les facteurs de croissance glacées ul gel de ECM-mimétique sans phénol réduite qui a été décongelé nuit à 4 ° C, sur de la glace. Le gel d&#39;ECM-mimétique est liquide à 4 ° C et se solidifie à la température du corps; afin d&#39;éviter le gel de l&#39;ECM-mimétique de se solidifier, utiliser 1000 conseils ul glacées. Mélanger soigneusement tubes sans formation de bulles et de garder sur la glace. </li><li> Anesthésier vieille six semaines BALB / c souris en utilisant de la kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (12 mg / kg). Confirmez anesthésie appropriée selon le soins institutionnels animale et du comité de l&#39;utilisation, ce est à dire avant le début de l&#39;expérience. Les animaux ont atteint leur bon plan de l&#39;anesthésie quand ils ne répondent plus à un pincement de l&#39;orteil entreprise. </li><li> Rasez la région abdominale des souris et désinfecter l&#39;aide d&#39;un gommage chirurgicale / alcool. </li><li> Utiliser une seringue froid 1 ml et une aiguille de 27 G pour injecter le contenu du tube Eppendorf voie sous-cutanée. Effectuer l&#39;injection très lentement pour éviter la formation de bulles. Une fois tout le volume est administré, ne pas éjecter l&#39;aiguille pendant plusieurs minutes, jusqu&#39;à ce que la solidification se produit. </li></ol> 3. Évaluation des ECM-mimétique Gel Branchez vascularisation par ultrasons NOTE: Cette partie du protocole nécessite la connaissance préalable de fonctionnement d&#39;un système d&#39;imagerie par ultrasons, ou l&#39;assistance d&#39;un technicien agréé. <ol><li> Avant de commencer, avoir la fmatériaux et instruments prêts uite: <ol><li> Rasoir électrique. </li><li> Crème dépilatoire. </li><li> Kétamine et de xylazine pour anesthésier les souris. </li><li> Microbulles non ciblée. </li><li> dispositif d&#39;activation. </li><li> Système d&#39;imagerie US, y compris un 55 MHz 708 sonde et une acquisition micromanipulateur 3D. </li></ol></li><li> Mesurer la vascularisation dans les bouchons trois semaines après l&#39;inoculation: NOTE: Dans le modèle animal U-87 MG-base, trois semaines a été trouvé pour représenter le point de moment idéal pour l&#39;imagerie. Sous différents paramètres, calibrer la cinétique de vascularisation à partir de quelques jours après l&#39;inoculation de bouchons. <ol><li> Anesthésier les souris à l&#39;aide de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (12 mg / kg). Confirmez anesthésie appropriée selon le soins institutionnels animale et du comité de l&#39;utilisation, ce est à dire avant le début de l&#39;expérience. Les animaux ont atteint leur bon plan de l&#39;anesthésie quand ils ne répondent plus à un pincement de l&#39;orteil entreprise. </li><li> Raser lesrégion abdominale des souris et traiter avec de la crème dépilatoire. </li><li> Fixer les souris passivement sur la scène de la micro-manipulateur. </li><li> En utilisant une solution saline contenant 1 ml de seringue et une aiguille 30 G, placer l&#39;aiguille à l&#39;intérieur de la veine caudale, fixer fermement l&#39;aiguille et desserrer la seringue. </li><li> Mettre en place pour la session 3D en mode acquisition de l&#39;image de contraste: <ol><li> Appuyez sur &quot;3D&quot; pour initialiser l&#39;étape du moteur 3D et placer le transducteur dans le milieu de la zone de numérisation souhaitée. </li><li> Appuyez sur &quot;3D&quot; et entrez la distance et l&#39;étape format de numérisation, puis appuyez sur &quot;Scan&quot;. </li><li> Assurez-vous que l&#39;ensemble du bouchon a été balayé dans les données d&#39;image 3D affichées. Si non, ajustez la sonde afin que l&#39;ensemble du bouchon est visible dans l&#39;analyse et répétez l&#39;étape 3.5.2. </li><li> Appuyez sur &quot;Contraste&quot; et pousser la compensation de gain de temps (TGC) contrôle vers la gauche pour assombrir l&#39;image. </li></ol></li><li> Activer les microbulles en utilisant un mélangeur flacon qui est designated pour l&#39;activation de microbulles pendant 45 sec. </li><li> Mélanger dans un seringue de 1 ml 50 pi de microbulles avec 50 ul de solution saline. </li><li> Remplacer la seringue contenant une solution saline-desserré avec une seringue contenant des microbulles activés. Injecter les microbulles dilué dans la veine de la queue des souris, attendre quelques secondes pour que les bulles d&#39;atteindre un état d&#39;équilibre, puis acquérir 3D contraste amélioré ciné boucle de la prise, en utilisant le moteur d&#39;acquisition 3D: <ol><li> Appuyez sur &quot;3D&quot; et sélectionnez &quot;Scan&quot; pour acquérir des images à contraste renforcé 3D puis appuyez sur &quot;Cine Store&quot; pour enregistrer les données d&#39;image. </li><li> Appuyez sur &quot;3D&quot; et cliquez sur &quot;Destroy 3D&quot; pour détruire les microbulles. </li><li> Appuyez sur &quot;3D&quot; et sélectionnez &quot;Scan&quot; pour acquérir une boucle ciné post-destruction, puis appuyez sur &quot;Cine Store&quot;. </li></ol></li><li> Générer la superposition des trames d&#39;image avant et après l&#39;destruction de microbulles: <ol><li> Dans la &amp;# 8220; Paramètres de référence &quot;sur le côté gauche de l&#39;écran cliquez sur&quot; Créer de référence &quot;. </li><li> Appuyez sur &quot;Study Management&quot; pour ouvrir la boucle ciné pré-acquis de destruction. </li><li> Cliquez sur &quot;Processus de Cine&quot; pour générer la superposition de contraste vert, puis cliquez sur &quot;Load Into 3D&quot;. </li></ol></li><li> Utilisez le logiciel d&#39;imagerie américain afin de quantifier l&#39;image 3D obtenue pour le volume de sang dans les bouchons: <ol><li> Appuyez sur &quot;Scan / Freeze» et appuyez sur &quot;Paramètres de mode&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;Volume&quot; et sélectionnez &quot;parallèle&quot;. </li><li> Insérer un volume 3D du tissu cible par segmentation d&#39;une série de contours. </li><li> Cliquez sur &quot;Terminer&quot; pour terminer la segmentation. REMARQUE: Le volume de l&#39;agent de contraste sera affiché sur le côté inférieur gauche de l&#39;écran. </li></ol></li><li> À la fin de la procédure, placez la souris dans un environnement propre et sec et chaud, calme, loin ded&#39;autres animaux. Fournir de la chaleur en utilisant un tampon disponible dans le commerce chirurgicale chauffage ou une lampe à incandescence (50-75 watts), placé 12-14 centimètres de rongeurs. Surveiller souris continuellement jusqu&#39;à ce que le maintien de la posture debout et de marcher normalement. </li></ol></li></ol> 4. Évaluation des ECM-mimétique Gel Branchez Vasculature Morphologie Utilisation fibrée confocale Endomicroscopie NOTE: cette partie du protocole est effectuée imagerie US immédiatement après et il nécessite la connaissance préalable de l&#39;exploitation du système d&#39;imagerie confocale fibrée de l&#39;endomicroscopie, ou l&#39;assistance d&#39;un technicien agréé. <ol><li> Avant de commencer, avoir les matériaux et instruments prêts suivants: <ol><li> outils de chirurgie comme une pince, ciseaux et fils à coudre résorbables. </li><li> Dextran-FITC conjugué (70 kDa). </li><li> des solutions d&#39;étalonnage (trois tubes contenant chacun peroxyde d&#39;hydrogène, eau ou de solution fluorescente). </li><li> Système d&#39;imagerie et d&#39;unsonde appropriée pour l&#39;imagerie des vaisseaux sanguins selon fabricant. </li></ol></li><li> Anesthésier les souris à l&#39;aide de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (12 mg / kg). </li><li> Iv administrer, via la veine caudale, 200 ul de 10 mg / ml de dextrane marqué au FITC. </li><li> Désinfectez la région abdominale chirurgicale en utilisant un gommage / alcool et appliquer une petite incision d&#39;environ 1 cm de la fiche. </li><li> Placer la sonde de l&#39;endomicroscopie sur le dessus de la bougie doucement tout en gardant la fiche intacte. </li><li> Acquisition: <ol><li> Une fois la sonde est réglée sur la fiche, appuyez sur &quot;Démarrer laser&quot; en utilisant la pédale. La fluorescence devrait être affiché sur l&#39;écran. </li><li> Acquérir des films courts (jusqu&#39;à 30 secondes) en appuyant sur «Record» sur l&#39;écran ou &#39;Select&#39; en utilisant la pédale. </li><li> Entre les films, laver la sonde en plaçant la pointe dans un tube contenant de l&#39;eau. </li><li> Lorsque vous avez terminé, retirez la sonde et nettoyer l&#39;embout avec un coton-tige. </li></ol></li><li> Pour analyser moyenne cinqdiamètre ssel: <ol><li> Cliquez sur l&#39;icône &quot;Détecter microvaisseaux&quot; dans le panneau supérieur pour ouvrir la fenêtre du module de détection des navires. </li><li> Cliquez sur &quot;Préférences&quot; et marquer &quot;le diamètre du vaisseau moyenne&quot; dans la &quot;statistique d&#39;intérêt» et «Afficher les barres de l&#39;histogramme&quot; dans le &quot;Mode d&#39;affichage&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;Détecter&quot; pour afficher les mesures sélectionnées. </li></ol></li><li> Pour analyser l&#39;intensité du signal fluorescent dans les zones adjacentes aux vaisseaux sanguins: <ol><li> Cliquez sur &quot;Créer un cercle ROI&quot; dans le panneau de gauche et de créer un cercle dans la zone d&#39;intérêt. </li><li> Cliquez sur &quot;Calculer histogramme sein ROI&quot; pour calculer les valeurs liées à cette région. </li></ol></li></ol> 5. Traitement post-procédurale de souris <ol><li> À la fin de chaque procédure d&#39;imagerie, placez la souris dans un environnement propre et sec et chaud, calme, loin des autres animaux. Fournir de la chaleur en utilisant un commerce-uncoussin chauffant chirurgicale vailable ou une lampe à incandescence (50-75 W), placés dans 12-14 loin de rongeurs. Surveiller souris continuellement jusqu&#39;à ce que le maintien de la posture debout et de marcher normalement. </li><li> Pour une analyse plus approfondie de la vascularisation de bouchons à des points de temps supplémentaires, appliquer les conditions de récupération suivantes: <ol><li> Suturer la petite incision avec des sutures absorbables. </li><li> Donnez une analgésie souris comme la buprénorphine (1 mg / kg par voie sous cutanée), et revenir à des cages individuelles. </li><li> Observez tous les animaux pour déterminer si un traitement antalgique est nécessaire et de réévaluer tous les jours pour surveiller et évaluer la détresse. </li></ol></li><li> À la fin-point de l&#39;expérience, euthanasier les souris par l&#39;isoflurane appliquant d&#39;abord, suivie par dislocation cervicale. </li><li> Si l&#39;imagerie supplémentaire sera effectué dans les semaines suivant les étapes initiales d&#39;imagerie, toutes les procédures doivent être aussi stérile que possible. Un gommage de la peau chirurgicale doit être réalisée, wa stérileter et coton stérile conseils devraient être utilisés pour nettoyer la sonde de l&#39;endomicroscopie, et la sonde doivent être désinfectés entre chaque animal en utilisant de l&#39;eau stérile. </li></ol>

<ol>
	<li>Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth:+an+in+vivo+Matrigel+model.">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li><li>Passaniti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+quantitative+method+for+assessing+angiogenesis+and+antiangiogenic+agents+using+reconstituted+basement+membrane,+heparin,+and+fibroblast+growth+factor.">A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor.</a> Lab Invest. 67, 519-528 (1992).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49, 32-40 (2003).</li><li>Johns, A., Freay, A. 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The authors have nothing to disclose.

Combinant les méthodes d&#39;imagerie complémentaires permet l&#39;acquisition d&#39;informations sur la densité des microvaisseaux, la fonctionnalité et la morphologie de différentes composantes de l&#39;angiogenèse. Chargement CM sur les bouchons de gel ECM-synoptique génère un microenvironnement tumoral, qui est séparée des autres populations de cellules, comme les cellules endotheliales, qui sont recrutés et se extravaser dans le bouchon. En effectuant, en parallèle, des micr...

L&#39;essai d&#39;angiogenèse de bouchon de Matrigel a été décrit en premier par Kibbey et al. En 1992, où elle a été utilisée pour évaluer la stimulation de l&#39;angiogenèse par la SIKVAV peptide (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) une. Contrairement à d&#39;autres essais in vivo de l&#39;angiogenèse, comme l&#39;angiogenèse de la cornée de souris ou de poulet dosages de membrane chorio, ce dosage est relativement facile à réaliser deux. Le gel d&#39;ECM-mimétique injecté peut contenir des cellules pro-angiogénique, ou un des composés anti-angiogènes et / ou facteurs. Lors de l&#39;évaluation de l&#39;activité d&#39;un composé anti-angiogénique, le bouchon contient normalement un mélange de facteur de croissance endothelial vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF), et la substance anti-angiogénique peut être administré directement dans le bouchon ou systémique 3, 4. Le gel de ECM-synoptique est injection sous-cutanée où il se solidifie en quelques minutes. Évaluation de recrutement des vaisseaux sanguins dans le bouchon résultant est typically effectuée en mesurant le taux d&#39;hémoglobine à l&#39;intérieur de la prise, par mesure du signal de fluorescence suite à l&#39;injection de l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) marqué au dextran, par immunocoloration de coupes histologiques de marqueurs spécifiques endothéliales ou de cellules activé par fluorescence (FACS) 2,5, 6. Cependant, cette évaluation ne permet qu&#39;une analyse de point final et n&#39;a pas d&#39;informations sur la fonctionnalité et la morphologie des vaisseaux sanguins. En outre, les mesures de volume de plasma, soit par le taux d&#39;hémoglobine ou de dextran-FITC en utilisant comme indicateur, peut être trompeuse, car la teneur en sang est affectée par la taille des vaisseaux sanguins et l&#39;étendue de mares de sang. Cela est particulièrement important lorsque le système vasculaire recruté est caractérisée par la perméabilité accrue et la rétention (EPR) effet 7. Nous vous proposons ici un nouveau plus précise, un procédé pour la visualisation des vaisseaux sanguins recrutés, en combinant les deux techniques d&#39;imagerie complémentaires. Higmicrobulles h résolution ultrasons contraste amélioré (US) combinés avec intravitale fibré-confocale endomicroscopie peut fournir des informations non seulement sur la densité des vaisseaux sanguins, mais aussi sur leur morphologie et leur fonctionnalité. En outre, cette analyse peut être effectuée à plusieurs points dans le temps permettant ainsi le suivi de la cinétique de l&#39;angiogenèse. États-Unis sont une modalité d&#39;imagerie largement utilisé qui possède une haute résolution spatiale pour les vaisseaux sanguins imagerie suivante par voie intraveineuse (iv) injection de microbulles qui restent exclusivement dans le compartiment vasculaire 8-11. Les microbulles sont microbulles remplies de gaz qui produisent un signal échogène forte lorsqu&#39;il est excité avec une impulsion des États-Unis et servir ainsi comme un bon agent de contraste. Des images 3D de la fiche sont acquises à l&#39;aide du logiciel de système d&#39;imagerie Etats-Unis après la destruction des microbulles. Les images obtenues sont composées de trames d&#39;image avant et après la destruction de microbulles et reflètent la différence d&#39;intensité de la vidéo en couleur. Ces superposéeles images sont affichées automatiquement par le logiciel. Par conséquent, le pour cent de vaisseaux fonctionnels dans le bouchon peut être quantifiée. Haute résolution fibrée endomicroscopie confocale sert de modalité d&#39;imagerie complémentaire en signalant sur les vaisseaux sanguins morphologie. Dans cette méthode minimalement invasive, les images sont acquises suite à l&#39;administration intraveineuse de dextran conjugué au FITC 12. Le polymère fluorescent teint dans la circulation sanguine et sert comme un «agent de contraste» pour les vaisseaux sanguins morphologie et la circulation sanguine ainsi. En outre, étant donné que le polymère est injecté à une taille de 70 kDa, il ne peut traverser les vaisseaux qui fuient que l&#39;on trouve dans le système vasculaire tumoral. Cela se traduira par du bruit de fond élevé de dextrane marqué au FITC à l&#39;extérieur des vaisseaux sanguins. Par conséquent, endomicroscopie confocale fibrée peut être utilisé pour visualiser les caractéristiques typiques de l&#39;effet EPR dans la tumeur qui fuient agrandies navires, neovasculature-, hautement enchevêtrées, avec des extrémités franches. Ce modèle de système a été décrilit dans la comparaison du potentiel angiogénique de U-87 MG glioblastome humain clone et son dormant 13. La vascularisation dans les bouchons a été évalué trois semaines après l&#39;inoculation de gel ECM-synoptique. Il a été montré que la vascularisation à l&#39;intérieur des bouchons contenant CM U-87 MG croissance rapide des cellules tumorales génératrices a été augmenté de façon significative en termes de nombre, la densité et la fonctionnalité, par rapport à la vascularisation à l&#39;intérieur des bouchons contenant CM de cellules tumorales génératrices de dormance. Par conséquent, les auteurs ont pu conclure que CM isolé du U-87 MG croissance rapide des cellules tumorales génératrices contient des niveaux plus élevés de facteurs pro-angiogéniques, par rapport à la CM de cellules tumorales génératrices dormants. Ces facteurs stimulent la formation de vaisseaux sanguins fonctionnels par un effet positif sur toutes les étapes de la cascade angiogénique (par exemple, la prolifération, la germination, la migration et finalement, la formation de structures tubulaires de cellules endothéliales).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Company</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Catalog number</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Rotary Vacuum Evaporator</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Growth-factors reduced phenol-free Matrigel</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">BD Bioscience</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">FAL356231</td>
			<td style="width:251px;">Thaw overnight, at 40C on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Depilatory cream&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 US imaging system</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">55 MHz 708 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 imaging software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">VialMix&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VMIX</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">DEFINITY microbubbles</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DE4</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Activate for 45 seconds using Vialmix before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ProFlex MiniO/30 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">70 kD FITC-labeled Dextran</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">46945</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ImageCell software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Calibration Kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td align="left" height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td align="left">Gibco Life Tecchnologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td align="left" height="37" style="height:37px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td align="left" height="39" style="height:39px;">Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring functionality and morphology of vasculature recruited by factors secreted by fast-growing tumor-generating cells

Le sous-cutanée de matrigel bouchon dosage chez la souris est une méthode de choix pour l&#39;évaluation in vivo de facteurs pro et anti-angiogéniques. Dans ce procédé, les facteurs désirés sont introduits dans le gel de ECM-mimétique à froid liquide qui, après l&#39;injection sous-cutanée, se solidifie pour former un milieu simulant le milieu du cancer. Cette matrice permet la pénétration des cellules hôtes telles que des cellules endotheliales, et donc, la formation de vaisseaux sanguins. Ici, nous proposons une nouvelle analyse de bouchon de Matrigel modifié, qui peut être exploitée pour illustrer le potentiel angiogénique d&#39;une piscine de facteurs sécrétés par les cellules cancéreuses, par opposition à un élément spécifique (par exemple, le bFGF et le VEGF) ou un agent. La fiche contenant du gel de ECM-synoptique est utilisée pour introduire l&#39;hôte (ce est à dire, souris) avec un pool de facteurs sécrétés au CM de cellules de glioblastome tumorales génératrices à croissance rapide. Nous avons déjà décrit une comparaison approfondie du potentiel angiogénique deU-87 MG glioblastome humain clone et de son dérivé dormant, dans ce modèle de système, montrant l&#39;angiogenèse induite dans les cellules parentales MG U-87. Le CM est préparé en filtrant les médias recueillies à partir de plaques de culture de tissus de confluence des deux lignée cellulaire suivants 48 heures d&#39;incubation. Par conséquent, il ne contient que des facteurs sécrétés par les cellules, sans que les cellules elles-mêmes. On décrit ici est la combinaison de deux techniques d&#39;imagerie, micro-bulles imagerie ultrasonore à contraste amélioré et intravitale endomicroscopie de fibrée-confocale, pour une précision, la caractérisation en temps réel de la mesure, de la morphologie et de la fonctionnalité de nouvellement formés vaisseaux sanguins dans les bouchons.

L&#39;implantation des fiches de gel ECM-mimétique avec CM à partir de la lignée cellulaire de tumeur génératrices angiogénique à croissance rapide U-87 MG, des résultats très étendue dans l&#39;angiogenèse. Ce système vasculaire peut être largement exploré en utilisant deux méthodes d&#39;imagerie complémentaires. Les microbulles contraste amélioré imagerie US révèle très étendue recrutement des vaisseaux sanguins fonctionnels dans le bouchon en illustrant étendue du ...

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Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Contrôle de la fonctionnalité et de morphologie de la vascularisation Recruté par facteurs sécrétés par les cellules tumorales génératrices à croissance rapide

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

monitoring-functionality-morphology-vasculature-recruited-factors

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K vues.  Tel Aviv University. We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

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Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Recherche

Biologie

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

Effets de l&#39;acupuncture suivi sur le cerveau humain par IRMf

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Cartographie sort des cellules souches embryonnaires humaines par la formation de tératome

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

Dans l&#39;endocytose hépatique in vivo suivie d&#39;une purification des cellules du foie par perfusion du foie

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Les changements d&#39;équilibre dans la structure de l&#39;ARN de surveillance par «peroxydation» et «oxydatif» Hydroxyl Footprinting Radical

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Activités de surveillance kinase et la phosphatase dans le cycle cellulaire par Ratiométrique FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Dans reprogrammation in vivo de cellules somatiques adultes à la pluripotence par surexpression de facteurs Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

Surveillance de la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes par cocultivation de souches marquées par fluorescence

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...