Le génotypage est le processus de détection de la présence, ou absence, de séquences spécifiques d’ADN dans le génome d’un organisme particulier. Vu que les gènes peuvent influencer le phénotype des souris, être capable de sonder la génétique d’une souris individuelle, ou son « génotype », est important pour l’attribution d’un phénotype à un gène spécifique. Cette vidéo explore la génétique de la souris, montre les étapes clés de la procédure de génotypage, et explique comment interpréter des résultats de génotypage par PCR.

En vue de comprendre ce que les sicentifiques recherchent lorsqu’ils analysent le génotype des souris, passons en revue quelques manipulations génétiques habituelles de la souris.

Pour étudier un gène, les scientifiques perturbent ses fonctions en altérant sa séquence génétique. Cependant, les souris sont diploïdes, elles ont deux copies de n’importe quel gène donné. Vu que la plupart des gènes fonctionnent avec une seule copie normale, avant l’étude du phénotype, les souris doivent être reproduites pour créer un animal avec les deux gènes perturbés.

Ce génotype est appelé un « homozygote knock-out », ou en plus court « knock-out ». Inversement, une souris normale avec deux copies fonctionnelles est appelée un « homozygote sauvage », ou simplement « sauvage ». Finalement, les souris avec une seule copie fonctionnelle sont appelées « hétérozygotes » ou « hets ».

Plutôt que de retirer du matériel génétique, certaines expériences nécessitent l’introduction de séquences d’ADN dans le génome de la souris. Ces fragments d’ADN insérés sont appelés « transgènes », et les souris qui les portent sont « transgéniques ». Le « transgène » le plus commun introduit chez la souris est celui qui amène l’expression de la protéine fluorescente verte, ou GFP, issue de méduses. En utilisant un promoteur de tissu spécifique (une séquence de régulation qui « promeut » l’activité d’un gène) pour induire la production de GFP, les cellules d’un type spécifique de tissu peuvent être facilement identifiées par fluorescence.

Parce-que beaucoup de mutations génétiques ne donnent pas lieu à un phénotype facilement observable, comme l’expression de GFP, les souris doivent être génotypées pour déterminer quel animal spécifique devrait être utilisé dans les expériences. Avant le génotypage, les souris doivent être labélisées afin d’être identifiées par la suite. Non, vous aurez besoin de quelque chose de plus permanent que cela. Une méthode courante est de faire des crans dans les oreilles, de manière à ce que la position et le nombre de crans correspondent à un numéro d’identification.

Une fois que la souris est labélisée, collectez un petit morceau de tissu (typiquement 2 à 5 mm de la queue, en utilisant une lame de rasoir ou des ciseaux) duquel extraire l’ADN. Si vous collectez sur plus d’une souris, marquez les segments du rasoir utilisés pour garantir que vous n’utiliserez pas la même partie sur l’animal suivant, ce qui amènerait à une contamination de vos échantillons.

Pour commencer le processus de séparation du matériel génétique de tous les autres composants du tissu, l’échantillon est digéré dans un tampon de lyse contenant l’enzyme protéinase K. Après une digestion au cours de la nuit, l’échantillon est centrifugé pour rassembler en pellet les poils et n’importe quel autre matériel non digéré. Pour isoler l’ADN du lysat digéré, une méthode simple et efficace est d’ajouter de l’alcool pour précipiter les acides nucléiques. Après une brève incubation, l’échantillon est à nouveau centrifugé pour collecter l’ADN en un pellet.

Après le lavage avec de l’éthanol à 70% pour retirer les sels en excès, le pellet d’ADN est remis en suspension dans de l’eau ou dans un tampon, et est alors prêt pour le génotypage.

Il existe plusieurs stratégies pour déterminer si une séquence spécifique d’ADN est présente chez votre souris. La plupart d’entre elles nécessitent que vous amplifiiez d’abord la région génétique d’intérêt en utilisant la réaction en chaine par polymérase, ou PCR. Pour plus d’informations sur la PCR, allez voir « PCR : La réaction en Chaîne par Polymérase » dans les vidéos de JoVE.

Une méthode pour distinguer les génotypes est de détecter les changements dans la taille du fragment amplifié par PCR. Disons que vous êtes à la recherche de souris avec une insertion génétique de 700 paires de base. Après PCR, les bandes de type sauvage ont 200 paires de base et les bandes de type transgène auront 900 paires de base.

Après l’exécution de la PCR, séparez les produits de la réaction sur un gel au pourcentage approprié d’agarose, de façon à distinguer les tailles de vos fragments. Le contrôle de type sauvage devrait uniquement avoir les 200 paires de base sur la bande sauvage ; le contrôle de type transgénique devrait avoir les 900 paires de base de la bande transgène ; l’hétérozygote de contrôle devrait lui avoir les deux bandes. Enfin, un contrôle « sans modèle » est inclus pour être certain que les réactifs ne contiennent pas d’ADN contaminant, celui-ci ne devrait donc ne générer aucune bande.

Maintenant que nous sommes assurés que les contrôles fonctionnent comme espéré, regardons les souris inconnues. Vu que les souris 1 et 2 ont chacune uniquement une bande sauvage, elles sont de type homozygote sauvage. Les souris 4 et 6 ont chacune uniquement une bande transgène, elles sont donc de type homozygote transgène. Les souris 3 et 5 ont chacune les deux bandes et sont donc hétérozygotes.

Enfin, lorsque vous devez trouver la souris avec le génotype que vous cherchez, vous avez juste besoin de faire correspondre la disposition de crans d’oreilles avec son numéro d’identification.

Après avoir mieux compris ce qu’est le génotypage et comment il est réalisé, regardons quelques exemples de ce à quoi il est utile.

Dans certains cas, des modifications génétiques plus complexes sont requises pour produire le phénotype désiré. Par exemple, pour établir ce modèle de cancer de la peau dans des souris, deux transgènes sont requis. L’un porte un « oncogène » inductible, ou un gène qui peut causer un cancer, et le second porte l’enzyme Cre recombinase, qui est exprimé uniquement dans les cellules de la peau et excise une séquence qui empêche la transcription de l’oncogène, autorisant ainsi l’expression de l’oncogène. Pour produire une descendance avec les deux transgènes, des souris hétérozygotes pour chaque transgène sont accouplées. Le génotypage est alors utilisé pour identifier la descendance désirée.

Parfois il peut ne pas être possible de génotyper des souris avant une expérience. Par exemple, dans cette étude du rythme cardiaque embryonnaire, il n’est pas faisable de collecter des tissus d’embryons pour le génotypage sans perturber leur comportement. Par conséquent, les positions de l’embryon à l’intérieur de la mère sont d’abord prudemment labélisées, puis des mesures aux ultrasons sont enregistrées. Ensuite, des biopsies de la queue sont collectées pour déterminer l’effet du génotype sur le rythme cardiaque.

Cette vidéo a montré une méthode d’extraction d’ADN, mais il y a beaucoup de variations. Par exemple, le système de PCR Directe nécessite moins de 5 minutes de digestion de tissu. De plus, après avoir séparé par centrifugation le matériel non digéré, le supernageant est prêt pour la PCR, ce qui élimine le besoin de purification de l’ADN.

Vous venez de regarder le guide de JoVE sur le génotypage de souris. Dans cette vidéo, nous avons vu les bases de la génétique chez la souris, comment préparer et analyser des échantillons d’ADN de souris, ainsi que quelques utilisations pratiques de cette technique. Merci de nous avoir regardés !