Genotypisierung ist ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von spezifischen DNA-Sequenzen in dem Genom eines bestimmten Organismus. Da Gene den Phänotyp der Maus beeinflussen können, ist die Möglichkeit, den Aufbau oder den "Genotyp" einer individuellen Maus zu untersuchen entscheidend zur Prüfung eines Phänotyps eines spezifischen Gens. Dieses Video untersucht die Mausgenetik, demonstriert wichtigste Schritte des Genotypisierungsverfahrens und erklärt, wie man PCR-basierte Genotypisierungsergebnisse interpretiert.
Um zu verstehen, was Forscher suchen, wenn sie Mäuse genotypisieren, wollen wir einige allgemeine Manipulationen der Mausgenetik besprechen.
Um ein Gen zu untersuchen, stören Wissenschaftler häufig die Funktion dieses Gens, indem Sie dessen Gensequenz verändern. Allerdings sind Mäuse diploid, daher haben sie zwei Kopien von jedem Gen. Da die meisten Gene nur eine normale Kopie benötigen um zu funktionieren, müssen die Mäuse so gezüchtet werden, dass beide Gene inaktiviert sind, bevor man den Phänotyp untersuchen kann.
Dieser Genotyp wird als "homozygoter Knockout" oder häufiger und kürzer einfach
"Knockout" genannt. Umgekehrt wird eine normale Maus mit zwei funktionellen Kopien als "homozygoter Wildtyp" oder nur "Wildtyp" genannt. Schließlich werden die Mäuse mit nur einer funktionellen Kopie als "heterozygot" oder "Het" bezeichnet.
Anstelle des Entfernens von genetischem Material, erfordern einige Versuche das Einfügen von DNA-Sequenzen in das Genom der Maus.
Diese eingefügten DNA-Fragmente werden "Transgene" genannt und die Mäuse, die sie tragen, sind "transgene" Mäuse. Das häufigste "Transgene", das in Mäuse eingeführt wird, reguliert die Expression des grün fluoreszierendem Proteins oder GFP aus den Quallen. Durch die Verwendung eines gewebespezifischen Promotors (eine regulatorische Sequenz, dass die Aktivität eines Gens "fördert") um die GFP-Produktion zu steuern, können Zellen aus einem spezifischen Gewebetyp leicht durch die grüne Fluoreszenz identifiziert werden.
Da viele genetische Veränderungen nicht zu einem leicht erkennbaren Phänotyp führen, wie die GFP-Expression, müssen die Mäuse genotypisiert werden, um festzustellen, welche spezifischen Tiere in den Versuchen verwendet werden sollen. Vor der Genotypisierung müssen die Mäuse sorgfältig markiert werden, damit sie später erneut identifiziert werden können. Man benötigt etwas, dass mehr beständiger ist als das. Ein übliches Verfahren besteht darin, eine Kerbe im Ohr zu machen so dass sich die Position und die Anzahl der Kerben auf eine ID-Nummer bezieht.
Sobald die Maus markiert wurde, muss eine kleine Gewebeprobe (typischerweise 2-5 mm vom Schwanz unter Verwendung einer Rasierklinge oder einer Schere) entnommen werden, aus der die DNA extrahiert wird. Wenn man das Gewebe von mehr als einer Maus sammelt, sollte man die verwendeten Teilabschnitte der Klinge markieren, um sicherzustellen, dass nicht der selbe Teilabschnitt beim nächsten Tier verwendet wird, da dies zu Kreuzkontaminationen in den Proben führen könnte.
Um den Prozess der Trennung des genetischen Materials von den anderen Komponenten des Gewebes zu beginnen, wird die Probe in Lysepuffer aufgeschlossen, der das Enzym Proteinase K enthält. Nach einer Verdauung über Nacht, wird die Probe zentrifugiert, um Haare und andere unverdaute Materialien zu pelletieren. Um die DNA von verdautem Lysat zu isolieren, ist Alkohol eine einfache und effektive Methode, um Nukleinsäuren auszufällen. Nach einer kurzen Inkubation wird die Probe erneut zentrifugiert um die DNA in einem Pellet zu sammeln.
Nach dem Waschen mit 70% Ethanol um überschüssige Salze zu entfernen, wird das DNA-Pellet in Wasser oder Puffer resuspendiert und ist bereit für die Genotypisierung.
Es gibt viele Strategien, um festzustellen, ob eine bestimmte DNA-Sequenz in der Maus vorhanden ist. Die meisten von ihnen erfordern zuerst die Vervielfältigung der genetischen Region von Interesse unter der Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion oder PCR. Weitere Informationen zur Durchführung einer PCR sind im wissenschaftlichen Bildungsteil "Leitfaden für die PCR" von JoVE zu finden.
Eine Methode um Genotypen zu unterscheiden ist die Erkennung der Größenveränderung des PCR-amplifizierten Fragments. Nehmen wir an, dass wir nach Mäuse mit einer genetischen Insertion von 700 Basenpaaren suchen. Nach der PCR sollte die Wildtyp-Bande bei etwa 200 Basenpaaren und die transgene Bande bei etwa 900 Basenpaaren sein.
Nach dem PCR-Durchlauf müssen die Reaktionsprodukte in einem angemessenen Prozentsatz des Agarose-Gels aufgetrennt werden, so können die Größen der Fragmente unterschieden werden. Die Wildtyp-Kontrolle sollte nur eine Wildtyp-Bande bei 200 Basenpaaren haben, die transgene Kontrolle sollte eine Bande bei 900 Basenpaaren haben und die Het-Kontrolle sollten beide Banden haben. Letztendlich wird eine "ohne Template" Kontrolle durchgeführt um sicherzustellen, dass die Reagenzien keinerlei kontaminierende DNA enthalten und diese Kontrolle sollte daher keine Bande erzeugen.
Da wir nun zuversichtlich sind, dass die Kontrollen wie erwartet funktioniert haben, wollen wir einen Blick auf die unbekannten Mäuse werfen. Da Maus 1 und 2 jeweils nur eine Wildtyp-Bande haben sind sie homozygot Wildtyp. Die Mäuse 4 und 6 haben jeweils nur eine transgene Bande und sind daher homozygot Transgen.
Und die Mäuse 3 und 5 haben jeweils zwei Banden und sind daher heterozygot.
Wenn man schließlich zurückgeht um die Mäuse mit dem richtigen Genotyp zu finden muss man nur das Muster der Ohr Kerben mit der ID-Nummer der Maus vergleichen.
Nachdem wir ein Verständnis gewonnen haben was die Genotypisierung ist und wie es gemacht wird, wollen wir einen Blick auf einige Beispiele werfen, warum es nützlich ist.
In einigen Fällen sind komplexere genetische Modifikationen erforderlich, um den gewünschten Phänotyp zu erzeugen. Zum Beispiel um das Modell von Hautkrebs bei Mäusen zu etablieren sind zwei Transgene erforderlich. Eins trägt ein induzierbares "Onkogen" oder ein Gen, das Krebs verursachen kann und das Zweite trägt das Enzym Cre-Rekombinase, das nur in Hautzellen exprimiert wird und eine Sequenz ausschneidet, das die Onkogen Transkription verhindert, wodurch die Onkogen-Expression ermöglicht wird. Um Nachkommen mit beiden Transgenen zu erzeugen, werden heterozygote Mäuse mit je einem Transgene miteinander gepaart. Die Genotypisierung wird dann verwendet um die gewünschte Nachkommen zu identifizieren.
Manchmal ist es nicht möglich, Mäuse vor einem Experiment zu genotypisieren. Zum Beispiel ist es in dieser Studie über die embryonale Herzfrequenz nicht möglich das Gewebe für die Genotypisierung aus den Embryos zu entnehmen ohne ihr Verhalten zu stören. Daher werden zuerst die Positionen der Embryonen innerhalb der Mutter sorgfältig markiert und danach werden Ultraschallmessungen aufgezeichnet. Zum Schluss werden Schwanzbiopsien gesammelt um die Auswirkungen des Genotyps auf die Herzfrequenz zu bestimmen.
Dieses Video zeigt ein Verfahren zur DNA-Extraktion aber es gibt viele Variationen. Zum Beispiel benötigt das direkte PCR System weniger als fünf Minuten zur Gewebe Verdauung. Darüber hinaus ist der Überstand nach der Zentrifugation vom unverdauten Material getrennt und bereit für die PCR wodurch die Notwendigkeit der DNA-Aufreinigung entfällt.
Dies war der JoVE Leitfaden für die Genotypisierung von Mäusen. In diesem Video haben wir die Grundlagen der Mausgenetik, wie man die DNA-Proben der Mäuse vorbereitet und analysiert, sowie einige praktische Anwendungen dieser Technik besprochen. Danke für das Aufpassen!
