This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).

1. Mise en place et entretien de E. Cultures histolytica <ol><li> Cultivez axéniquement (entièrement libre de tous les autres organismes contaminants) 1 x 10 5 trophozoïtes de la souche de Entamoeba histolytica HML: IMSS cloner un 18 en 16 x 125 tubes de culture en mm avec revêtement Téflon capsules à vis en ligne (ou 1 x 10 6 trophozoïtes dans un jetable T- 25 flacon) et 15 ml (ou 50 ml en flacon T-25) de TYI-S-33 moyen (bouillon TYI complété avec 3% d&#39;un mélange de diamant de la vitamine, 10% de sérum de chaleur de bovin adulte inactivé, 0,5 UI / ml de pénicilline et 35 pg / ml de streptomycine) 19 dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> trophozoites de récolte au cours de la phase de croissance logarithmique habituellement à des intervalles de 48 à 96 hr (figure 1) en refroidissant les tubes de culture pendant 5-10 min dans un bain d&#39;eau glacée pour libérer trophozoites attachés au tube de culture en verre. </li><li> Transférer la culture dans un tube conique et inverser plusieurs fois pour disperser la cells. Déterminer le nombre de cellules en utilisant un hématimètre (de Neubauer), et transférer un inoculum dans un tube de culture contenant du milieu TYI-S-33 frais. <ol><li> Utilisez faible nombre de amibes pour de plus longues périodes d&#39;incubation (~ 3 x 10 5 cellules pour ~ 5 jours) et un nombre plus élevé pour des périodes plus courtes (~ 1 x 10 6 cellules pour ~ 1 jour). Alors que inoculum comptés sont souhaitables, cultures établies deviennent prévisibles de sorte que les volumes estimés de inoculums sont réalisables. </li><li> Titrer la quantité de trophozoites d&#39;optimiser le nombre de cellules pour chaque expérience. </li><li> Maintenir une culture double parallèle d&#39;avoir un back-up en cas de contamination accidentelle ou rupture du tube. </li></ol></li><li> tubes de Cap hermétiquement et les incuber à 37 ° C en 5 ° inclinés angle horizontal. </li><li> Voir les cultures par inspection visuelle régulièrement, depuis une croissance excessive de la culture peut contenir plusieurs cellules lysées. </li></ol> 2. Mise en place et entretien de MDCK Culture &lt;/ P&gt; <ol><li> Cultivez MDCK (Madin Darby Canine Kidney) cellules de type I (haute résistance) en jetables flacons T-75 avec 10 ml de milieu DMEM complété avec de la pénicilline (100 UI / ml), la streptomycine (100 mg / ml), l&#39;insuline (0,08 U / ml) et 10% de sérum de veau nouveau-né dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 et 95% d&#39;air à 37 ° C. </li><li> Pour diviser les cellules, les vérifier sur un microscope inversé. Fractionner les cellules quand ils sont ~ 85-100% de confluence. </li><li> Utiliser un aspirateur à vide dans une hotte stérile et d&#39;une pipette Pasteur en verre stérile pour retirer une feuille à partir de la culture. Pour éviter le grattage des cellules, tourner le ballon à l&#39;envers et les médias d&#39;aspiration de l&#39;angle inférieur. </li><li> Distribuer 10 ml de PBS préchauffé (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) dans un flacon T-75 (5 ml dans le cas d&#39;un flacon T-25 ) et balancer doucement le flacon pour laver les cellules. Retirer du PBS par aspiration sous vide. Lavage approfondie est nécessaire car le sérum inhibe la trypsine. </li><li> Distribuer 1,5 ml de trypsine à 0,05% dans un flacon T-75 (T-25 pour utilisation flacon 0,5 ml) et doucement basculer le flacon pour couvrir la couche de cellules avec de la trypsine. </li><li> Incuber pendant 5-10 min dans l&#39;incubateur (heure exacte dépend de l&#39;activité de la trypsine). </li><li> Vérifiez le détachement des cellules en tenant ballon contre la lumière et rechercher des cellules circulant. détachement cellulaire (cellules arrondies) peut également être contrôlé à l&#39;aide d&#39;un microscope. Souvent, les cellules libèrent plus vite avec un rapide, claque douce sur le côté du ballon. </li><li> Ajouter 15 ml de DMEM complémenté dans un flacon T-75 (5 ml pour un flacon T-25). Remettre les cellules par aspiration et refoulement 4 ou 5 fois. </li><li> Pour propager les cellules, diluer la suspension cellulaire à 1:5 avec frais DMEM supplémenté. nombre de cellules peut également être déterminée à ce point à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre mais ce n&#39;est généralement nécessaire que si le fractionnement des cellules dans des formats spéciaux pour certaines analyses. </li></ol> 3. Préparation de Trophozoïte totale Lysats <ol><li> Détachez trophozoïtes de cudes tubes de refroidissement LTURE par le tube pendant 5-10 min dans un bain d&#39;eau glacée. Transférer de manière aseptique la culture dans un tube à centrifuger conique et à 360 xg pendant 10 min à 4 ° C. Jeter soigneusement le surnageant par décantation, ajouter du PBS glacé à la pastille, inverser le tube plusieurs fois pour disperser les cellules et centrifuger à nouveau à 360 x g pendant 10 min. Répétez cette étape deux fois pour éliminer toute trace de milieu TYI-S-33. </li><li> Déterminer le nombre de trophozoïtes utilisant un hématimètre. </li><li> Lyse trophozoïtes par les cycles de gel-dégel. Snap-geler un inoculum mesurée de trophozoïtes (600 000 trophozoïtes / ml) dilué dans du PBS glacé, dans l&#39;azote liquide pendant 1 min. Libérer l&#39;échantillon à 4 ° C et vortex vigoureusement. Répéter congélation et de décongélation trois fois pour terminer la lyse des cellules. </li><li> Activer des protéases présentes dans les lysats avec 0,02% de β-mercaptoéthanol. </li></ol> 4. Préparation de trophozoite sécrétées produits <ol><li> Effectuer les étapes 3.1 à 3.2. </li><li> Déterminernombre de cellules et la viabilité à ce point à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et l&#39;application d&#39;un test d&#39;exclusion au bleu trypan 20: <ol><li> Diluer 9 x 10 6 trophozoites dans 3 ml de PBS glacé et les cellules de transfert dans un tube conique de 50 ml. Prenez 10 pi de cette suspension et ajouter 1 pl de 0,4% solution de bleu trypan stock pH 7,2. </li><li> Utilisez une Neubauer à compter les cellules à faible grossissement. </li><li> Compter toutes les cellules et séparer le nombre de cellules bleues, puisque les cellules bleues ont pris le colorant et doivent être considérés comme morts. </li><li> Calculer le pourcentage de cellules viables en divisant le nombre de cellules viables par le nombre total de cellules et en multipliant par 100. </li></ol></li><li> Transférer le tube conique contenant la suspension de trophozoite dans l&#39;incubateur à 37 ° C pendant 2 heures dans un 5 ° inclinés angle horizontal. </li><li> Pour collecter les produits sécrétés, tubes de centrifugation à 360 g pendant 10 min. Utilisez une seringue jetable et stérile et soigneusement recueillir les supernatant, en évitant la contamination des échantillons avec des trophozoïtes de la pastille. Éliminer toutes les cellules transférées en faisant passer le surnageant à travers une membrane d&#39;acétate de cellulose de 0,22 um. Activer protéases avec 0,02% β-mercaptoéthanol. </li><li> Pour supprimer la contamination indésirable présumée à des molécules libérées par les cellules mortes, appliquez de nouveau le test d&#39;exclusion au bleu trypan pour la viabilité cellulaire. Viable nombre total de cellules et doit être le même que celui obtenu à l&#39;étape 4.2. Si ce n&#39;est pas le cas, le surnageant recueilli peut non seulement contenir des protéines sécrétées et doit être jeté. </li></ol> 5. Interaction des cellules MDCK avec Trophozoïtes, Trophozoïte Lysats ou sécrétées produits <ol><li> Incuber des monocouches de cellules confluentes MDCK avec trophozoïtes vivants (un ratio MDCK-à-amibe de 1:1), trophozoite lysats (un rapport MDCK-à-amibe de 1:2) ou de produits sécrétés (un ratio MDCK-à-amibe de 1 : 10) à 37 ° C pendant 2 min et 30 (figure 2A). </li><li> Laver les cellules épithéliales cinq fois avec du PBS glacé pour éliminer les molécules non liées ou des trophozoites. </li></ol> 6. Préparation des échantillons pour immunofluorescence <ol><li> Culture des cellules MDCK sur des lamelles de verre stériles placées à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de culture cellulaire à 24 puits multiples. Inspecter les cellules sur le microscope inversé jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent 100% de confluence. Ensuite, remplacez moyenne avec 1 ml de milieu frais DMEM supplémenté et transférer la plaque à un incubateur à 37 ° C pendant 24 heures de plus. </li><li> Supprimer le milieu à l&#39;aide d&#39;une trompe à vide et d&#39;une pipette Pasteur en verre stérile et ajouter 1 ml de PBS chaud à chaque puits. Retirer du PBS et répéter le lavage avec du PBS frais. Prendre soin de ne pas racler les cellules à partir du fond du puits à la pipette en verre. </li><li> Ajouter des conditions différentes de trophozoïtes dilué dans 1 ml de PBS chaud: trophozoïtes vivants (T), lysats totaux trophozoïtes (TL) et de produits sécrétés (SP). <ol><li> Mettez la plaque de culture dans l&#39;incubateur pendant 2 ou 30 min. </li><li> Préparer deux conditions de contrôle: un temps nommé 0 min, où les cellules MDCK doivent être non incubés avec E. histolytica, mais seulement avec 1 ml de PBS chaud; et une autre condition que le contrôle des anticorps secondaires, dans ce cas incuber MDCK avec T, TL ou SP pour 2 ou 30 min et omettre incubation avec des anticorps primaires. </li></ol></li><li> Laver les cellules épithéliales cinq fois avec du PBS froid pour éliminer les molécules non liées ou des trophozoïtes. </li><li> Fixer et perméabiliser les cellules avec 1 ml d&#39;éthanol à 96% pendant 30 min à -20 ° C. </li><li> Pour éliminer l&#39;éthanol, effectuer trois lavages rapides avec 1 ml de PBS à température ambiante. </li><li> Effectuez les étapes suivantes dans une chambre humide pour éviter le séchage des échantillons: <ol><li> Utilisez une boîte plate disponible qui peut être fermé et rempli avec une serviette de papier humide sur lequel les échantillons peuvent être placés en toute sécurité. Par exemple, une boîte de pointe de la pipette vide sert bien cet effet. </li><li> Intérieur de la chambre, placer une couche uniforme de Parafilm et pipette 25 ul de blocsolution (0,5% de BSA) tion pour chaque lamelle. </li><li> Prendre des lamelles sur les puits avec une pince fine, enlever soigneusement le liquide en excès à partir du bord avec un papier filtre et mis lamelle couvre-objet dans la goutte contenant une solution de blocage (0,5% de BSA) avec les cellules en regard de la solution de blocage. Incuber les échantillons pendant 1 heure à température ambiante. </li></ol></li><li> Préparer un mélange d&#39;anticorps primaires dans PBS: souris IgM anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; dilution 1:10) et IgG de lapin anti-ZO-1 (pα-ZO-1; dilution 1:100). </li><li> Placer une nouvelle feuille de Parafilm dans la zone humide et pipette 25 ul de solution d&#39;anticorps pour chaque lamelle. </li><li> Soulever les lamelles couvre-objet à partir de la solution de blocage, sécher tout excès de liquide au niveau des bords à l&#39;aide d&#39;un papier filtre, et les placer dans les gouttes avec les cellules faisant face à la solution d&#39;anticorps. Incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Mettez chaque lamelle dans un puits d&#39;une 24 puits multiples (côté pile sur le dessus) et ajouter 1 ml de PBS. <ol><li&gt; Lavez cinq fois avec 1 ml de PBS pour éliminer les molécules non liées. </li></ol></li><li> Préparer un mélange d&#39;anticorps secondaires fluorescents dans PBS: souris anti-IgM de chèvre couplé au FITC (dilution 1:100) et de chèvre anti-IgG de lapin couplé à TRITC (dilution 1:50). </li><li> Placer une nouvelle feuille de Parafilm dans la zone humide et pipette 25 ul de la solution d&#39;anticorps secondaire pour chaque lamelle. </li><li> Transférer les échantillons comme dans l&#39;6,10 et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité pour éviter la décoloration des colorants fluorescents. Répétez l&#39;étape 6.11.1. </li><li> Pour la coloration nucléaire, incuber pendant 3 min avec 200 ul d&#39;une solution 0,05 mM de DAPI à la température ambiante et l&#39;abri de la lumière. Répétez l&#39;étape 6.11.1. </li><li> Pour conserver les colorants fluorescents, placer les lamelles (cellules vers le bas) dans 5 pi Vecta Bouclier Antifade solution de montage sur des lames de microscope en verre. Sceller les lamelles à l&#39;aide de vernis à ongles pour éviter le séchage de l&#39;échantillon. </li><li> Pour le stockage à long terme, maintenir les diapositives d&#39;uneBoîte de lame de microscope à -20 ° C. </li><li> Analyser les préparatifs de la microscopie confocale à travers les sections Z-stack et XZ-avions (figure 2A). </li></ol> 7. Incubation de trophozoïtes avec inhibiteurs de protéase ou des anticorps spécifiques <ol><li> Répétez les étapes 03.01 à 03.02. Pour chaque condition expérimentale, incuber 1 x 10 5 trophozoïtes (remises en suspension dans 50 pl de PBS) avec des inhibiteurs de la protéase (1 mm complètes et 40 pg / ml E-64) ou 30 mg d&#39;anticorps monoclonal contre EhCPADH112 (mαEhCPADH112) 21 pendant 20 min à 4 ° C (figure 2B). Utilisez ces préparations pour essais de co-incubation, comme décrit dans l&#39;étape 8.5. </li></ol> 8. Mesures de résistance électrique transépithéliale (TER) <ol><li> Culture des cellules MDCK sur des supports perméables Transwell stériles (0,4 um de taille de pore). Dans le compartiment supérieur, placer 100 pl de suspension cellulaire et dans le compartiment inférieurplacer 600 ul de milieu DMEM supplémenté. <ol><li> Vérifiez périodiquement le niveau moyen. Du milieu frais peut être ajouté au besoin. </li><li> Inspecter les cellules sur un microscope inversé jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent 100% de confluence. Changer le milieu tous les 2-3 jours. </li><li> Pour améliorer la fixation des cellules (si nécessaire), équilibrer les filtres Transwell pendant une nuit à 37 ° C dans du DMEM avant addition de la suspension cellulaire. </li></ol></li><li> Stériliser électrodes de STX2 dans la hotte par immersion dans de l&#39;éthanol et ensuite dans de la PBS stérile pendant 15 min chacune, sous lumière UV. Connecter les électrodes à un épithéliale voltohmmeter EVOM et sélectionner le mode de résistance. </li><li> Recueillir milieu du compartiment supérieur de chaque puits transversal commun et les. Prenez 50 pi de ce mélange de médias et les combiner avec 50 pi de trophozoïtes suspension (1 x 10 5 trophozoïtes dans PBS) ou avec seulement PBS (contrôle). Utilisez un mélange similaire pour chaque transwell. </li><li> Ajouter des mélanges à la chambre supérieure de chaque containin transwellg les cellules MDCK. Les conditions expérimentales comprennent les cellules MDCK sans trophozoïtes (contrôle), une co-culture avec des formes végétatives ou trophozoïtes pré-incubées avec les inhibiteurs de protéase ou mαEhCPADH112. Pour éliminer la résistance offerte par les filtres, utiliser transwells incubées avec seulement moyen. Pour chaque condition l&#39;utilisation expérimentale d&#39;au moins trois transwells. </li><li> Immédiatement, mesurer TER en immergeant les électrodes de STX2 dans chaque transwell. <ol><li> Faire en sorte que l&#39;électrode ne touche plus le fond de la chambre inférieure et plus courte que l&#39;électrode est recouverte par le compartiment supérieur en moyenne (voir figure 2B). </li><li> Assurez-vous de tenir les électrodes perpendiculairement à chaque fois. Cela permettra d&#39;améliorer la reproductibilité, de manière significative. Évitez de déplacer ou incliner l&#39;électrode pendant les mesures, car cela conduira à une variation des données. </li></ol></li><li> Cette mesure doit être considérée comme la valeur du TER initiale. Ensuite, suivre le TER au cours de la suivante30 min. </li><li> Pour calculer la valeur de TER finale, soustraire la valeur du TER de seulement filtres. Pour comparer les résultats de différents essais normaliser chaque point de données pour les valeurs initiales, celles-ci prenant comme 100% (Figure 2B). </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MDCK+variety+pack:+choosing+the+right+strain.">The MDCK variety pack: choosing the right strain.</a> BMC Cell Biol. 12, (2011).</li><li>Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+intestinal+amebiasis:+from+molecules+to+disease.">Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease.</a> Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).</li><li>Martinez-Palomo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bases+of+the+cytolytic+mechanisms+of+Entamoeba+histolytica.">Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica.</a> J Protozool. 32, 166-175 (1985).</li><li>Martinez-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EhADH112+recombinant+polypeptide+inhibits+cell+destruction+and+liver+abscess+formation+by+Entamoeba+histolytica+trophozoites.">The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites.</a> Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).</li><li>Ocadiz-Ruiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+silencing+of+the+Ehcp112+gene+on+the+in+vitro+virulence+of+Entamoeba+histolytica.">Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica.</a> Parasit Vectors. 6, 248 (2013).</li><li>Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+imaging+techniques+to+studies+of+epithelial+tight+junctions.">Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Afin d&#39;étudier in vitro les interactions hôte-pathogène dans lors de l&#39;infection par E. épithéliale histolytica, il est essentiel de travailler avec des cultures bien établies des deux cellules épithéliales et trophozoïtes. Par exemple, autrefois, E. cultures histolytica habituellement avaient été mis en place en association avec certaines espèces de bactéries ou trypanosomatidés 22,23. Cependant, la co-culture de E. cultures...

Entamoeba histolytica est un protozoaire responsable de l&#39;amibiase humaine, une infection intestinale cellule causant l&#39;inflammation et la diarrhée. E. histolytica infecte jusqu&#39;à 50 millions de personnes chaque année, mais seulement 10% des personnes infectées développent les symptômes associés à l&#39;amibiase 1. L&#39;infection se produit lors de l&#39;ingestion d&#39;aliments ou d&#39;eau contaminés contenant E. kystes histolytica. Dans l&#39;intestin, les kystes produisent trophozoïtes vivants qui adhèrent à côlon mucine et prolifèrent 2. Trophozoïtes forment habituellement des kystes qui sont excrétés par les selles. Dans d&#39;autres cas et pour des raisons encore inconnues, trophozoïtes briser la couche épithéliale intestinale et envahissent les tissus sous-jacents. Dans le pire des cas, ils entrent dans la circulation sanguine et affectent d&#39;autres organes tels que le foie 3. Briser la barrière épithéliale nécessite bouleversement des structures transmembranaires épithéliales qui maintiennent les cellules jointes. Cellules épithélialesdes contacts sont formés par le complexe constitué de jonction étanche apical (TJ), et des jonctions adhérentes (AJ), et des desmosomes 4. Les jonctions apicales sont plus TJ, et par conséquent, ils sont la première barrière offensé par E. histolytica et d&#39;autres agents pathogènes lors de l&#39;invasion de l&#39;hôte. TJ sont constitués de récepteurs d&#39;adhésion transmembranaires telles que claudines occludine, et des molécules d&#39;adhésion jonctionnelle (JAM) qui s&#39;engagent dans des homo-ou des interactions hétérophiles avec les récepteurs de la cellule voisine. Ils sont liés par voie intracellulaire des molécules d&#39;échafaudage des zonula occludens (ZO) de la famille qui relient les récepteurs d&#39;adhésion à cytosquelette d&#39;actine de fournir un complément de résistance mécanique à l&#39;épithélium. TJ sont responsables de tissu intestinal d&#39;étanchéité à partir de la lumière intestinale, ce qui empêche l&#39;excès d&#39;eau et les fuites de soluté. Ainsi, après TJ sont perturbés par le parasite, les tissus sont envahis. E. histolytica sécrète plusieurs molécules telles que: (i) ceux qui sont impliqués dans l&#39;adhésion des amibes à targET cellules 5; (Ii) les facteurs de membrane active qui participent à la destruction des cellules hôtes par exocytose, par exemple les peptides formant des canaux-ioniques appelés amoebapores 6,7; et (iii) des protéinases qui dégradent les protéines de la matrice extracellulaire et la médiation de tissu désintégration 5,8,9. La cysteine ​​protease EhCP112 et la molécule d&#39;adhésion EhADH112 que forment ensemble le complexe EhCPADH112 sont deux E. histolytica virulence des protéines qui jouent un rôle majeur dans le démontage de TJ 10. Trophozoïtes vivants, de leurs lysats totaux et produits sécrétés induisent des changements moléculaires dans la perturbation complexe et fonctionnelle TJ de la barrière épithéliale. Dans cette étude, il est démontré que EhCP112 et EhADH112 interagissent avec occludine et la claudine-1 protéines menant à l&#39;internalisation et la dégradation des protéines cellulaires, facilitant ainsi E. entrée de histolytica par la voie paracellulaire. Nos données et celles of autres groupes 11-17 suggèrent fortement la nécessité des interactions hôte-pathogène spécifiques qui permettent l&#39;invasion du parasite. Éclaircir la base moléculaire de ces interactions est d&#39;une importance capitale pour une meilleure compréhension de la pathogenèse amibiase. Perturbation sélective de trophozoites en TJ, caractérisé par augmentation de la perméabilité paracellulaire, peut être mesurée par une diminution de la résistance électrique trans-épithéliale (TER). Le transfert des protéines parasitaires vers l&#39;épithélium de l&#39;hôte peut être déterminé par une coloration par immunofluorescence et microscopie confocale à balayage laser, une méthode qui peut également révéler la co-localisation des facteurs de virulence amibes avec des marqueurs épithéliaux jonctionnels indiquant des interactions directes possibles. Dans cet article, nous décrivons en détail comment les cellules épithéliales et les trophozoïtes sont cultivés, récoltés et manipulés pour examiner les interactions hôte-pathogène et leurs conséquences.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A&#160;</td>
			<td>IMSS Hospital, Mexico</td>
			<td>Without/number</td>
			<td>Virulent trophozoites18&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">TYI broth</td>
			<td rowspan="8">Becton, Dickinson and Company 
			Merck 
			Merck 
			Merck 
			J.T. Baker 
			Reproquifin 
			SIGMA-Aldrich 
			SIGMA-Aldrich</td>
			<td rowspan="8">211862 
			K35625437 626 
			21578 
			4873 
			3252-01 
			CAS 50-81-7 
			C7880 
			F-5879</td>
			<td rowspan="8">3.45% BBL Biosate peptone 
			58 mM glucose 
			39 mM NaCl 
			5 mM KH2PO4 
			6.5 mM K2HPO4 
			16.3 mM ascorbic acid 
			8.1 mM L-cysteine 
			&#160;0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum adult</td>
			<td>Microlab , Labs., Mex.</td>
			<td>SU146</td>
			<td>Use at 10% and inactivated to 56&#176; C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond&#160; vitamin&#160; mixture- Tween 80</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>SR-07</td>
			<td>Use at 3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#160;</td>
			<td>Lakeside,&#160; M&#233;x.</td>
			<td>34564SSA IV</td>
			<td>0.5 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin&#160;</td>
			<td>Lakeside,&#160; M&#233;x.</td>
			<td>75757SSA IV</td>
			<td>35 &#181;g/ mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps</td>
			<td>Corning-Pyrex</td>
			<td>9826-16X</td>
			<td>16x125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6 Well</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.&#160; Rings on lid prevent cross-contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 cell culture flask</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430168</td>
			<td>Canted neck flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK (Madin Darby canine kidney) type I</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL34</td>
			<td>Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium with high glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonate Calf Serum</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>S-02</td>
			<td>Use at 10%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin mixture&#160;</td>
			<td>In vitro&#160;</td>
			<td>A-01</td>
			<td>Stock solution 10,000 U/&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;&#160;</td>
			<td>AMSA</td>
			<td>398MJ94SSA IV</td>
			<td>Stock solution 100 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution&#160;</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>EN-005</td>
			<td>0.05% enzyme solution without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75cm2 cell culture flask</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430720</td>
			<td>Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3470</td>
			<td>0.4. &#181;m polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture dish&#160;&#160;</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td>Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836 153 001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>E3132</td>
			<td>Cystein protease inhibitor, final concentration 40 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p&#945;ZO-1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>402200</td>
			<td>IgG rabbit policlonal&#160; antibody&#160; against&#160; a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m&#945;EhCPADH112</td>
			<td>Homemade antibody</td>
			<td>Without/ Number</td>
			<td>IgM mouse monoclonal antibody&#160; against&#160; 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-goat anti-mouse IgM</td>
			<td>Zymed</td>
			<td>62-6811</td>
			<td>Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary&#160; antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Zymed</td>
			<td>816114</td>
			<td>Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled&#160; goat anti-rabbit IgG&#160; secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 Electrode</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>102711</td>
			<td>Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>12111</td>
			<td>Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>MEARIENFELD</td>
			<td>610610</td>
			<td>Hemocytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS_SP5_MO</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Without/number</td>
			<td>Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium for fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#180;, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D-9542</td>
			<td>0.05 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A-1310</td>
			<td>0.5%&#160; final concentration for blocking solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the epithelial damage produced by entamoeba histolytica infection

Entamoeba histolytica est l&#39;agent causal de l&#39;amibiase humaine, une cause majeure de diarrhée et abcès du foie dans les pays tropicaux. L&#39;infection est initiée par l&#39;interaction de l&#39;agent pathogène aux cellules épithéliales de l&#39;intestin. Cette interaction conduit à la rupture des structures intercellulaires tels que les jonctions serrées (TJ). TJ assurer l&#39;étanchéité de la couche epitheliale pour séparer le tissu de l&#39;hôte à partir de lumière de l&#39;intestin. Des études récentes fournissent la preuve que la perturbation de la EhCPADH112 TJ en protéine de parasite est une condition préalable à E. invasion de histolytica qui est accompagné par un dysfonctionnement de la barrière épithéliale. Ainsi, l&#39;analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans TJ démontage pendant E. invasion de histolytica est d&#39;une importance capitale pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse amibiase. Cet article présente un modèle simple qui permet l&#39;évaluation des interactions initiales hôte-pathogène et le potentiel d&#39;invasion de parasites. Paramètres à analyser sont trésistance électrique ransepithelial, l&#39;interaction de EhCPADH112 avec les récepteurs de surface épithéliales, changements dans l&#39;expression et la localisation de marqueurs de jonction épithéliales et la localisation des molécules du parasite dans les cellules épithéliales.

Pour un succès E. culture histolytica, deux conditions importantes doivent être remplies: la croissance dans des conditions axéniques et récolte en phase logarithmique. Auparavant, les cultures de E. histolytica ont facilement créé en association avec certaines espèces de bactéries ou trypanosomatidés 22. Cependant, de nos jours, il est courant d&#39;avoir la culture axénique de ce parasite qui signifie une sous-culture indéfinie des amibes dans un environnement exempt de...

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Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

L&#39;infection humaine par E. histolytica conduit à l&#39;amibiase, une cause majeure de diarrhée dans les pays tropicaux. L&#39;infection est initiée par l&#39;interaction d&#39;agents pathogènes sur des cellules épithéliales de l&#39;intestin, provoquant l&#39;ouverture des contacts cellule-cellule et par conséquent, une diarrhée, parfois suivie d&#39;une infection du foie. Cet article fournit un modèle pour évaluer les premières interactions hôte-pathogène pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse amibiase.

Analyse de l&#39;altération de l&#39;épithélium Produit par<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Maladies infectieuses

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

analysis-epithelial-damage-produced-entamoeba-histolytica

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

18.6K vues.  Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute.  L'infection humaine par E. histolytica conduit à l'amibiase, une cause majeure de diarrhée dans les pays tropicaux. L'infection est initiée par l'interaction d'agents pathogènes sur des cellules épithéliales de l'intestin, provoquant l'ouverture des contacts cellule-cellule et par conséquent, une diarrhée, parfois suivie d'une infection du foie. Cet article fournit un modèle pour évaluer les premières interactions hôte...

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In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

Test in vitro avec la méthylation de l&#39;ADN ARNt avec Entamoeba histolytica et ARNt Dnmt2 méthyltransférase (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Recherche

Immunologie et infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

Développement d&#39;un marqueur sélectionnable négatif pour les Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Application d&#39;une souris ligaturés Assay Peyer Patch anse intestinale pour évaluer absorption par les cellules bactériennes M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Isolation par cytométrie en flux des cellules primaires murins épithéliales alvéolaires de type II pour les études fonctionnelles et moléculaires

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

L&#39;analyse de l&#39;accessibilité au solvant des résidus de cystéine sur<em&gt; Cueilleur rayado fino virus</em&gt; Virus-like particles produits dans<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantes et réticulation des peptides à VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

Capsulaire sérotypage<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Par agglutination au latex

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Analyse rapide des aberrations chromosomiques dans les lymphocytes B de souris par PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

L&#39;utilisation de la technique de superposition Soft-agar à l&#39;écran pour les composés inhibitrices produites par voie bactérienne

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Imagerie de Ca2 + réponses au cours de l’Infection des cellules épithéliales de Shigella

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caractérisation des sous-ensembles de Monocyte humain de sang Flow Cytometry analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...