This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1 Préparation des réactifs internes latex <ol><li> Préparation de la glycine solution saline tamponnée (GBS) <ol><li> Ajouter 1,5 g de glycine, 11,7 g de chlorure de sodium et 100 ml d&#39;eau distillée à un bêcher de 200 ml en verre. </li><li> Mélanger jusqu&#39;à dissolution à l&#39;aide d&#39;un agitateur magnétique. </li><li> Transférer le mélange à une éprouvette de 500 ml et ajouter de l&#39;eau distillée pour faire un total de 200 ml. </li><li> Transférer la solution à la bêcher de 200 ml, vérifier le pH et ajuster à 8,2 avec de l&#39;hydroxyde de sodium 5 M. NOTE: L&#39;hydroxyde de sodium est corrosif, porter un équipement de protection personnelle. </li><li> Stériliser par filtration la solution en utilisant des filtres de 0,22 um et plusieurs seringues de 60 ml dans un ml preautoclaved vis bouteille à capsule en verre de 250. </li><li> Stocker à température ambiante. </li></ol></li><li> Préparation de GBS avec 0,2% d&#39;albumine de sérum bovin <ol><li> Ajouter 0,2 g d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) en poudre et 100 ml de GBS à un bêcher de 200 ml en verre pour dissoudre et mélanger avec un agitateur magnétique. </li><li> Filtrestériliser la solution de 0,22 uM filtres en utilisant plusieurs 60 ml seringues dans un ml preautoclaved vis bouteille en verre plafonné à 250. </li><li> Conserver à 4 ° C. </li></ol></li><li> la préparation du réactif au latex <ol><li> Étiqueter de 2 ml rondes tube de centrifugeuse bas. REMARQUE: tubes ronds de fond sont utilisés pour réduire la sédimentation des particules qui peuvent affecter la fixation anticorps. </li><li> Avec une pipette P1000 avec des pointes stériles, ajouter 975 ul de l&#39;ABG dans le tube de centrifugeuse, puis ajouter 25 ul de sérum antipneumococcique approprié pour le réactif de latex en cours de préparation (c.-à-piscine, groupe, type ou facteur). Inversez cinq fois pour mélanger. </li><li> Diluer les particules de latex de polystyrène 01:10 en ajoutant 120 ul de particules de latex à 1080 ul de solution saline physiologique stérile. NOTE: Ceci peut être effectué en de plus grands volumes, mais il convient de frais chaque fois que les réactifs sont produits en latex. </li><li> Ajouter 1000 pi de la suspension de latex 01:10 (préparé à l&#39;étape 1.3.3) à l&#39;une,000 pl 1:40 antisérum suspension (préparé à l&#39;étape 1.3.2). Inversez cinq fois pour mélanger. </li><li> Incuber à 37 ° C sur une roue en rotation lente (par exemple, quatre tours par minute pour une roue de 38,5 cm de diamètre) pendant 2 heures. </li><li> Centrifugeuse pendant 15 min à 1100 x g. Jeter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 2 ml de solution saline stérile. </li><li> Centrifugeuse pendant 15 min à 1100 x g. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de GBS et remettre délicatement le culot. </li><li> Introduire à la pipette la suspension de latex dans un étiquetés 5 ml Visser tube bouché. Ajouter un autre 1 ml de GBS. </li><li> Ajouter 2 ml de GBS contenant 0,2% de BSA (p / v) (pH 8,2) (préparé à l&#39;étape 1.2). Ajouter 40 ul de 10% (p / v) de solution d&#39;azide de sodium comme conservateur. NOTE: L&#39;azoture de sodium est dangereux en cas d&#39;inhalation, et est un irritant pour la peau et les yeux. Il est souhaitable d&#39;acheter une solution préparée de 10% plutôt que de la forme de poudre, de façon à diminuer le risque d&#39;exposition par inhalation. Équipement de protection individuelle (y compris les gants unelunettes anti-éclaboussures d) doivent être portés lors de la manipulation de ce réactif. Reportez-vous à la fiche de données de sécurité pour plus de détails. </li><li> Réactifs magasin de latex à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparation du contrôle négatif réactif latex <ol><li> Étiqueter de 2 ml rondes tube de centrifugeuse bas. REMARQUE: tubes ronds de fond sont utilisés pour réduire la sédimentation des particules qui peuvent affecter la fixation anticorps. </li><li> Avec une pipette P1000 avec des pointes stériles, ajouter 975 ul de l&#39;ABG dans le tube de centrifugeuse, puis ajouter 25 ul d&#39;antisérum de lapin normal. Inversez cinq fois pour mélanger. </li><li> Procédez comme dans les étapes 1.3.3 à 1.3.10 ci-dessus </li></ol></li></ol> 2. contrôle qualité (CQ) de latex réactifs <ol><li> Amener réactif latex à la température ambiante. Immédiatement avant l&#39;utilisation, mélanger doucement le réactif au latex en retournant le tube plusieurs fois. </li><li> Vérifiez réactif pour autoagglutination par pipetage 15 pi sur une lame de microscope en verre et procéder comme dans les étapes 4.7 et 4.8 ci-dessous. Il ne devrait pas être ungglutination des particules de latex. Le réactif doit apparaître blanche et lisse. </li><li> Testez le réactif contre un panneau de faible passage isolats de pneumocoques. Utilisez cultures fraîchement cultivés préparés comme à l&#39;étape 3 Le panneau d&#39;isolats devrait inclure des isolats du sérotype «cible» (le sérotype spécifique du réactif testé) et sérotypes «non-cibles» (les isolats d&#39;autres sérotypes qui ne devrait pas normalement franchir réagir avec le réactif). Inclure au moins un isolat de chaque cible et non-cible sérotype pour chaque réactif de latex en cours de QC. S&#39;il n&#39;y a qu&#39;une seule cible ou non cible sérotype, l&#39;essai de deux isolats différents du sérotype particulier. REMARQUE: Le panneau de test doit comporter plusieurs isolats de chaque sérotype, dont certaines sont rares dans les maladies invasives et / ou des collections de cultures de type. Il est préférable d&#39;inclure des isolats de transport, comme ils sont souvent plus exigeants pour le sérotype (données non présentées), ce qui en outre la capacité de tester of réactifs et veiller à ce que les réactifs sont susceptibles capable de sérotypage fois envahissante et transport isolats. </li><li> Procéder à des tests de réactifs de latex avec la cible et non-cible pneumocoque isolats selon la méthode décrite dans les étapes 3 et 4 ci-dessous. </li><li> réactifs de contrôle de la qualité au moment de la production, puis au moins annuellement par la suite. REMARQUE: Si un réactif ne passe pas QC, le lot doit être rejetée et une nouvelle préparation faite. En cas de répétition de l&#39;échec QC, nous vous recommandons les réactifs être produites en utilisant les autres méthodes décrites dans Ortika et al., 2013 8 et dans la discussion ci-dessous. </li></ol> 3 Préparation de cultures à pneumocoques pour sérotypage <ol><li> En utilisant une boucle stérile sélectionner une seule colonie du pneumocoque et isoler cette strie entrée sur une gélose au sang non sélective solide de sorte que l&#39;inoculum primaire couvre environ un tiers de la surface de la plaque. Série de colonies isolées. NOTE: Les plaques préparées à partir de cheval défibriné ou de sang de mouton sont adaptés; mais des plaques de sang préparés avec du sang humain ou de sang citraté sont pas. </li><li> Incuber plaque O / N à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2. </li><li> Observer la croissance sur la plaque de pureté et d&#39;évaluer qu&#39;il ya une croissance suffisante pour sérotypage. REMARQUE: Une culture pure de l&#39;isolat pneumocoque est nécessaire pour le sérotypage. Dans notre expérience, confluentes, ou près de la confluence de croissance qui représentent environ un tiers de la surface de la plaque est généralement suffisante pour achever le sérotypage. Comme les cultures de pneumocoques peuvent être sujettes à une autolyse, cultures préparées pour le sérotypage doivent être testés dans les 24 heures de la sous-culture. Ne prenez pas la plaque de culture de l&#39;incubateur plus de 15 à 20 minutes avant le sérotypage commence. </li></ol> 4 Effectuer sérotypage d&#39;agglutination au latex <ol><li> Retirez tous les réactifs au latex du réfrigérateur et leur permettre de se réchauffer à température ambiante pendant environron 30 min. Immédiatement avant utilisation, retourner doucement les tubes de mélanger les réactifs. </li><li> Étiqueter une lame de microscope. </li><li> Placez 15 pi de réactif de contrôle négatif de latex sur la lame de microscope. </li><li> Utilisation d&#39;une boucle jetable stérile de 1 ul de prendre un balayage de la culture pneumococcique sorte que la boucle est approximativement à moitié plein. </li><li> Étaler doucement l&#39;inoculum sur la surface de la lame à proximité de la goutte de réactif de contrôle négatif de latex. L&#39;inoculum doit être visible sur la lame de verre. </li><li> Rapidement et bien mélanger l&#39;inoculum dans le réactif contrôle de latex négatif en utilisant la boucle. Assurez-vous que la baisse ne se propage pas plus loin que sa taille initiale. </li><li> Ramassez la diapositive, tenant par les deux extrémités. Basculer la lame d&#39;avant en arrière pendant 1 min. Prenez soin de garder le liquide se déplaçant lentement, et veiller à ce que la taille de la goutte n&#39;augmente pas. REMARQUE: Vous pouvez également utiliser une bascule de la plaque. </li><li> Observer l&#39;agglutination macroscopique (c&#39;est à dire, parœil nu) et de la compensation de la suspension sur un fond noir. </li><li> Si le réactif de contrôle négatif de latex montre pas d&#39;agglutination ou de compensation continuent de tester la culture, le remplacement des réactifs essai de latex pour le contrôle négatif réactif latex dans les étapes 4.1 à 4.8 ci-dessus. Une boucle fraîche doit être utilisée à chaque fois. Procéder à l&#39;essai des réactifs au latex à partir avec les piscines. </li><li> Testez chacun des «pool» des réactifs de latex dans la succession jusqu&#39;à ce qu&#39;un test positif est obtenu. REMARQUE:. L&#39;ordre des tests des piscines peuvent être effectuées dans des «tours» pour tenir compte de l&#39;incidence locale des sérotypes particuliers (par exemple, en testant les trois piscines les plus probables à la première diapositive Si une réaction positive n&#39;est pas obtenue, puis de tester le côté le plus susceptibles de trois pools restants sur le second coulisseau, et ainsi de suite jusqu&#39;à ce qu&#39;une réaction positive est obtenue). Cela garantit que les sérotypes les plus courants sont testés en premier lieu, réduisant au minimum le temps et les réactifs nécessaires. </li><li>En utilisant la clé du fabricant de antisérums déterminer qui antisérums individu sont représentés dans la piscine positif. </li><li> Testez chacun des groupes ou des types contenus dans le pool positif individuellement afin de déterminer le «groupe» ou «type» comme dans les étapes 4.1 à 4.8 ci-dessus. </li><li> Déterminer le résultat par référence à la clé du fabricant de antisérums. Si un «type» est déterminée (par exemple, le sérotype 5), alors aucun autre essai n&#39;est nécessaire et ce résultat est enregistré. </li><li> Si un «groupe» est déterminée (par exemple, un groupe 19), puis reportez-vous à la clé des fabricants afin de déterminer les facteurs à tester. Poursuivre les essais avec les «facteur» différents réactifs de latex et de déterminer le sérotype final (par exemple, le sérotype 19B). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Agglutination au latex est une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour le sérotypage pneumocoque. Pneumocoque réactifs d&#39;agglutination au latex commerciaux sont disponibles, mais ils ne font actuellement pas tous les sérotypes pneumococciques connue 10,12. Toutefois, les réactifs d&#39;agglutination au latex peuvent être facilement produits en interne en utilisant des antisérums acheté soulevé contre les antigènes capsulaires pneumococciques spécifiques. Dans le procédé décrit ici, les anticorps sont fixés passivement à des particules de latex pour faire un ensemble de réactifs d&#39;agglutination au latex. Une réaction de latex positif se produit lorsque les anticorps spécifiques liés à des particules de latex se fixent sur ​​les antigènes de la capsule polysaccharidique pneumococcique de l&#39;isoler 18,19. Les particules de latex attachés aux anticorps permettent la réaction antigène-anticorps spécifique pour être visualisé à l&#39;œil nu. Agglutination au latex est une méthode appropriée pour les laboratoires à haut débit unD aussi pour les pays à ressources limitées. Les principaux avantages de la méthode d&#39;agglutination au latex sont que aucun équipement spécialisé est nécessaire pour effectuer le test, les réactifs ont une durée de vie d&#39;au moins 2 ans s&#39;il est entreposé à 4 ° C 8, et qu&#39;il est peu coûteux, simple et rapide à effectuer. Le sérotypage un isolat pneumococcique par agglutination au latex prend environ 10 min, et jusqu&#39;à quatre réactifs de latex peuvent être testés en parallèle sur l&#39;une diapositive. En outre, si la prévalence des sérotypes est connu pour le réglage épidémiologique, les tests peuvent être effectués dans les cycles commençant par les piscines contenant les sérotypes les plus courants est similaire à l&#39;essai Quellung 17. Cette approche réduit le nombre de tests nécessaires pour déterminer le sérotype. Le procédé est également très reproductible entre différents opérateurs (données non présentées). Un inconvénient de l&#39;agglutination au latex sérotypage est que la production des réactifs est consommatrice de temps, en prenant environ 4 h; bien reage multiplesnts peut facilement être produit en parallèle. En outre, certains antigènes sont communs entre les différents sérotypes de pneumocoques, entraînant des réactions croisées avec certains antisérums (par exemple, le sérotype 29, 42 et Groupe 35). Cependant, ces réactions croisées sont bien caractérisés en utilisant des antisérums commercial (qui est généralement préabsorbé pour éliminer les anticorps à réaction croisée plus problématiques) et tables de réaction supplémentaires sont fournies par le fabricant afin de distinguer ce qui sérotype est présent. réactifs de latex peuvent également traverser réagissent si les anticorps ne sont pas correctement alignées sur les particules de latex; ceux-ci sont détectés comme des échecs QC. Dans notre expérience, rigoureux QC est essentielle à la réussite de cette méthode, même si antisérums disponibles dans le commerce sont utilisés pour la production. QC prend environ 15 minutes par le réactif et repose sur un ensemble de QC isolats approprié comme décrit ci-dessus. La méthode décrite ici donne des réactifs qui donnent une réaction bien positif wimince de la période d&#39;essai. Dans notre expérience, les faux positifs sont rares dans la pratique (données non présentées). Réactions négatives faux occasionnels sont respectées; habituellement se rapportent à des problèmes connus avec un sérum particulier (par exemple, le sérogroupe 6 isolats peuvent pas réagir avec piscine B antisérum), ou la régulation négative de l&#39;expression de la capsule par l&#39;isolat. Utilisation de la algrorithm sérotypage fournies par le fabricant est également important, comme dans la plupart des cas une réaction faussement positive ou négative conduira à un résultat «borgne». Dans ces cas, et lorsque les réactions sont difficiles à interpréter, nous vous recommandons de répéter les essais et / ou des essais par une méthode alternative telle que la réaction Quellung. Certains dépannage est parfois nécessaire de faire réactifs au latex satisfaisants. Dans le procédé décrit ici, l&#39;anticorps est fixé à des particules de latex par adsorption passive 15,19, donc une variable critique est la concentration d&#39;anticorps utilisée, qui détermine la façon dontla surface des particules de latex est recouverte et l&#39;alignement ultérieur des sites actifs d&#39;anticorps 15,20. Par conséquent, si l&#39;anticorps en excès ou insuffisante est attaché aux particules de latex, les réactions anticorps-antigène ne seront pas optimales, et les réactifs non satisfaisantes peuvent être produites 15,20,21. Comme les titres d&#39;anticorps varient entre différents lots d&#39;antisérums, un ensemble standard de dilutions peut pas produire des réactifs qui se comportent bien 8. Un point de départ utile est d&#39;utiliser une dilution 1:40 de sérum, et si ce n&#39;est pas réussie, diluer le sérum plus loin. Dans notre expérience, cela résout généralement le problème 8. Dans un petit nombre de cas réactifs peuvent montrer faible agglutination qui n&#39;est pas accompagné par un effacement de la suspension lorsqu&#39;il est testé avec cible isole. Dans ces cas, la dilution de l&#39;antisérum n&#39;améliore pas la qualité du réactif, mais réactifs satisfaisants peuvent généralement être produites en omettant la centrifugation et des étapes de lavage 8,22 </sup&gt;. Recouvertes d&#39;anticorps particules de latex sont utilisés couramment en microbiologie de diagnostic pour la détection, l&#39;identification ou le sérotypage de nombreux microbes différents 15,20. En tant que tel, la méthode décrite ici peut être adapté à la préparation des réactifs de latex à d&#39;autres fins, à condition antisérums est disponible et les procédures adéquates sont adoptées QC.

Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) est une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les enfants de moins de cinq ans, en particulier dans les milieux pauvres en ressources de 1,2 à l&#39;échelle mondiale. Plages de la maladie à pneumocoques à des infections localisées à la vie en danger des conditions telles que la pneumonie, la septicémie et la méningite 1,2. Plus de 90 sérotypes de pneumocoques ont été identifiés sur la base de différences dans leur polysaccharide capsulaire 3. Les vaccins actuels ciblent le polysaccharide capsulaire et offrent une protection contre les principaux sérotypes responsables de la maladie invasive 4. Le sérotypage des isolats de pneumocoques est importante pour évaluer l&#39;impact de la vaccination sur le transport et la maladie ainsi que de fournir des données épidémiologiques plus large de 5,6. La méthode actuelle de «gold standard» pour le sérotypage pneumocoque est le test Quellung, mais cela prend du temps et exige une certaine habileté à perform 7. Agglutination au latex est une méthode de sérotypage solution recommandée par l&#39;Organisation mondiale de la santé 7. Agglutination au latex est rapide et simple à réaliser, et est utilisé dans de nombreux laboratoires dans le monde entier 8-11. Surtout, l&#39;agglutination au latex a montré une précision comparable à l&#39;épreuve Quellung pour le sérotypage pneumocoque 10,12-14. Dans l&#39;ensemble, cette méthode est idéale pour les paramètres de pauvres en ressources ainsi que des laboratoires à haut débit. Des réactifs d&#39;agglutination au latex («Réactifs» de latex) sont créés par la fixation d&#39;anticorps à des particules de latex 15. Dans une réaction positive, les particules marquées s&#39;agglutinent en présence de l&#39;antigène spécifique. Réactifs au latex commerciaux sont disponibles pour une gamme restreinte de sérotypes. des réactifs de latex peuvent également être préparés en interne à l&#39;aide d&#39;antisérums 10 disponibles dans le commerce. Mélanges d&#39;antisérums («pools») ainsi que des sérums spécifiques à s pneumocoqueerogroups (par exemple, un groupe 19), les sérotypes différents (par exemple, serotype 5), et à des antigènes spécifiques (les &quot;facteurs&quot;, par exemple., 19c facteur reconnaissant de sérotype 19A) destiné à définir en outre les sérotypes à l&#39;intérieur de groupes sont disponibles 16. Ce manuscrit présente les principales étapes de la production de réactifs au latex à l&#39;aide de la fixation passive de disponible dans le commerce sérums anti-particules de latex. Les aspects de contrôle de qualité (QC) de cette méthode sont décrits, et un protocole pour l&#39;utilisation de réactifs de latex pour le sérotypage pneumocoque est inclus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1085">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:263px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:299px;">Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">65984-10 ml-F</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:180px;">Antibodies Australia&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NRS-1ml</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required, bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:299px;">Pneumococcus (Neufeld) antisera</td>
			<td style="width:180px;">SSI Diagnostica</td>
			<td style="width:127px;">Various</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Sterile Bovine Albumin&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">A-4503</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Sodium azide 10% (v/v) solution&#160;</td>
			<td style="width:180px;">VWR International</td>
			<td style="width:127px;">ROAC3902/100ml</td>
			<td style="width:263px;">Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">0030 120.094</td>
			<td style="width:263px;">Round bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10241.AP</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Calibrated disposable inoculating loops 1 &#181;l</td>
			<td style="width:180px;">Copan</td>
			<td style="width:127px;">CD175SO1</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:299px;">Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">LBS 2950RC</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">5 M NaOH</td>
			<td style="width:180px;">BDH</td>
			<td style="width:127px;">10252</td>
			<td style="width:263px;">Caution: highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glycine</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10119.05</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Horse Blood Agar (HBA) plates</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PP2001</td>
			<td>Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Rotating wheel</td>
			<td style="width:180px;">Wyble Engineering Development Corporation</td>
			<td style="width:127px;">Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:299px;">Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td>
			<td style="width:180px;">Technoplas</td>
			<td style="width:127px;">S5016SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">60 ml syringes without needles</td>
			<td style="width:180px;">Terumo</td>
			<td style="width:127px;">SS-60L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:180px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:127px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Brochure on Neufeld antisera</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>Key to determining serotypes 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Key to pneumococcal factor serum</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td align="right" style="width:127px;">18058</td>
			<td style="width:263px;">For determining serotype within Groups 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">*alternative sources are available for most materials</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Une réaction de latex positif se produit lorsque l&#39;anticorps spécifique du type attaché à la particule de latex se lie à la capsule du pneumocoque, et l&#39;agglutination des particules d&#39;anticorps marqué s&#39;ensuit 15. Figure 1A montre une réaction positive, qui est caractérisé par une agglutination visible et de la compensation de l&#39;arrière-plan suspension. Une réaction négative est caractérisée par la suspension de réactif d&#39;agglutination au latex lisse et blanc restant (figure 1B). Les réactifs sont optimisés de telle sorte qu&#39;une réaction positive doit être observée avant la fin de l&#39;intervalle de temps d&#39;une minute (habituellement détectable dans environ 20 secondes). Nous ne recommandons pas à lire les réactions après l&#39;intervalle de temps de 1 min. Très rarement, des réactions afficher faible agglutination autour du bord de la goutte qui n&#39;est pas accompagné par compensation de la suspension de fond, ou semble «filandreuse» sans fond de compensation (données non présentées). Ce sont plus comme<html> ly réactions négatives. Dans de tels cas, nous recommandons de nouveaux essais et / ou d&#39;autres investigations utilisant une autre méthode de sérotypage (par exemple, la réaction Quellung 17). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: réactions d&#39;agglutination au latex positifs et négatifs. Préparations des pneumocoques isolat mélangés avec le réactif d&#39;agglutination au latex montrant une réaction positive (A) ou une réaction négative (B). Agglutination accompagné de compensation de l&#39;arrière-plan se voit dans la réaction positive (A) .Il agglutination visible, avec le réactif de contrôle négatif de latex ou dans une réaction de test négatif (B). Photographies 8 utilisés avec la permission.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Test d&#39;agglutination au latex est une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour le sérotypage Streptococcus pneumoniae, et a été largement appliqué en microbiologie de diagnostic. Ce manuscrit décrit la production en interne de réactifs d&#39;agglutination au latex, les procédures de contrôle de la qualité et de l&#39;application de cette technique à sérotypage pneumocoque.

Capsulaire sérotypage<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Par agglutination au latex

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K vues.  Murdoch Childrens Research Institute.  Test d'agglutination au latex est une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour le sérotypage Streptococcus pneumoniae, et a été largement appliqué en microbiologie de diagnostic. Ce manuscrit décrit la production en interne de réactifs d'agglutination au latex, les procédures de contrôle de la qualité et de l'application de cette technique à sérotypage pneumocoque. 

Vidéo: Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Recherche

Immunologie et infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Méthode d&#39;agglutination de particules pour l&#39;identification des poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagerie de cellules vivantes de la<emBacillus subtilis> Et Streptococcus pneumoniae À l&#39;aide automatisée de microscopie time-lapse

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caractérisation des réponses inflammatoires au cours de la colonisation intranasale avec Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d&#39;ions concentrations dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation des colorants fluorescents

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Capsulaire sérotypage des<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation de la réaction Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modèle murin du Groupe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonisation

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Un modèle de pneumonie robuste en immunocompétents Rongeurs pour évaluer Efficacité antibactérienne contre<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...