The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Tous les animaux ont été traités selon approuvé protection des animaux et l&#39;utilisation comité (IACUC) protocole MO11M29 des Johns Hopkins Medical Institutions. Consultez vos directives locales du Comité de protection et d&#39;utilisation des animaux institutionnels pour les méthodes d&#39;euthanasie approuvées. Porter des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité lors de la manipulation des fixateurs d&#39;aldéhydes ou des solvants organiques. Une. Préparation des matériaux <ol><li> Verser Assiettes SYLGARD <ol><li> Suivez les instructions du fabricant, mélanger le durcisseur avec la base, et remuez avec une tige en plastique. </li><li> Pipette ~ 35 ml Sylgard liquide par 10 cm de diamètre tissu boîte de culture. des boîtes de culture de tissus sont plus profondes que les plats bactériens standard; cela donne dégagement vertical pour les broches d&#39;insectes. </li><li> Placez le dishes sur une surface horizontale à température ambiante jusqu&#39;au lendemain. Bulles formées pendant le mélange disparaîtront. </li><li> Après la polymérisation, stocker les plaques Sylgard à la température ambiante. REMARQUE: Les plaques Sylgard peuvent être stockés à température ambiante pendant des années et réutilisés plusieurs fois jusqu&#39;à ce que le Sylgard se détache de la plaque. </li></ol></li><li> Solutions <ol><li> Benzoate de benzyle et d&#39;alcool benzylique (BBBA). Mélanger 2 volumes de benzoate de benzyle et de 1 volume d&#39;alcool benzylique. Conserver dans l&#39;obscurité dans une bouteille en verre avec un bouchon en verre ou en téflon haut. ATTENTION: Utilisé BBBA doit être convenablement traité comme les déchets de solvant organique. Ne laissez pas BBBA Contact plastique. </li><li> Solution tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 4 g PFA à 80 ml d&#39;eau, ajouter 0,1 ml de NaOH 1 N, mélanger sur une plaque chaude à ~ 70 ° C pendant environ 5 min jusqu&#39;à ce que la PFA est complètement dissous, puis ajouter 10 ml 10x PBS et porter le volume à 100 ml avec de l&#39;eau. ATTENTION: L&#39;inhalation de formaldéhyde / PFA et bbba vapeurs devrait êtreminimisée par le maintien de ces solutions dans des récipients couverts. Formaldéhyde / PFA est un cancérogène. </li><li> Oil Red O. Préparez 0,5% stock dans de l&#39;isopropanol. Immédiatement avant utilisation diluées avec de l&#39;eau à une concentration finale de 0,3% Oil Red O, puis filtrer à travers un filtre de 0,2 um. </li></ol></li></ol> 2. Dissection de la peau, la fixation et de compensation <ol><li> Dorsale peau pour Immunocoloration et mélanine Imaging <ol><li> Pour les très jeunes souris (par exemple, les fœtus et jour postnatal (chiots P) 0-P3), euthanasier les souris par inhalation d&#39;isoflurane. Euthanize souris âgées par inhalation d&#39;isoflurane ou par injection de kétamine / xylazine suivie par dislocation cervicale. </li><li> Retirer les cheveux avec un rasoir électrique et le gel de l&#39;épilation. Pour les jeunes souris à P8, cette étape peut être sautée. </li><li> Utiliser une lame de rasoir pour faire une coupe horizontale à partir de la base de la queue le long de chaque flanc, en passant sur la face dorsale de la base de chaque branche, en procédant latérale pour les oreilles et finment au niveau du nez. </li><li> Retire la peau de la procédure de tissu sous-jacent d&#39;arrière en avant en tenant la peau entre les doigts gantés de sorte qu&#39;il ne soit pas écrasé par une pince. Lorsque le pelage de la peau au niveau des oreilles, la première coupe les oreilles avec une paire de ciseaux et procéder notamment lentement que la peau peut se déchirer à cet endroit. </li><li> Partir de ce point, orienter la peau avec l&#39;intérieur vers le haut. Epingler la peau de Sylgard avec ~ 20 broches insectes régulièrement espacées autour de la périphérie; ne pas trop étirer pas la peau (figure 2B). Couvrir la peau avec 10-20 ml de PBS. </li><li> Disséquer la graisse associée peau et du tissu conjonctif à l&#39;aide des pinces angulaires ou courbes avec l&#39;extrémité pointue de la pince face horizontalement afin de minimiser le risque que les pinces seront pénétrer dans la peau. Extruder les bulles d&#39;air qui ont été emprisonnés sous la peau par de douces d&#39;un coton-tige sur la surface de la peau. NOTE: Si la peau est en trainêtre utilisé pour immunomarquage montage à plat ou histochimie, enlever le plus de tissus conjonctifs que possible; si la peau est en train d&#39;être utilisée pour visualiser les follicules pileux sur la base de la mélanine pigmentation, l&#39;élimination complète de moins de tissu conjonctif est satisfaisante. Peau prénatal nécessite un minimum de &quot;nettoyage&quot; du tissu conjonctif adhérent. </li><li> Fixer la peau goupillé en ajoutant 20 ml de 4% fraîchement préparé PFA / PBS ou de formaline à 10% tamponnée par 10 cm de plaque Sylgard (si la peau est utilisée pour l&#39;imagerie de la mélanine ou la phosphatase alcaline (AP) histochimie) ou 20 ml de fraîchement préparée PFA 2% / PBS (si la peau sera utilisée pour immunologique ou transgénique visualiser kératine (KRT) 17-GFP 11), et tourner doucement la nuit dans une chambre froide. Le lendemain, laver dans du PBS pendant&gt; 10 min. NOTE: formol standard est de 37% de formaldéhyde; par conséquent, &quot;10% de formol&quot; est de 3,7% de formaldéhyde. </li><li> Pour la coloration AP et immunologique, continuer dans la section 3. Pour mélanine imagment, déshydrater la peau à travers une série d&#39;éthanol à (70%, 95%, 100%), un jour pour chaque étape, avec une rotation horizontale douce à température ambiante. Retirer les tissus conjonctifs résiduelles. </li><li> Avec la peau 100% d&#39;éthanol, retirer les broches d&#39;insectes et, si désiré, couper la peau avec des ciseaux pour enlever le plus périphérique de 1-2 mm de la peau avec les trous d&#39;épingle. </li><li> Transférer la peau dans un plat en verre de 10 cm de diamètre, placer deux lames de microscope en verre sur la peau pour l&#39;empêcher de curling, et ajouter 20 ml de BBBA. BBBA durcit rapidement le tissu de sorte qu&#39;il est important pour la peau d&#39;être aplatie sous le poids des plaques de verre avant d&#39;ajouter le BBBA. </li><li> Au cours des prochaines heures, lever les diapositives sur la peau pendant quelques secondes pour permettre au BBBA à laver sur la peau. REMARQUE: Portez des gants lorsque vous travaillez avec BBBA. Selon l&#39;âge et le lieu de la peau, il peut y avoir jusqu&#39;à 30% de retrait dans BBBA. </li></ol></li><li> peau des pieds pour l&#39;analyse des follicules pileux Patterning REMARQUE: La gamme d&#39;âges habituellement examinées est P1-P8. <ol><li> Après l&#39;euthanasie, couper les pieds au-dessus de la cheville et faire une seule coupe droite le long de la surface ventrale par la plante des pieds. </li><li> Retirez délicatement la peau du tissu sous-jacent, de procéder à une extrémité proximale de direction distale. </li><li> Couper les chiffres de libérer la peau et la broche à SYLGARD avec la surface intérieure vers le haut (figure 2C). Il est minimal du tissu conjonctif de la peau du pied. </li><li> Peau transgénique Krt17-GFP est maintenant prêt pour l&#39;imagerie. Pour l&#39;imagerie de mélanine procéder à la fixation, la déshydratation et BBBA compensation tel que décrit à la section 2.1. </li></ol></li><li> peau des pieds pour visualiser glandes sébacées <ol><li> Après l&#39;euthanasie, enlever les poils en frottant gel dépilatoire sur la surface de la peau avec un doigt ganté et le pouce; attendre pendant 10 min. NOTE: Ne pas utiliser un rasoir électrique, qui peuvent endommager la peau de pied délicat. </li><li> Wcendre la surface de la peau avec de l&#39;eau du robinet, disséquer et épingler la peau de Sylgard comme décrit dans la section 2.2. </li><li> Fixer avec 1% de PFA / PBS pendant 30 min à température ambiante, puis lavez en PBS. REMARQUE: Pour visualiser les glandes sébacées sur les pieds, qui se développent après la première semaine après la naissance, l&#39;âge optimal pour l&#39;analyse avec Oil Red O est P21, car cela marque le nadir de la pigmentation des cheveux pendant le premier cycle de cheveux 12, et par conséquent, les glandes sébacées on peut le voir plus facilement. Avec la souris albinos cette analyse pourrait être effectuée à tout âge. Pour obtenir des descendants des souris mutantes pigmentée croix albinos à une lignée mutante tyrosinase comme C57BL/6J-Tyr c-2J. </li></ol></li><li> Préparation queue de la peau pour l&#39;analyse de mélanine Distribution, follicule pileux Orientation et glande sébacée Visualisation <ol><li> Après l&#39;euthanasie, faire une coupe circulaire autour de la base de la queue, puis une fente longitudinale qui s&#39;étend le long de la queue le long de sa face ventrale. </li> &lt;li&gt; Retirez la peau de la queue à partir de la pointe en tenant fermement le bout de la queue d&#39;os et / ou de tissu conjonctif avec une paire de pinces et la peau avec une deuxième paire de pinces. Epingler la queue à la peau Sylgard. </li><li> Pour l&#39;analyse de la répartition de la mélanine du follicule pileux et l&#39;orientation, fixer et traiter la peau tel que décrit à la section 2.1. Pour l&#39;analyse des glandes sébacées, couper la peau de la queue en une série de segments ~ 0,5 à 1 cm de longueur avant la fixation et incuber les morceaux de peau en mM EDTA PBS / 5 pendant une nuit à 37 ° C pour affaiblir le derme-épiderme adhérence 13. </li><li> Retirez délicatement l&#39;épiderme du derme, l&#39;épiderme à la broche Sylgard (face intérieure vers le haut), et le fixer à 4% PFA / PBS pendant 1 heure à température ambiante. Laver avec du PBS, et tacher avec Oil Red O comme décrit ci-dessous. REMARQUE: Un rasoir électrique et / ou gel d&#39;épilation peuvent être utilisés avant la dissection plus peau de la queue (par exemple, P21), mais ce traitement est facultative puisque le poil de la queue n&#39;est pasaussi dense que ailleurs sur le corps. </li></ol></li></ol> 3. Réactions de coloration <ol><li> Phosphatase alcaline placentaire humaine (AP) histochimie pour visualiser génétiquement marqué Axon Tonnelles 10,14,15 (figures 3A, B) <ol><li> Après PFA fixation sur Sylgard, placez peaux fixes dans un plat en verre de 10 cm et plongez dans PBS / 1 mM de MgCl2. Tournez doucement le plat dans un bain d&#39;eau à 70 ° C pendant 90 min à détruire l&#39;activité de la phosphatase endogène. </li><li> Visualiser l&#39;activité du rapporteur AP histochimique avec une incubation de 4 à 48 h à la température ambiante dans du Tris 0,1 M, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl 2, 0,34 pg / ml de NBT et 0,175 ug / ml de BCIP, en utilisant typiquement de 10 à 15 ml de solution de coloration par P21 peau dorsale. Surveillance de la réaction sous le microscope de dissection, en prenant soin de ne pas laisser passer au-delà de la période optimale, à en juger par l&#39;inspection visuelle de l&#39;axone coloration intensité relative au dépôt NBT non spécifique. </li&gt; <li> Arrêter la réaction par lavage avec trois changements de PBS contenant 0,1% de Tween-20 au cours de 1 heure, re-broches les peaux à Sylgard, déshydrater la peau à travers une série d&#39;éthanol, puis transférer les peaux dans un plat de 10 cm avec BBBA. REMARQUE: BBBA dissout lentement le précipité NBT. Pendant les premières heures de BBBA, une amende fond de précipité NBT va se dissoudre; par conséquent, la solution BBBA s&#39;assombrit, et la peau alléger. Changer de BBBA frais après quelques heures. </li><li> Après l&#39;imagerie de la peau AP-souillé, transférer à l&#39;éthanol pour&gt; 1 h à température ambiante, puis le stocker dans de l&#39;éthanol frais à -20 ° C. Peaux AP-colorées peuvent être stockés de cette manière pendant plusieurs mois sans perte de signal. </li></ol></li><li> Oil Red O coloration pour visualiser glandes sébacées 4 (figures 3C-F) <ol><li> Retirer les repères d&#39;insectes et de transférer le pied fixe ou légèrement peaux de queue de la plaque de Sylgard dans les puits d&#39;une plaque de culture tissulaire à 6 puits, avecjusqu&#39;à deux échantillons de peau par puits. Laver avec de l&#39;isopropanol 60:40: l&#39;eau pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Colorer dans 2 ml de 0,3% Oil Red O 60:40 isopropanol: eau (voir section 1.2) à la température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Laver avec de l&#39;isopropanol 60:40: eau pendant 5 min à température ambiante, suivi d&#39;un lavage à l&#39;eau. Couper avec précaution loin des bords de la peau, y compris les trous d&#39;épingle, avec des ciseaux fins pour que la surface de la peau peut être fait le plus plat possible. </li><li> Placez la peau sur une lame avec la surface extérieure vers le haut, ajouter quelques gouttes d&#39;eau ou de milieu de montage aqueux, couvrir la peau avec une lamelle, puis scotchez délicatement la lamelle sur la lame pour aplatir davantage la peau. </li></ol></li><li> Appartement Mont Immunocoloration 4,16,17 (figures 3G, H) <ol><li> Découpez un rectangle de peau PFA fixe (par exemple 1 cm x 0,5 cm), marquant son orientation avec une coupe asymétrique (par exemple, couper le coin droit antérieur). Effectuez l&#39;incubation etétapes de lavage avec une légère rotation sur une plate-forme horizontale tournant. Dans les puits d&#39;une 6 - ou plaque à 12 puits pour culture de tissus, laver à plusieurs reprises avec du PBS pour éliminer PFA résiduel, laver avec ~ 10 changements de PBS avec 0,3% de Triton X-100 (0,3% PBST) plus de 5-8 heures à la température ambiante, pour perméabiliser la peau. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps primaire à 0,3% du PBST avec 5% de sérum de chèvre et 20% de DMSO, pendant cinq jours à la température ambiante. Couvrir les puits de la plaque avec du ruban adhésif transparent ou en plastique adhésif pour éliminer les pertes par évaporation. </li><li> Laver avec de 10 à 15 changements de PBST 0,3% au-dessus de 8.5 hr et incuber avec un anticorps secondaire dans du PBST à 0,3% avec 5% de sérum de chèvre et 20% de DMSO pendant 3 jours à température ambiante. </li><li> Laver avec 10-15 changements de 0,3% PBST plus de 5-8 heures. </li><li> Déshydrater à 25%, 50% et 75% de methanol pendant 5 minutes chacun, puis 3x dans du methanol à 100% pendant 20 minutes chacun. </li><li> Effacer dans BBBA une nuit à température ambiante. REMARQUE: Plat immunologique de la peau plus jeune que monter~ P1 peut être effectuée comme décrit ci-dessus mais avec une incubation plus courte et lavez fois. Par exemple, la peau P1 peut être immunocoloré avec une nuit d&#39;incubation dans l&#39;anticorps primaire et une heure d&#39;incubation de plusieurs dans l&#39;anticorps secondaire, et intervenant lavages de seulement 2-3 heures dans 0,3% PBST. Comme indiqué ci-dessus, peaux jeunes sont aussi suffisamment minces qu&#39;ils peuvent être visualisés sans BBBA compensation. </li></ol></li><li> Visualisation Merkel amas de cellules nerveuses avec fluorescent Terminal Dye absorption (figures 3I-L) AMI-43 (vert) et AM4-65 (rouge) sont des colorants fluorescents qui pénètrent dans les cellules pouvant être fixés par l&#39;intermédiaire de canal cationique non sélectif 18. Dans la peau vivante de ces colorants sont sélectivement absorbés et concentrés dans les cellules de Merkel. <ol><li> Dissoudre 1 mg AM1-43 ou AM4-65 dans 2 ml de PBS et de stocker en aliquots à -80 ° C. </li><li> Injecter nouveau-nés voie sous-cutanée avec 2-10 pg colorant par rapport au poids de corps de gramme en utilisant une aiguille 29 G. </li><li> Un jour plus tard, euthanasier les souris et dissect les peaux dorsales. </li><li> Fixer les peaux à 4% PFA / PBS à 4 ° C pendant la nuit, se laver avec du PBS, et monter la peau tel que décrit dans la section 3.2. </li></ol></li></ol> 4. D&#39;imagerie et d&#39;analyse de l&#39;image <ol><li> Imagerie follicule pileux Orientation (Figure 4) <ol><li> Utiliser un microscope de dissection à l&#39;image dorsale, pied, ou peaux de la queue qui sont immergés dans BBBA, aplati sous une lame de verre, et toujours dans le plat en verre - cette approche minimise la contamination BBBA du microscope. </li><li> Éclairer le plat ci-dessous. Afin de minimiser la variation spatiale de l&#39;intensité lumineuse dans le champ de vision, d&#39;élever le verre plat à une hauteur ~ 10 cm au-dessus de la surface de travail standard de la loupe binoculaire et placer un plastique diffusant ou plaque de verre sur la source de lumière. </li><li> Retour à la peau de l&#39;éthanol à 100% pour le stockage à long terme à -20 ° C. NOTE: En sortant de la peau dans BBBA pour plus d&#39;une journée amène les granules de mélanine pour briser unepartie. Une fois que la peau a été traitée BBBA il va durcir et rester stable partir de ce point. Différentes peaux peuvent être codées avec une série d&#39;encoches à leur antérieure et / ou postérieure se termine, de sorte qu&#39;ils peuvent être stocker ensemble, pour gagner de la place dans le congélateur. </li></ol></li><li> Imagerie et traçage Axon Tonnelles (figures 3A, B) <ol><li> Placez AP teinté peau (section 3.1.3) entre deux plaques de verre du type utilisé pour les petits gels de protéines. Éviter d&#39;introduire des bulles d&#39;air entre les plaques et la peau, et ensuite soigneusement évacuer tout excès BBBA avec une serviette en papier. Placer le sandwich de type plaque-plaque sur la peau une platine de microscope (Figure 2D). </li><li> Utilisez champ lumineux ou éclairage DIC avec un objectif 10X et 2 um ou 5 um Z-étapes. Utilisez une platine XY mécanisée pour capturer un montage d&#39;images XY qui sont cousus ensemble pour créer un ensemble unique de données d&#39;échelle de gris en trois dimensions. NOTE: Pour un seul grand arbre de l&#39;axone, cet ensemble de données peut être uns grand que 5 Gb. </li><li> Effectuer manuel, automatisé ou semi-automatisé traçage des tonnelles axonales avec toute une variété de progiciels. NOTE: Des logiciels tels que Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) est un outil de reconstruction neuronale gratuit qui s&#39;exécute dans un environnement de PC et est relativement facile à maîtriser 10. </li></ol></li></ol>

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Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche.">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144, 577-589 (2011).</li><li>Orsini, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+of+preparation,+study+and+photography+of+benzyl-benzoate+cleared+material+for+embryological+studies.">Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies.</a> J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Aal Ert&#252;rk, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Maîtrise des méthodes de dissection décrites ci-dessus ne nécessite patience, d&#39;une main ferme, et quelques bons outils de dissection. La dissection de la peau dorsale est relativement facile, mais la queue et la peau de pied dissections - en particulier aux âges postnatales - sont plus difficiles. Au début des âges prénatal (par exemple, avant E15), la peau est difficile à enlever sans le déchirer. Idéalement, pour de nombreuses études sur la croissance et la structuration des structures de la ...

La peau est l&#39;un des organes les plus importants dans le corps, avec des fonctions importantes dans somato-sensation, isolation / thermorégulation, et la défense immunitaire 1. Comprendre les bases moléculaires et cellulaires du développement et de la fonction peau a été de longue date un intérêt en raison de l&#39;importance fondamentale de la peau comme un système biologique et sa pertinence pour la dermatologie. La peau des mammifères contient une variété de structures multicellulaires, y compris les couches stratifiées de kératinocytes, du tissu conjonctif dermique, plusieurs types de follicules pileux, les glandes sébacées, les muscles arrector de pili, les vaisseaux sanguins, et au moins une douzaine de classes distinctes de afférente (sensorielles) et efférentes nerf des fibres (figure 1). Les différentes régions du corps sont associées à des caractéristiquement différents types de peau. Dans la plupart des mammifères, près de la surface du corps est recouvert d&#39;une peau qui est très dense avec les follicules pileux. [Les humains et les rats-taupes nus constituent des exceptions à THest modèle.] cheveux est absent de la face palmaire des mains et des pieds, qui sont également associés avec des motifs spécialisées de l&#39;épiderme (les dermatoglyphes), les glandes exocrines, et les terminaisons nerveuses sensorielles. Les événements cellulaires et moléculaires qui contrôlent la croissance, la différenciation et la disposition spatiale des cellules dans le follicule pileux sont d&#39;un intérêt particulier que chaque follicule expositions, en miniature, un grand nombre des caractéristiques centrales de l&#39;organogenèse 2. Ces caractéristiques comprennent l&#39;existence de cellules souches et une niche de cellules souches, les migrations cellulaires précisément chorégraphiés, et l&#39;ensemble des structures multicellulaires de composants embryologiquement distinctes. Cet article décrit les méthodes de dissection, la fixation, l&#39;étiquetage et la peau imagerie de la souris comme une feuille bidimensionnelle intact, dénommé un «tout support» ou «plat monter&quot; préparation. Comme la peau de la souris est relativement mince, il est possible d&#39;image à travers toute l&#39;épaisseur de ski aplatin en utilisant la microscopie confocale classiques. L&#39;approche plat de montage à l&#39;imagerie peau de mammifère est techniquement avantageuse car elle contourne la nécessité de sectionnement physique, permettant ainsi des structures à reconstruire entièrement par sectionnement optique. Etant donné que la presque totalité de la peau est traité comme un seul objet, la monture plate approche facilite également la formation d&#39;image de plusieurs régions de la surface du corps tout en conservant des informations sur la position et l&#39;orientation par rapport aux axes du corps. Enfin, les structures à l&#39;intérieur de la peau sont généralement présents dans des motifs qui se répètent à intervalles réguliers, ce qui facilite le recueil d&#39;images à partir de plusieurs représentants d&#39;une structure donnée. Ces caractéristiques sont familiers aux neurobiologistes qui travaillent sur ​​la rétine, une partie en deux dimensions du système nerveux central qui bénéficie des avantages analogues pour les études de morphologie neuronale 3. L&#39;approche plat monter décrit ici est de utilit spécialey pour l&#39;étude des structures qui présentent une organisation spatiale sur une échelle relativement grande dans le plan en deux dimensions de la peau. Un exemple d&#39;organisation à grande échelle spatiale est la polarité coordonnée des follicules pileux et des structures du follicule associée cheveux - amas de cellules de Merkel, arrecteur muscles de pili, les glandes sébacées, et les terminaisons nerveuses 4. Les follicules pileux sont orientées selon un angle par rapport au plan de la peau, et la composante du vecteur du follicule qui se trouve dans le plan 2-dimensionnel de la peau présente généralement une orientation par rapport aux axes du corps qui est déterminée avec précision pour chaque position sur le corps. Par exemple, les follicules pileux sur le point de rostrale de retour à caudale et les cheveux sur la surface dorsale des pieds font de proximal en distal. Follicule pileux orientation est commandée par la signalisation de la polarité planaire cellulaire (PCP; également appelé polarité tissulaire 5). Ce système de signalisation a été découvert chez la drosophile, où un petitensemble de gènes de PCP de base a été trouvé pour contrôler l&#39;orientation des poils et des poils cuticulaires. Trois orthologues mammifères de gènes PCP de base - homologues crépus 6 (Fzd6, aussi appelé Fz6), cadhérine FEM LAG sept-pass récepteur de type G 1 (Celsr1), et vang-like 2 (Vangl2) - jouent des rôles analogues à des mammifères peau, de coordonner les orientations de follicules pileux avec les axes du corps. Les études de FZ6 knockout souris (Fzd6 tm1Nat, ci-après dénommé Fz6 - / -) montrent que le défaut primaire en l&#39;absence de signalisation de PCP est une randomisation initiale ou la désorganisation de l&#39;orientation du follicule pileux, sans effet sur ​​la structure intrinsèque des follicules 6-8. Un deuxième système non-PCP agit plus tard à promouvoir alignement local de follicules à proximité, ce qui conduit à la production de modèles de cheveux à grande échelle tels que tours et des touffes. Un deuxième exemple de grande échelleorganisation spatiale dans la peau est vu dans les morphologies des tonnelles axonales sensorielles. Les neurones sensoriels qui innervent la peau ont leurs corps cellulaires dans la racine dorsale et les ganglions de Gasser. Ces neurones détectent la température, la douleur, les démangeaisons, et divers types de déformations mécaniques incidentes sur la peau et les cheveux 9. Ils peuvent être divisés en sous-types basés sur le diamètre de l&#39;axone et la vitesse de conduction, de la structure de terminaison du nerf terminal, et les profils d&#39;expression de récepteurs, de canaux et d&#39;autres molécules. En raison de la forte densité d&#39;innervation à l&#39;intérieur de la peau, des analyses qui impliquent la visualisation de l&#39;ensemble des axones (par exemple, l&#39;immunomarquage anti-neurofilaments) ou même tous les axones d&#39;une seule classe (comme on le voit lorsque un seul type cellulaire est caractérisée par l&#39;expression d&#39;un rapporteur fluorescent) révèle généralement une superposition dense des axones qui rend impossible de définir la morphologie d&#39;un arbre individuel. Pour contourner ce problème, nous avons utilisé très clairsemée l génétiquement dirigéeAbeling pour produire des échantillons de peau dorsale dans laquelle chaque tonnelles axonales bien isolées sont visualisés par l&#39;expression d&#39;un journaliste histochimique, la phosphatase alcaline placentaire humaine 10. Cette approche permet la visualisation sans ambiguïté des différents morphologies axone tonnelle et une définition des types de neurones somato-sensoriel basé sur des critères morphologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM4-65</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>B-6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3-alpha smooth muscle actin antibody</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C6198</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokeratin-8&#160;</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-c</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>scissors and forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric razor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoromount G</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass dishes</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td></td>
			<td>6 cm and 10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass plates</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>SE202P-10</td>
			<td>10 cm x 8 cm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair remover&#160;</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horizontal rotating platform&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Hoefer</td>
			<td style="width:145px;">PR250 Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine/xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitroblue tetrazolium (NBT)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11383213001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:256px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">55411-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Alexa-dye conjugated&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9020938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plastic dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6- and 12-well&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology

La peau est un tissu très hétérogène. Structures intra-dermiques comprennent les follicules pileux, les muscles arrector de pili, spécialisations épidermiques (tels que des amas de cellules de Merkel), les glandes sébacées, les nerfs et les terminaisons nerveuses, et des capillaires. La disposition spatiale de ces structures est étroitement contrôlée à l&#39;échelle microscopique - comme on le voit, par exemple, dans l&#39;agencement ordonné des types de cellules au sein d&#39;un seul follicule de cheveux - et à l&#39;échelle macroscopique - comme on le voit par les orientations presque identiques de milliers de cheveux follicules au sein d&#39;une région locale de la peau. Visualiser ces structures sans sectionnement physiquement la peau est possible en raison de la géométrie à 2 dimensions de cet organe. Dans ce protocole, nous montrons que la peau de la souris peut être disséqué, fixées, perméabilisées, coloré, et a précisé que l&#39;objet de deux dimensions intact, un montage plat. Le protocole permet de visualiser facilement les structures de la peau dans leur totalité à travers toute l&#39;épaisseur de grandes surfaces de peau par optsectionnement ical et la reconstruction. Les images de ces structures peuvent également être intégrés avec des informations sur la position et l&#39;orientation par rapport aux axes du corps.

imagerie de fond clair de flatmounts de la peau peut être utilisée pour l&#39;image afférences sensorielles cutanées (figure 3A) et 10 modèles de follicules pileux sur la base de pigmentation mélanique (Figure 4). L&#39;imagerie confocale d&#39;flatmounts de la peau peut être utilisée pour définir la géométrie de (1) des agrégats de cellules Merkel, visualisées avec un anticorps anti-cytokératine-6 ​​ou à l&#39;absorption AM de teinture (figures 3I-...

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Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

La peau des mammifères contient un large éventail de structures - comme les follicules pileux et les terminaisons nerveuses - qui présentent des modèles distinctifs de l&#39;organisation spatiale. Analyser la peau comme un support plat profite de la géométrie à 2 dimensions de ce tissu pour produire toute l&#39;épaisseur des images haute résolution des structures de la peau.

Appartement Mont imagerie de la peau de souris et son application à l&#39;analyse des follicules pileux Modélisation et sensorielle Axon Morphologie

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.2K vues.  Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine.  La peau des mammifères contient un large éventail de structures - comme les follicules pileux et les terminaisons nerveuses - qui présentent des modèles distinctifs de l'organisation spatiale. Analyser la peau comme un support plat profite de la géométrie à 2 dimensions de ce tissu pour produire toute l'épaisseur des images haute résolution des structures de la peau. 

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Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Mouse Imaging neuroanatomiques par résonance magnétique

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Recherche

Neurosciences

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Préparation des tissus et des fibres Immunocoloration souris nerveuses sensitives innervant la peau et les os du membre

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Analyse en Imagerie du Neuron à l&#39;interaction Glia dans la plate-forme microfluidique Culture (MCP) à base neuronale et Axon Glia co-culture système

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-monter imagerie de l&#39;embryon de souris projections sensorielles Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagerie Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics dans les terminaux cône photorécepteur Axon de la rétine de souris

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Enregistrement combiné de Mécaniquement Stimulé Afférent Sortie et Nerve Terminal Etiquetage Souris follicule pileux lancéolées Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Surveillance optique de Living Nerve Terminal Marquer follicule pileux lancéolées Endings du<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris oreille peau

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch Clamp Enregistrement de cellules amacrines Starburst dans un plat de montage Préparation de Deafferentated Souris Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...