Ce travail a été soutenu par le Prix Carrière Burroughs Wellcome dans les sciences biomédicales (AKM), La Fondation de recherche sur Whitehall Grant (AKM), Sloan Foundation Fellowship (AKM), NIH EY019277 (AKM), et une IEN financé, formation Vision Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Pour visualiser les neurones dans le cerveau intact en utilisant microscopie à deux photons, une préparation où les neurones sont étiquetées avec des marqueurs fluorescents sont utilisés. Dans les expériences présentées ici, nous utilisons la ligne de la GFP-M de souris transgéniques dont les étiquettes couche 5 cellules pyramidales 1. Couche 5 cellules pyramidales de projet dans le processus dendritiques couches superficielles, permettant la visualisation des dendrites et des épines dendritiques jusqu&#39;à une profondeur de 300 um en dessous du niveau de la pie. Une autre approche consiste à marquer les cellules en utilisant des marqueurs viraux (voir Lowery et al., Soumis à Zeus). </li><li> Stériliser l&#39;espace de travail en utilisant 70% d&#39;éthanol et d&#39;outils autoclave pour la chirurgie aseptique. Couvrir la surface avec exploitation pansement propre. </li><li> Anesthetize souris avec un cocktail de fentanyl (fentanyl 0,05 mg / kg; midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) suivie d&#39;une dose quart de Avertin (0,0075 mg / ml) en utilisant IACUC procédures approuvées. Prétraitez souris avec l&#39;analgésique, la buprénorphine (0,5 mg / kg) administré par voie sous cutanée (SQ). Surveiller le niveau du plan d&#39;anesthésie par réaction des tests à la queue / tep pincement. </li><li> Maintenir les animaux à 37,5 ° C en utilisant couverture chauffante avec thermomètre rectal ci-joint. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter les yeux de se dessécher. Capuche avec les yeux petite feuille de papier pour protéger les yeux de la source lumineuse pendant la chirurgie. </li><li> Avec des ciseaux, enlever les poils de l&#39;arrière de la tête (derrière les oreilles) pour les yeux. </li><li> Nettoyez le dessus de la tête de l&#39;animal avec l&#39;application séquentielle de l&#39;éthanol à 70%, suivi par le maquis et la solution de bétadine bétadine. </li><li> Faire une incision coupe en L derrière les oreilles et le long soit le côté droit ou gauche de la ligne médiane (en fonction de l&#39;hémisphère dans lequel seront imagés) pour les yeux. Repliez la peau sur et loin du site de la chirurgie. Ne retirez pas la peau comme la peau sera suturé après la séance d&#39;imagerie. </li><li> En utilisant des pinces fines tirez doucement la peau et loin de votre zone d&#39;intérêt. </li><li> Doucement gratter le périoste de la zone exposée du crâne avec une pince ou une lame de nettoyage de microchirurgie. En utilisant un coton-tige, appliquez une petite quantité de chlorure ferrique 10% sur le crâne de sécher complètement la membrane du périoste et de s&#39;assurer qu&#39;il a été complètement supprimé. Il est important que le crâne est complètement sèche pour assurer adhérant correcte de la colle (voir 11). En utilisant une pince ou une lame de microchirurgie, doucement gratter la membrane du périoste séché. </li><li> Appliquer une fine couche de colle cyanoacrylate autour de la fenêtre d&#39;imagerie de la plaque de tête en acier inoxydable (voir figure 1) et y apposer la plaque sur le crâne. </li><li> Utilisation de la fin de bois d&#39;un bâton de coton-tige, appliquer la colle pour les coutures à l&#39;intérieur de la fenêtre de l&#39;imagerie; en veillant à combler toutes les lacunes entre la plaque d&#39;imagerie et de la courbure du crâne. </li><li> Déposer une goutte d&#39;accélérateur colle dans la fenêtre. Vite essuyer accélérateur de l&#39;excès de colle avec un coton-tige ou Kim essuyer. La colle doit être complètement solidifié avant de percer. </li><li> Commencez à éclaircir le crâne dans la fenêtre d&#39;imagerie utilisant une fraise de dentiste muni d&#39;une bavure inox 0,7 mm d&#39;acier. De forage en alternance avec l&#39;application occasionnelle d&#39;une solution saline stérile à 0,9% pour éviter de générer trop de chaleur sur le crâne. </li><li> Mince une fenêtre 4x4 mm sur le crâne à l&#39;aide de petits coups sur toute la surface du crâne avec la fraise de dentiste. Test de la minceur du crâne avec une pince extrémité émoussée. La surface du crâne sera tiret légèrement avec une légère pression. L&#39;épaisseur du crâne optimale pour l&#39;imagerie se situe entre 10 et 30 um. </li><li> Lorsque le crâne est mince et la fenêtre nettoyé de tous les débris, placez saline sur le crâne. Photographie de la fenêtre d&#39;imagerie avec une caméra numérique montée sur un microscope à dissection. Photographie et de l&#39;utilisation de la vascularisation du cerveau vous aideront à localiser la position de placer la plaque d&#39;imagerie pour les sessions ultérieures imagerie. </li><li> Transports à l&#39;animal de la plate-forme 2-photons. L&#39;animal doit rester sur la couverture chauffante (avec une sonde rectale) lors de la session d&#39;imagerie complet. Remarque: bien que sous sédation, la température de l&#39;animal centrale du corps va fluctuer considérablement en l&#39;absence d&#39;une unité de chaleur résultant de lésions corticales ou éventuellement la mort. </li><li> Un microscope à deux photons d&#39;un laser Mai Tai, une pompe à l&#39;état solide pour 10W de puissance maximale et une modification Olympus Fluoview confocale appareil est utilisé. Le système est optimisé pour l&#39;imagerie des tissus profonds et des détecteurs externes sont installés le plus près de l&#39;objectif que possible pour permettre la détection de la fluorescence maximale à partir du cerveau. Un Olympus FL LUMPlan / IR objectif 20X/0.95NA est utilisé. Saline à 0,9% est utilisé lors d&#39;imagerie pour la submersion objectif. </li><li> L&#39;utilisation de ce microscope, et faible zoom numérique (x1) d&#39;identifier une zone contenant des neurones vives étiquetés. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un appareil photo numérique apposée sur l&#39;oculaire de microscope, de prendre une photographie de la zone d&#39;imagerie. Alternativement, esquisser le schéma vasculaire artérielle. Cela est nécessaire pour retourner vers l&#39;emplacement d&#39;imagerie mêmes à un point du temps ultérieur. </li><li> Procurez-vous une pile faible grossissement (objectif x20, 512x512 pixels; étape 5 um) à travers toute l&#39;étendue visible du cerveau (en général couvrant ~ 200 um) montrant l&#39;étendue des ramifications dendritiques. Remarque: cette image faible grossissement sera utilisée pour localiser la zone d&#39;imagerie à des moments ultérieurs que les deux vaisseaux sanguins et des dendrites maintenir leur structure chez les animaux jeunes et adultes. </li><li> En utilisant un logiciel d&#39;imagerie (Fluoview, v. 5.0, FV300), augmenter le grossissement numérique 8 fois. Réglez la coordonnées X, Y (pan coordonnées) si nécessaire et de recueillir une pile fort grossissement qui montrera détaillée morphologie dendritique, y compris les lieux et la structure des épines dendritiques. Prenez des notes détaillées sur chaque collection pile, c&#39;est à dire pan coordonnées, la gamme de la collection, la taille z-étape et le nombre d&#39;étapes dans votre pile. Ces notes seront utilisées lors du retour à cette dendrite ou axone à un point du temps ultérieur. </li><li> Suite à l&#39;imagerie, enlever la plaque de tête en douceur la séparation plaque de surface du crâne. En utilisant des pinces, enlever toute la colle résiduelle sur le crâne et essuyez la surface du crâne avec une solution saline stérile à 0,9%. Suture de la peau sur le crâne ensemble en utilisant # 6 fil de suture. Essuyez la zone avec de l&#39;éthanol à 70%. Pour soulager la douleur lors de récupération post-opératoire, administrer 0,1 analgésiques buprénorphine mg / kg, la SQ. </li><li> Placez animal en cage propre sous une lampe chauffante jusqu&#39;à ce qu&#39;elle se réveille et est mobile. Retour à la cage des animaux d&#39;origine. </li><li> Pour les animaux réimager à un point de temps plus tard (nos points imagerie en temps peut être n&#39;importe où à partir de 2 jours à plusieurs mois d&#39;intervalle), retirer des points ou la réouverture de la peau sur la tête en utilisant des méthodes d&#39;asepsie comme ci-dessus. Utiliser l&#39;image numérique du cerveau vasculaire (pris à la date première chirurgie) pour localiser l&#39;emplacement d&#39;imagerie original. Réapposer plaque frontale en acier inoxydable (étapes 10-12). Utilisez une lame mince de microchirurgie pour doucement l&#39;écart tous les os qui pourrait avoir re-développé entre les points de l&#39;imagerie en temps. Si nécessaire, diluer avec fraise de dentiste. Fenêtre d&#39;imagerie exempt de débris et d&#39;appliquer une goutte de solution saline stérile à 0,9%. </li><li> Carry animal à deux photons de microscope et de localiser Imagerie d&#39;origine. Utilisez la photographie numérique prises pendant la session d&#39;imagerie première demande d&#39;aide. </li><li> Ouvrez le programme Fluoview et ouvrir l&#39;image grossissement original faible. Apposer une feuille de transparence à l&#39;écran de l&#39;ordinateur et esquisser le profil sanguin majeur navire utilisant un stylo transparence. </li><li> Ouvrez l&#39;image en direct et de réaligner la vascularisation artérielle au schéma esquissé sur le film transparent. </li><li> Pour l&#39;réimager 8x zoom dans les structures, ouvrent la pile désirée recueillies auprès de la séance d&#39;imagerie précédent. Esquisse de la structure (ie axonale, dendritiques, cellules gliales) sur un film transparent, apposée sur l&#39;écran d&#39;ordinateur. </li><li> Zoom 8x à partir de l&#39;image en direct et mettre la casserole coordonnées pour les premiers paramètres d&#39;imagerie par jour. Selon la précision de l&#39;alignement de l&#39;emplacement à faible grossissement, il peut être aussi nécessaire de régler l&#39;angle de l&#39;image légèrement. Une fois la structure désirée est trouvée, correspondent à la structure de votre modèle esquissé un grossissement élevé. Recueillir le z-stack avec la taille de pas identiques et le nombre de Z-stack images pour une analyse ultérieure. </li><li> Répétez les étapes 29 et 30 jusqu&#39;à ce que toutes les images à fort grossissement sont re-collectées. </li><li> Lorsque l&#39;imagerie est terminée, répétez les étapes 22-24. Re-imagerie peut être répétée jusqu&#39;à 2 points de temps séparés. </li><li> Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par le Vivarium et la division de médecine des animaux de laboratoire de l&#39;Université de Rochester School of Medicine &amp; Dentistry, en pleine accréditation par l&#39;Association pour l&#39;évaluation et l&#39;accréditation des soins des animaux de laboratoire, International (AAALAC) et sont en conformité avec la loi d&#39;Etat, une loi fédérale et la politique des NIH. </li></ol> Les résultats représentatifs Dans la GFP-M souris exprimant, un sous-ensemble de la couche 5 cellules pyramidales et correspondant processus dendritiques peuvent être facilement visualisés en utilisant 2-photons microscopie à balayage laser (2PLSM) 1. Ici, nous avons démontré une préparation éclaircis-crâne dans lequel le crâne sur l&#39;emplacement désiré imagerie est amincie à ~ 10-30 um. Effectuée correctement, notre protocole nous a permis de visualiser clairement les dendrites et les épines corticale dans le cortex visuel intact pour l&#39;analyse aiguë ou chronique (figure 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Tête de la coutume et la plaque de base (A). Vue du haut de la tête fait la coutume et la plaque de base utilisés pour la préparation chirurgie amincie crâne. Vue latérale (B) du sur-mesure tête et la plaque de base. (C, D) schéma détaillé et l&#39;image de la plaque de tête. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Figure 2" /> <strong&gt; Figure 2. Les résultats représentatifs de 2PLSM après la préparation du crâne minces. (A) dendrites imagé in vivo dans le cortex visuel d&#39;un transgéniques GFP-M souris en utilisant la microscopie à deux photons. L&#39;image est une projection de l&#39;image unique obtenus tous les 5 um de la pie-mère à une profondeur finale de 175 um. La zone encadrée en A représente la région agrandie en (B) et (C) imagé au jour 0 (J0) et quatre jours plus tard (D4). (D, E) plus fort grossissement de la branche dendritiques coffret en B et C démontrant épines stable (têtes de flèche blanche), a perdu épines rétracter / (têtes de flèche rouge) et des épines de nouvelles (têtes de flèche verte). Barres d&#39;échelle = A. 200 um, B, C. 20 um, D, E. 5 um.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

D&#39;imagerie utilisant chronique microscopie à deux photons est de plus en plus populaire d&#39;une technique pour étudier les changements morphologiques déclenchée pendant 2-5 plasticité. Ici nous démontrons une préparation éclaircis-crâne à suivre identifié épines dendritiques dans le cerveau de souris intactes les jours d&#39;imagerie. Dans ce protocole, le crâne est laissé intact, causant des dégâts minimes au cortex et résultant en des niveaux très bas de la neuroinflammation, qui peu...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomindine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Midazolam HCL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-tribromoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
</td>
</tr>
<tr>
<td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
</td>
</tr>
<tr>
<td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CWE, Inc.</td>
<td>TC-1000 Mouse</td>
<td>Body Temp. Regulation</td>
</tr>
<tr>
<td>Toberadex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eye Ointment</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Ferric Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical, Inc.</td>
<td>3120-32</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsurgical Blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Industries</td>
<td>S-6400</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 404,401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 46551</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 40140</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Zip Kicker Glue Accelerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacer Technology</td>
<td>PT-29</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K8894H</td>
<td>Taper C-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

L&#39;imagerie in vivo en utilisant microscopie à deux photons laser à balayage (2PLSM) permet l&#39;étude des cellules vivantes et des processus neuronaux dans le cerveau intact. La technique présentée ici permet l&#39;imagerie de la même zone du cerveau à différents moments (chronique d&#39;imagerie) avec une résolution microscopique, permettant le suivi des épines dendritiques qui sont les petites structures qui représentent la majorité des sites de post-synaptiques excitateurs dans le SNC. La capacité à résoudre clairement fines structures corticales plus de points plusieurs fois a de nombreux avantages, en particulier dans l&#39;étude de la plasticité du cerveau dans lequel les changements morphologiques au niveau des synapses et le remodelage du circuit peut aider à expliquer les mécanismes sous-jacents. Dans ce matériel vidéo et complémentaires, nous montrons un protocole pour l&#39;imagerie in vivo chroniques du cerveau intactes en utilisant une préparation amincie crâne. La préparation éclaircis-crâne est une approche minimalement invasive, ce qui évite les dommages potentiels à la mère et / ou du cortex, réduisant ainsi le déclenchement d&#39;une réponse inflammatoire. Lorsque ce protocole est réalisé correctement, il est possible de bien surveiller les changements dans les caractéristiques des épines dendritiques dans le cerveau intact sur une période de temps prolongée.

Watch this Scientific Journal Video about Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation at JoVE.com

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Dans ce matériel vidéo et complémentaires, nous montrons un protocole pour les maladies chroniques<em&gt; In vivo</emImagerie&gt; du cerveau intact en utilisant une préparation amincie crâne.

Imagerie chronique des souris cortex visuel en utilisant une préparation Diluée-crâne

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K vues.  University of Rochester. Dans ce matériel vidéo et complémentaires, nous montrons un protocole pour les maladies chroniques In vivo du cerveau intact en utilisant une préparation amincie crâne.

Vidéo: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Mouse Imaging neuroanatomiques par résonance magnétique

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Recherche

Neurosciences

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Préparation de Synaptoneurosomes de Mouse Cortex en utilisant un gradient de densité discontinu de Percoll-sucrose

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluée-skull Technique fenêtre corticale pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Tomographie par cohérence optique d&#39;imagerie

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imagerie fonctionnelle du cortex auditif chez chats adultes à l&#39;aide de haut-champ IRMf

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed as candidate sites for misrouting. Since a correlation between the number of lateral geniculate nucleus (LGN) relay neurons and LGN size has been shown, and based on previously reported reductions in LGN volumes in human albinism, we suggest that fiber projections from LGN to the primary visual cortex (V1) are also reduced. Studying structural differences in the visual system of albinism can improve the understanding of the mechanism of misrouting and subsequent clinical applications. Diffusion data and tractography are useful for mapping the OR (optic radiation). This manuscript describes two algorithms for OR reconstruction in order to compare brain connectivity in albinism and controls.An MRI scanner with a 32-channel head coil was used to acquire structural scans. A T1-weighted 3D-MPRAGE sequence with 1 mm3 isotropic voxel size was used to generate high-resolution images for V1 segmentation. Multiple proton density (PD) weighted images were acquired coronally for right and left LGN localization. Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired with 64 diffusion directions. Both deterministic and probabilistic tracking methods were run and compared, with LGN as the seed mask and V1 as the target mask. Though DTI provides relatively poor spatial resolution, and accurate delineation of OR may be challenging due to its low fiber density, tractography has been shown to be advantageous both in research and clinically. Tract based spatial statistics (TBSS) revealed areas of significantly reduced white matter integrity within the OR in patients with albinism compared to controls. Pairwise comparisons revealed a significant reduction in LGN to V1 connectivity in albinism compared to controls. Comparing both tracking algorithms revealed common findings, strengthening the reliability of the technique.

This manuscript describes deterministic and probabilistic algorithms for white matter (WM) reconstruction, used to examine differences in optic radiation (OR) connectivity between albinism and controls. Although probabilistic tractography follows the true course of nerve fibers more closely, deterministic tractography was run to compare the reliability and reproducibility of both techniques.

Mesure de la connectivité dans la voie visuelle primaire en albinisme humaine Utilisation Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Imagerie des cellules du Cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de Culture 2D en direct

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

Préparation d’électrodes de stimulation nerveuse périphérique pour l’implantation chronique chez les rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...