This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.

NOTE: Les préoccupations de sécurité en laboratoire Conformément aux meilleures pratiques de laboratoire standard, respectez les consignes suivantes. Conservez tous les solvants organiques dans des endroits appropriés. Gardez tous les déchets dans des conteneurs de déchets chimiques avec un étiquetage clair des compositions chimiques. Comme plusieurs réactifs utilisés dans ces protocoles sont potentiellement cancérigènes ou générer des gaz combustibles volatils, traiter tous les réactifs dans une hotte avec ventilation. Porter un équipement de protection individuelle comme des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection lorsque l&#39;on travaille avec des solvants organiques. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig1highres.jpg" width="450px" /> Figure 1. Procédure de joints glycomique en-gel. (A) Les protéines d&#39;intérêt sont séparées par SDS-PAGE, détectée par des procédures de coloration au bleu de Coomassie ou appropriés (argent), et excisées. Morceaux de gel excisés sont tranchésen petits cubes, décolorés, et on l&#39;a lavé avec de l&#39;acétate d&#39;éthyle afin de réduire les contaminants qui interfèrent avec l&#39;analyse MS ultérieure. Une partie de la tranche de gel peut être réservé pour la digestion tryptique en gel et caractérisation protéomique ultérieure par LC-MS / MS. (B) glycanes O-liés sont libérés des glycoprotéines résolues dans le gel par β-élimination réductrice. Il est essentiel également dessalage et le retrait borate par azéotrope avec du méthanol. (C) les glycanes libérés par β-élimination réductrice O-liés sont perméthylé et ensuite divisée en phases aqueuse et organique. Sulfoglycans sont quantitativement récupérées dans le (aqueuse) phase supérieure tandis que les glycanes neutres et sialylées partition dans le (DCM) couche inférieure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" width="700px" /> Figure organigramme 2. Détail de glycomique en-gel. Chaque expérital étape représentée sur la figure 1 est représenté individuellement. (A) décoloration de gel et extraction EtOAc, (b) ordonner en gel β-élimination réductrice pour la libération des glycanes O-lié, et (C) et la phase perméthylation partition. <a href="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.</a> 1. Gel excision et élimination des contaminants Gel dérivés <ol><li> Avant de commencer la procédure, préparer les produits chimiques et réactifs énumérés dans la liste des matériaux. </li><li> Résoudre les protéines sur gel SDS-PAGE en utilisant des systèmes de tampon Tris-Glycine standard. Stain protéines soit avec du bleu de Coomassie ou coloration à l&#39;argent résolu. En général, la récupération des glycanes O-liés de l&#39;argent Les gels colorés est d&#39;environ 80-90% de la valorisation atteint de Coomassie des gels colorés. </li><li> Après l&#39;électrophorèse, le gel placer sur une plaque de verre et accises til région d&#39;intérêt en utilisant un scalpel propre ou une lame de rasoir. </li><li> Pour augmenter le rendement de O-glycanes, transférer la bande de gel d&#39;intérêt sur une autre plaque de verre et couper le morceau de gel excisée en cubes d&#39;environ 2 mm. Évitez de faire des morceaux de gel de moins de 1 mm cubes car la récupération glycane est réduite. Transférez les petits morceaux de gel dans un tube de verre vis supérieure (13 x 100 mm) avec une microspatule en acier inoxydable. </li><li> Ajouter 1 ml de mM bicarbonate 25 d&#39;ammonium (AMBIC, NH 4 HCO 3) sur le tube de l&#39;échantillon, hermétiquement le tube de verre avec un haut bouchon à vis de téflon, et mélanger délicatement en tapotant le tube avant de le laisser reposer pendant 10 min. Ne pas employer une agitation vigoureuse pour éviter de déchirer les morceaux de gel. </li><li> Retirez délicatement AMBIC du tube de verre en utilisant soit une pipette en verre Pasteur ou une pipette équipée d&#39;un embout en plastique extra-longue. Évitez fracassant et le transfert des petits morceaux de gel tout en enlevant la solution AMBIC. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;acétonitrile (ACN) pour latube de verre, bouchon, et mélanger délicatement en tapotant le tube avant de le laisser reposer pendant 10 min. Faire en sorte que les morceaux de gel sont complètement recouvertes de solvant. Si nécessaire, pousser des morceaux de gel hors de la paroi du tube et en solvant avec la pointe de la pipette. </li><li> Introduire à la pipette hors ACN du tube de verre et répétez les étapes 1.5 à 1.7 jusqu&#39;à ce que la couleur bleu clair est éliminé. Répéter un minimum de cinq lavages successifs AMBIC / ACN si nécessaire. Pour l&#39;argent des gels colorés, utiliser un kit de déteindre. Passez à l&#39;étape suivante lorsque le morceau de gel se transforme en uniforme blanc dans ACN. </li><li> Introduire à la pipette tout liquide du tube de verre, reboucher le tube, ajouter 1 ml de AMBIC et laisser reposer pendant 5 min. </li><li> Retirer AMBIC et ajouter 2 ml d&#39;acétate d&#39;éthyle (EtOAc) pour le tube de verre. Recap tube avec bouchon de téflon et placer à 4 ° C pendant la nuit avec agitation de fin sur la fin ou encore effectuer trois lavages EtOAc à la température ambiante pendant 30 minutes chacun. Plus le lavage de l&#39;EtOAc, la plus efficace l&#39;élimination des contaminants. </li><li> Supprimerle dernier de l&#39;EtOAc et laver effectue trois lavages avec chacune 2 ml d&#39;H 2 O. L&#39;élimination complète de EtOAc assurera une réaction réductrice β-élimination robuste. </li><li> Pipeter de H 2 O et déshydrater le gel par lavage une fois avec 1 ml d&#39;ACN. REMARQUE: Après séchage, les gels déshydratés sont prêts à en gel β-élimination. Morceaux de gel déshydratés peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Arrêter le processus de lavage à une étape quelconque et stocker les morceaux de gel à 4 ° C pendant une nuit, quel que soit le tampon ou la solution est appliquée sur le gel (AMBIC, ACN, H 2 O). Redémarrez la préparation des échantillons à tout moment dans les 2 prochains jours. </li><li> Utiliser une partie des morceaux de gel décoloré et déshydratés pour la protéine ID par des approches protéomiques standard. </li></ol> 2. En-gel O-glycane de presse par réductrice β-élimination <ol><li> Préparer une solution stock de 1 M d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) en utilisant 50% de NaOH ou magasin NaOH solide et à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. <ol&gt; <li> Prendre 5,2 ml de NaOH à 50% (soit 4 g de NaOH solide) et ajuster le volume à 100 ml pour faire une solution de NaOH. Diluer la solution mère à 1 M de NaOH à 100 mM de NaOH, ce qui peut être stocké à 4 ° C jusqu&#39;à 6 mois sans perte d&#39;efficacité dans les réactions β-élimination réductrice. </li></ol></li><li> Assurez-borohydrure de sodium 2 M (NaBH4) dans NaOH 100 mM. Dissoudre 38 mg de NaBH 4 dans 0,5 ml de NaOH 100 mM. En général, en utilisant 0,5 à 1,0 ml de la solution de borohydrure de chaque échantillon. Faire varier le volume de la solution de réaction sur la quantité de morceaux de gel séché préparé à l&#39;étape 1. Attendre pour utiliser 0,5 ml de solution de borohydrure de 1-2 morceaux de gel excisés (étape 1.3). </li><li> Ajouter 500 ul de NaOH 100 mM pour les morceaux de gel déshydratés et laisser reposer pendant 3-5 min sur la glace afin d&#39;équilibrer le gel sur les conditions de base qui améliorent la récupération glycane. </li><li> Ajouter 500 ul de 2 M NaBH4 dans NaOH 100 mM, résultant en des concentrations finales de 1 M NaBH <sub&gt; 4 dans NaOH 100 mM. Mélanger délicatement le tube et incuber à 45 ° C pendant 18 heures. <ol><li> Pendant la première heure de l&#39;incubation, mélanger délicatement le tube toutes les 15 min. Évitez forte agitation, car il peut fragmenter les morceaux de gel. Effectuer la réaction dans un incubateur / four bien équilibrée ou dans un bloc de chauffage. Faire en sorte que les morceaux de gel sont recouverts d&#39;une solution de réaction. </li></ol></li><li> Arrêter la réaction en retirant le tube d&#39;échantillon à partir de l&#39;incubateur ou bloc chauffant et en le plaçant sur de la glace. REMARQUE: Après avoir laissé la réaction β-élimination se dérouler pendant 18 heures, le procédé de dessalage doit être effectuée dans la même journée. </li></ol> 3. dessalage sur échange de cations chromatographie <ol><li> Tout en maintenant le tube à échantillon sur de la glace pour empêcher la formation d&#39;une chaleur excessive, ajouter lentement 10% d&#39;acide acétique (AcOH), goutte à goutte afin de neutraliser la base. Vortex doucement le tube de l&#39;échantillon entre les ajouts de AcOH. Veillez à ajouter de l&#39;acide lentement et goutte à goutte comme la additisur de l&#39;acide va produire un &quot;volcan&quot; de bulles. Centrifuger le tube pour éliminer les bulles et empêcher débordement, si nécessaire. <ol><li> Afin d&#39;éliminer la grande quantité de sodium dans le mélange de réaction, passer le mélange réactionnel à travers une colonne d&#39;échange de cations de petite taille (Dowex ou résine AG-50W-X8, forme H +). </li><li> Laver la résine échangeuse de cations avec du NaOH et du HCl 1 M 1 avant l&#39;utilisation afin d&#39;éliminer les contaminants qui interfèrent avec l&#39;analyse MS, même si la résine est de qualité analytique. </li><li> Faire tremper la résine dans NaOH 1 M et éliminer la solution par décantation. Ajouter de l&#39;eau déminéralisée, éliminer l&#39;eau, puis ajouter 1 M HCl. </li></ol></li><li> Répétez ces étapes jusqu&#39;à ce que la solution ci-dessus la résine est incolore. Laver la résine nettoyée avec de l&#39;eau déminéralisée et en magasin de 5% AcOH à 4 ° C. </li><li> Pour faire une petite colonne de verre, aux rayures et briser la pointe d&#39;une pipette Pasteur en verre avec un coupe céramique de sorte que le cône de la pointe de la pipette est d&#39;environ 1 cm de long. Démêler un tampon de laine de verre et pousser vers la pointe formant un support pour le lit de résine. Fixer la colonne de pipette avec une pince à linge ou au dessus d&#39;un tube à essai en verre. </li><li> Laver la pipette vide avec 1 ml de methanol (MeOH) et de 3 ml d&#39;AcOH à 5%. Swirl H + Dowex AG50 ou échange de cations suspension de résine stockées dans 5% de AcOH et de transférer suffisamment de la bouillie pour produire un volume de lit de 1 ml dans la colonne de pipette Pasteur. </li><li> Rincer la colonne avec cinq volumes de 5% AcOH. Vérifier le débit à travers l&#39;apparition de particules de résine et ne pas utiliser la colonne si la résine est détecté. </li><li> Placez colonne sur un nouveau tube vis plateau en verre (16 x 125 mm) et de l&#39;échantillon de charge. Recueillir l&#39;écoulement à travers les glycanes et éluer avec au moins trois volumes de 5% de AcOH dans le même tube. </li><li> Couvrir le tube avec du parafilm et faire de petits trous avec une aiguille. Placer le tube de l&#39;échantillon à -80 ° C ou sur de la glace sèche. Une fois congelés, sécher l&#39;échantillon par lyophilisation. Stocker la matière séchée à -20 °C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 4. Suppression borate <ol><li> Préparer AcOH à 10% dans du MeOH. Prenez 10 ml d&#39;acide acétique glacial et ajuster le volume à 100 ml avec du méthanol. Conserver ce réactif dans un flacon en verre avec bouchon de téflon pour un maximum de 6 mois. </li><li> Ajouter 300 ul de 10% AcOH dans MeOH pour le tube de l&#39;échantillon lyophilisé séché et vortex. Retirer le triméthyl borate obtenu par evaporation sous un courant de N2. Remarque: Le mélange de sels de borate avec du methanol dans des conditions acides produit le borate de triméthyle qui est un composé volatil. </li><li> À sec sous courant de N2 à 37 ° C. Après séchage, on ajoute une autre partie aliquote de AcOH dans MeOH comme décrit dans l&#39;étape 4.2. Sécher le liquide pendant 5 min sous azote (N 2) courant à 37 ° C. <ol><li> Répétez la remise en suspension et séchage au moins 3 fois. Stocker la matière séchée à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li></ol> 5. C18 nettoyage <ol><li> Équilibrer une colonne à cartouche C18(Taille 1 ml, 100 mg de résine) en utilisant trois volumes de ACN et cinq volumes de 5% AcOH. Accélérer le passage des solutions d&#39;équilibration par application d&#39;une pression d&#39;air positive doux. </li><li> Ajouter 500 ul de 5% de AcOH dans le tube d&#39;échantillon dessalé et libre-borate et dissoudre par vortex. </li><li> Chargez échantillon remis en suspension dans la colonne C18 équilibrée et recueillir l&#39;écoulement à travers un tube en verre vis d&#39;assemblage (13 x 100 mm). Eluer O-glycanes avec 3 ml de 5% de AcOH dans le même tube. </li><li> PARAFILM le tube, faire de petits trous avec une petite aiguille ou utiliser le protège-PTFE bordée lâchement fermé pour couvrir le tube, et congeler l&#39;échantillon à -80 ° C ou sur de la glace sèche. Éliminer le solvant par lyophilisation. Conserver l&#39;échantillon séché à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 6. Préparation de base pour perméthylation NOTE: Afin d&#39;atteindre perméthylation robuste, préparer NaOH lisier frais. Toute la verrerie utilisée pour les réactions de perméthylation devrait être largement nettoyé. <ol><li> Pour préparer le réactif de base pour perméthylation, ajouter 400 ul de NaOH à 50% dans un tube à vis de haut verre propre (13 x 100 mm). Ajouter 800 ul de MeOH anhydre et vortex. </li><li> Ajouter 4 ml de sulfoxyde de diméthyle anhydre (DMSO) et pour générer des vortex se forme un précipité blanc. </li><li> Centrifuger à 600 g pendant 1 min pour sédimenter le précipité. Introduire à la pipette le surnageant et le jeter. Ajouter une période supplémentaire de 4 ml de DMSO anhydre à la pastille. Vortex. </li><li> Répétez l&#39;étape 6.2 et 6.3 au moins trois fois de plus ou jusqu&#39;à ce qu&#39;il ne se forme un précipité blanc. </li><li> Dissoudre la base pastille dans 3 ml de DMSO anhydre et mélanger délicatement à la pipette va-et-vient avec une pipette Pasteur propre. </li><li> Utilisez la base immédiatement pour la réaction de perméthylation suite car il ne peut pas être stockée. </li></ol> 7. perméthylation de glycanes libérés <ol><li> Ajouter 200 ul de DMSO anhydre à l&#39;échantillon C18 purifié et vortex ou sonicat pour remettre en suspension. </li><li> Ajouter 300 ul de la resuspsuspension de base limitée à l&#39;échantillon et ajouter immédiatement 100 pi d&#39;iodométhane (IEDM). Scellez le tube avec bouchon de téflon et vigoureusement mélanger pendant 5 min par vortex. </li><li> Pour arrêter la réaction de perméthylation, ajouter 2 ml de 5% AcOH sur glace et vortex. Pipette solution de haut en bas 5 fois afin de réduire le volume restant de MeI par évaporation. NOTE: Le AcOH neutralise la solution et l&#39;élimination du Mel augmente l&#39;efficacité de l&#39;extraction de glycanes sulfatés dans la phase aqueuse au cours de la phase partition. </li><li> Ajouter 2 ml de dichlorométhane (DCM) et le tourbillon. Centrifuger à 600 g pendant 1 min à température ambiante pour séparer les phases aqueuse et organique. </li><li> Transférer la couche supérieure (phase aqueuse qui contient la majorité des glycanes sulfatés perméthylés) dans un nouveau tube de verre (13 x 100 mm). </li><li> Ajouter 2 ml d&#39;H 2 O à la phase organique et vortex. Centrifugeuse à 600 g pendant 1 min afin de séparer les phases aqueuses et organiques et de combiner cette deuxième phase aqueuse avec le sapinphase aqueuse st (étape 7.5). </li><li> Répétez l&#39;étape 7.6 et 7,5 fois plus de trois, mais il n&#39;y a aucune nécessité d&#39;économiser les phases aqueuses obtenues à partir des partitions suivantes. </li><li> Retirer la couche finale supérieure (phase aqueuse) autant que possible à partir de la couche inférieure (phase organique) et transférer la couche inférieure (phase organique) dans un nouveau tube de verre séparé en utilisant propre pipette Pasteur. </li><li> Sécher la phase organique sous le N flux 2 à 42 ° C. </li><li> Couvrir le tube avec du parafilm et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 8. C18 nettoyage des perméthylés sulfatées O-glycanes de la phase aqueuse <ol><li> Equilibrer une colonne de cartouche de C18 avec trois volumes de ACN et cinq volumes de 5% AcOH. </li><li> Charger les phases aqueuses recueillies et combinées à partir des étapes 7.5 et 7.6 sur la colonne. </li><li> Laver la colonne avec 10 ml de H 2 O pour le dessalage. </li><li> Éluer la perméthylé sulfaté O-glycanes dans un nouveau tube de verre avec 2 mlde 50% d&#39;ACN. Utilisez une élution supplémentaire avec 85% d&#39;ACN pour améliorer la récupération de perméthylé sulfatés O-glycanes sur les grandes oligosaccharides. </li><li> Éluats sec sous courant d&#39;azote à 42 ° C. </li><li> Stocker la matière séchée à -20 ° C jusqu&#39;à 6 mois avant l&#39;analyse MS. </li></ol> 9. spectrométrie de masse de perméthylés O-glycanes <ol><li> Analyse perméthylés O-glycanes par perfusion directe dans un spectromètre de masse appropriée à l&#39;aide d&#39;une source de nanoélectronébulisation à une vitesse d&#39;écoulement de la seringue de 0,40-0,60 ul / min à 210 ° C la température capillaire. Pour fragmentation par CID dans MS / MS et MS n d&#39;un instrument de piège à ions, appliquer 30-40% de l&#39;énergie de collision. </li><li> Pour le mode ions négatifs, reconstituer perméthylé O-glycanes sulfatés dans 50 ul d&#39;un mélange méthanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM d&#39;acétate d&#39;ammonium aqueux (16: 3: 3: 2 en volume). Pour le mode d&#39;ions positifs, reconstituer perméthylée / sialylées O-glycanes neutres dans 50 pi de 1 mM sodium hydroxyde dans un mélange méthanol / eau (1: 1). </li><li> Utilisez la cartographie ionique total (TIM) et analyse de perte de neutre (balayage NL) fonctionnalité de la version de logiciel Xcalibur 2.0 pour l&#39;analyse MSN à caractériser les structures O-glycane individuels 13,19. </li></ol>

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M., Holst, O., Thomas-Oates, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+profiling+of+O-linked+glycans+released+directly+from+glycoproteins+in+gels+using+in-gel+reductive+&#946;-elimination.">Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive &#946;-elimination.</a> Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).</li><li>Anumula, K. R., Taylor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+procedure+for+preparation+of+partially+methylated+alditol+acetates+from+glycoprotein+carbohydrates.">A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates.</a> Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).</li><li>Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+developmental+elaboration+of+N-linked+glycan+complexity+in+the+Drosophila+melanogaster+embryo.">Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo.</a> J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).</li><li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Nomenclature+for+Carbohydrate+Fragmentations+in+Fab-Ms+Ms+Spectra+of+Glycoconjugates.">A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates.</a> Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Lapadula, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+3.+OSCAR:+an+algorithm+for+assigning+oligosaccharide+topology+from+MSn+data.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).</li><li>Ashline, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+structural+isomers+analyzed+by+sequential+mass+spectrometry.">Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).</li><li>Thomsson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+mucin+MG1+(MUC5B)+carries+a+repertoire+of+unique+oligosaccharides+that+is+large+and+diverse.">The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse.</a> Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).</li><li>Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+techniques+and+strategic+workflow+for+sulfoglycomics+based+on+mass+spectrometry+mapping+and+sequencing+of+permethylated+sulfated+glycans.">Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans.</a> Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+mass+spectrometry-based+sulfoglycomic+mapping+for+identification+of+terminal+sulfated+lacdiNAc+glycotope.">Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope.</a> Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).</li><li>Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+&#946;-elimination+and+aqueous-organic+partition+for+improved+O-+and+sulfoglycomics.">In-gel &#946;-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

Combining in-gel reductive &#946;-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t...

La glycosylation est une modification de post-traductionnelle des protéines essentielles, ce qui contribue à la physiologie organismal, la pathologie des tissus, et de la reconnaissance cellulaire 3.1. Malgré les importants progrès glycoscience analyse, la caractérisation de la diversité complète des glycanes sur une protéine spécifique reste une tâche extrêmement difficile, en particulier sur les protéines isolées à partir de sources biologiques primaires. Néanmoins, la microhétérogénéité de glycanes des glycoprotéines affecte fréquemment les interactions fonctionnelles avec d&#39;autres protéines. Par conséquent, la caractérisation de la diversité glycane est essentielle pour comprendre la signification physiologique de cellulaire et tissulaire glycosylation 4,5. Afin de comprendre la contribution de la glycoprotéine glycosylation à la physiologie et la physiopathologie de tissu, robuste, sensible, et les techniques d&#39;analyse glycomic complets sont devenus de plus en plus importante. Dans l&#39;analyse protéomique, les identifications de protéines sont généralement obtenus par LC-MS/ Analyse des peptides tryptiques 6 MS. La digestion des protéines peut être réalisée en utilisant une protéine purifiée ou les protéines résolues par SDS-PAGE après digestion in-gel avec des protéases telles que la trypsine 7-9. Pré-enrichissement du mélange de protéines par SDS-PAGE et améliore la précision de la profondeur de la protéine ID. L&#39;élaboration de stratégies analogues pour l&#39;analyse de la glycoprotéine glycomic glycosylation se trouve à la pointe de glycoscience. Les deux grandes classes de glycanes sont attachés à des squelettes de protéines, soit par N-lien ou O-lien. Glycanes N-liés sont liés à l&#39;asparagine (Asn) des résidus trouvés dans le cadre d&#39;un Séquon défini comme Asn-X-Ser / Thr / Cys (X est n&#39;importe quel acide aminé excepté la proline), et peut être libéré par la digestion enzymatique avec la peptide N -glycanase (PNGaseF ou A), soit en solution, en gel, ou sur-blot 10-12. glycanes O-liés sont principalement liés à la serine (Ser) ou threonine (Thr) les résidus. Cependant, seule une enzyme a été identifié qui est capable de libérer glycanes O-liés de glycoprotéine et elle a une spécificité extrêmement limité glycane, en libérant seulement les glycanes O-liés plus simples. stratégies de déversement de produits chimiques demeurent la méthode de choix pour la libération complète de glycanes O-liés de glycoprotéines. Β-élimination réductrice ou non réductrice, ou hydrazinolyse sont des techniques chimiques de démoulage bien caractérisés et sont actuellement les méthodes les plus couramment utilisées pour libérer glycanes O-liés de glycoprotéines 13,14. Bien que la β-élimination réductrice a été utilisé pour libérer des glycanes O-liés de glycoprotéines séparées par SDS-PAGE, les approches antérieures doivent séparation par HPLC de 15 à 17 pour une analyse ultérieure. Multidimensionnelle MS (MS n) analyse fournit actuellement la plus riche source de données structurelles pour la caractérisation des glycanes libérés de glycoprotéines isolées dans les montants que la plupart des sources biologiques. La profondeur de MScaractérisation structurale à base est grandement facilitée par permethylating les glycanes libérés avant leur analyse. Perméthylation ionisation augmente et tend à égaliser les réponses de signaux molaires dans un large éventail de structures de glycanes 18,19. En outre, perméthylation balises sans ambiguïté groupements oses terminaux et substitués avec des masses distinctes, renforçant ainsi élucidation de la structure 20-23. Par exemple, les acides glycanes sont généralement difficiles à détecter que les espèces non perméthylé par MS. Bien que les glycanes acides peuvent être détectés en mode d&#39;ions négatifs par MS, il est impossible de détecter à la fois acides et neutres glycanes dans le même mode d&#39;ions. Un avantage majeur de la perméthylation glycane est que tous les groupes hydroxyle libres (OH) sur substituants monosaccharide d&#39;un glycane sera coiffée par un groupe méthyle (OCH 3 ou OMe), ainsi les charges d&#39;un sialylées glycane sont neutralisés, ce qui les rend aussi détectable comme perméthylé neutre (Asielo) glycanes. Cependant, les hydroxyles de groupements sulfate sur sulfoglycans sont résistants à perméthylation, résultant de la rétention de charge anionique, qui supprime l&#39;ionisation et diminue la sensibilité. Cette suppression empêche actuellement l&#39;analyse glycomic complète des glycoprotéines très complexes tels que les mucines, qui portent une grande abondance de glycanes sulfatés 24-26. Des rapports récents sur purification sulfaté glycanes ont utilisé facturés, la chromatographie en phase inverse pour purifier et glycanes perméthylés séparés avant analyse MALDI. Cette méthode repose sur la séparation complète de glycanes sulfatés et non sulfatés en utilisant différentes phases mobiles pour élution, que nous avons trouvé à être moins sévères que le partitionnement de phase organique. Par conséquent, de nouvelles techniques adaptées à la détection et à l&#39;enrichissement de sulfoglycans sont présentés ici. Ces techniques permettent la récupération quantitative de glycanes sulfatés dans la phase aqueuse après l&#39;eau: DCM (dichlorométhane)extraction, qui est habituellement effectuée à la fin des réactions d&#39;perméthylation 27 glycane. Surtout, cette séparation robuste de sulfoglycans perméthylés partir d&#39;un mélange de glycanes non sulfatés perméthylés enrichit en même temps que pour les espèces chargées tout en simplifiant MS 2 modèles de fragmentation. Un protocole complet pour une meilleure analyse des glycanes en gel O-liés sont également présentés. Le protocole amélioré améliore la récupération glycane, augmente l&#39;information structurelle pouvant être obtenu par le biais de l&#39;analyse MS n glycanes perméthylés, et améliore la sensibilité des analyses sulfoglycomic appliquées aux glycoprotéines essentielles isolés à partir de sources biologiques. Ce protocole est destiné à l&#39;analyse glycane O-lié de glycoprotéiques extraits entiers ou d&#39;une glycoprotéine d&#39;intérêt spécifique résolu par SDS-PAGE et est composé de trois procédures expérimentales; A) un gel de nettoyage, B) dans le gel β-élimination réductrice, et C) permethy glycanelation. L&#39;objectif est d&#39;obtenir des données complètes glycomic O-liés pour glycoprotéines récoltés à partir de sources primaires d&#39;intérêt biologique (figure 1). Glycoprotéines séparées par SDS-PAGE sont visualisés par coloration et bandes d&#39;intérêt sont excisées et la bande de gel résultant est découpé en petits morceaux. Les morceaux de gel sont décolorées et soumis à des lavages à l&#39;acétate d&#39;éthyle pour éliminer les contaminants de gel (Figure 2A). Libération de glycane est obtenu par en-gel β-élimination réductrice (figure 2B) et les glycanes libérés sont perméthylée. Aqueux-organique extraction perméthylation suivant répartit quantitativement les anioniques sulfatés glycanes loin de glycanes neutres non sulfatés (figure 2C). In-gel β-élimination réductrice couplé à une extraction aqueuse-organique permet la caractérisation des glycanes et sulfoglycans O-liés libérés de petites quantités d&#39;une glycoprotéine séparés par SDS-PAGE. La vision stratégique est summarized sur la figure 1 et les détails sont présentés dans la figure 2. En outre, une partie des morceaux de gel décolorées et lavé peut être utilisé pour une protéine par des techniques protéomiques ID standards LC-MS / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:303px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:231px;">Water, deionized water</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Acetic acid, Glacial</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td style="width:303px;">Certified ACS&#8805;99.7 w/w %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td style="width:303px;">BioUltra, &#8805;99.5% (T), Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34998-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV Plus, for HPLC, &#8805;99.9%, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>34972-1L-R</td>
			<td style="width:303px;">LC-MS CHROMASOLV, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>213462-25G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99%, Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Iodomethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99.5%,&#160; Step 6.&#160; Store at 4 &#176;C until use.&#160; Sit at room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Sodium hydroxide solution, 50% w/w</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>SS254-1</td>
			<td style="width:303px;">Certified, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dimethyl sulfoxide, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>276855-1L</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, &#8805;99.9%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>322415-100ML</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, 99.8%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34856-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOL&#174;, for HPLC, &#8805;99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:231px;">Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200&#160;mesh</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>217506-500G</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">AG 50W-X8 Resin&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>142-1441</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:231px;">BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase</td>
			<td style="width:155px;">JT Baker</td>
			<td>JT-7020-01</td>
			<td style="width:303px;">Step 5 and 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bio-Safe Coomassie Stain&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>161-0786</td>
			<td style="width:303px;">G-250, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Silver Stain Kit for Mass Spectrometry</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>24600</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-16</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-15</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81265</td>
			<td style="width:303px;">volume 500&#160;&#956;L, needle size 22 ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81165</td>
			<td style="width:303px;">volume 250&#160;&#956;L, needle size 22 ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81065</td>
			<td style="width:303px;">volume 100&#160;&#956;L, needle size 22s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80965</td>
			<td style="width:303px;">volume 50&#160;&#956;L, needle size 22s ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton Calibrated Syringes</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80300</td>
			<td style="width:303px;">volume 10&#160;&#956;L, needle size 26s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Petri Dish Glass 100mm x 15mm</td>
			<td style="width:155px;">GSC INTERNATIONAL INC</td>
			<td>1500-4</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bard-Parker Surgical Blades</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>371310</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Reacti-Therm Heating/Stirring Module</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>18870</td>
			<td style="width:303px;">Step 1, 4 and 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Heating Blocks</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>125D</td>
			<td style="width:303px;">Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>CLS3950</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fused Silica CutterTubing cutter</td>
			<td style="width:155px;">alltech</td>
			<td>3194</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Multi-tube vortexers&#160;</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>444-7063</td>
			<td style="width:303px;">Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Lyophilizer 25EL Freezemobile</td>
			<td style="width:155px;">Virtis</td>
			<td>25EL</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>Clinical 50</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">LTQ Orbitrap Discovery</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved in-gel reductive &#946;-elimination for comprehensive o-linked and sulfo-glycomics by mass spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

Effet de Ethyl Acetate Traitement Avant In-gel réducteur β-élimination Un spectre de masse représentatif d&#39;échantillons de glycane O-liés perméthylés libérés par bovine mucine à l&#39;aide de gel de β-élimination réductrice est représenté sur la Figure 3. Le lavage à l&#39;EtOAc des morceaux de gel élimine efficacement SDS et polyacryliques contaminants qui interfèrent avec l&#39;analyse MS ultérieure 27. <p class="jove...

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Improved In-gel Reductive &amp;#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

Amélioration dans le gel sulfo-réductrices glycomique β-élimination complète pour O-liés et par spectrométrie de masse

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

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Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Recherche

Chimie

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry. This strategy is based on previous successful characterization of mercury-dicysteinyl complexes involving tripeptides by utilizing mass spectrometry among other techniques. Mercury(II) chloride and a dicysteinyl tetrapeptide were incubated in a degassed buffered medium at varying stoichiometric ratios. The complexes formed were subsequently analyzed on an electrospray mass spectrometer consisting of a hybrid linear ion- and orbi- trap mass analyzer. The electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) spectra were acquired in the positive mode and the observed peaks were then analyzed for distinct mercury isotopic distribution patterns and associated monoisotopic peak. This work demonstrates that an accurate stoichiometry of mercury and peptide in the complexes formed under specified electrospray ionization conditions can be determined by using high resolution ESI MS based on distinct mercury isotopic distribution patterns.

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

The characterization of complexes formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptides by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry is presented.

Une étude de la complexation du mercure (II) avec Dicysteinyl tétrapeptides par spectrométrie de masse électrospray

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Analyse de l’haleine en temps réel en utilisant l’ionisation secondaire SPECTROMETRIE couplée à la spectrométrie de masse haute résolution

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Synthèse et analyse de spectrométrie de masse des Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analyse des Architectures de protéine et Complexes protéine-Ligand par spectrométrie de masse structurelle intégrative

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Surveillance des médicaments haut débit et complet à l’aide de la spectrométrie de masse de l’électrophorèse capillaire-Injection Multisegment

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

Analyse des molécules complexes et de leurs réactions sur les surfaces au moyen de la desorption induite par les grappes/spectrométrie de masse d’ionisation

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

Approches de spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire pour la caractérisation de la protéine et du métabolite Corona acquis par les nanomatériaux

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

Marquage covalent avec diéthylpyrocarbonate pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des protéines par spectrométrie de masse

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Caractérisation des modifications de l’ARN dans des neurones uniques à l’aide de la spectrométrie de masse

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...