This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.

NOTA: Preocupações de segurança de laboratório Em consonância com as melhores práticas de laboratório padrão, observe o seguinte. Guarde todos os solventes orgânicos em locais apropriados. Mantenha todos os materiais de resíduos em contentores de resíduos químicos com uma rotulagem clara de composições químicas. Como vários reagentes utilizados nestes protocolos são potenciais agentes cancerígenos ou gerar gases combustíveis voláteis, lidar com todos os reagentes em um exaustor com ventilação. Use equipamento de proteção individual, como luvas, jaleco e proteção para os olhos quando se trabalha com solventes orgânicos. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig1highres.jpg" width="450px" /> Figura 1. Processo para O-glycomics em gel. (A) As proteínas de interesse são resolvidos por SDS-PAGE, detectada por procedimentos de coloração apropriados (Coomassie ou prata), e excisadas. Pedaços de gel são excisadas fatiasem pequenos cubos, descorados, e lavou-se com acetato de etilo, para reduzir os contaminantes que interferem com a subsequente análise por MS. Uma porção da porção de gel pode ser reservada para em gel de digestão tríptica e subsequente caracterização proteómica por LC-MS / MS. (B) glicanos ligados a O são libertados a partir de glicoproteínas resolvidos por eliminação redutiva β-em-gel. Passos essenciais incluem dessalinização e remoção de borato de azeótropo com metanol. (C) glicanos libertados pela eliminação redutiva β-O-ligada são permetilado e posteriormente repartiu-se em fases aquosa e orgânica. Sulfoglycans são quantitativamente recuperado na fase superior (aquosa) enquanto partição glicanos neutros e sialilados no (DCM) camada inferior. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" width="700px" /> Figura 2. Detalhe fluxograma para glycomics em-gel. Cada experimenTal passo mostrado na Figura 1 é ilustrado individualmente. (A) descoloração gel e extração AcOEt, (B) dirigir redutora β-eliminação em gel para liberação glycan O-ligados, e (C) permetilação e fase de partição. <a href="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.</a> 1. Gel excisão e remoção de contaminantes Gel derivadas <ol><li> Antes de iniciar o procedimento, preparar produtos químicos e reagentes listados na Lista de Materiais. </li><li> Resolver proteína em gel de SDS-PAGE utilizando sistemas de tampão de Tris-Glicina padrão. Stain proteínas com ou Coomassie Brilliant Blue ou prata Stain resolvido. Em geral, a recuperação de glicanos ligados em O a partir de géis corados com prata é aproximadamente 80-90% da recuperação conseguida a partir de géis corados com Coomassie. </li><li> Após a electroforese, colocar o gel sobre uma placa de vidro e t especial de consumoEle região de interesse utilizando um bisturi limpo ou lâmina de barbear. </li><li> Para aumentar o rendimento de O-glicanos, transferir a banda gel de interesse para outra placa de vidro e cortar o pedaço gel extirpado em aproximadamente dois milímetros cubos. Evitar fazer pedaços de gel menor do que 1 milímetro porque os cubos de recuperação de glicano é reduzida. Transferir os pequenos pedaços do gel para um tubo de vidro de tampa de rosca (13 x 100 mm) com um microspatula aço inoxidável. </li><li> Adicione 1 ml de 25 mM de bicarbonato de amônio (Ambic, NH 4 HCO 3) para o tubo de amostra, tampar o tubo de vidro com um parafuso de topo revestido de teflon, e misture delicadamente sacudindo o tubo antes de deixar repousar por 10 min. Não se empregar agitação vigorosa, a fim de evitar rasgar os pedaços de gel. </li><li> Remova cuidadosamente Ambic do tubo de vidro usando uma pipeta de vidro Pasteur ou pipeta equipado com uma ponta de plástico extra-longa. Evite esmagamento e transferindo os pequenos pedaços de gel durante a remoção da solução Ambic. </li><li> Adicionar 1 ml de acetonitrilo (ACN) para otubo de vidro, tampa, e misture delicadamente sacudindo tubo antes de deixar descansar por 10 min. Certifique-se de que as peças de gel são completamente coberto com solvente. Se necessário, empurre pedaços de gel fora da parede do tubo e em solvente com ponteira. </li><li> Pipeta off ACN do tubo de vidro e repita os passos 1,5-1,7 até que a cor azul brilhante é eliminado. Repetir um mínimo de cinco lavagens seqüenciais Ambic / ACN, se necessário. Para prata manchada géis, use um kit destain. Vá para a próxima etapa, quando a peça se transforma em gel enquanto uniformemente branca em ACN. </li><li> Pipetar qualquer líquido do tubo de vidro, recapitular o tubo, adicionar 1 ml de Ambic e deixe descansar por 5 min. </li><li> Remover Ambic e adicionar 2 ml de acetato de etilo (EtOAc) para o tubo de vidro. Recapitulando tubo com tampa forrada de Teflon e colocar a 4 ° C durante a noite com agitação ao longo de ponta a ponta ou, alternativamente, executar três lavagens de EtOAc à temperatura ambiente durante 30 min cada. Quanto maior for a lavagem de EtOAc, o mais eficiente a remoção de contaminantes. </li><li> RemoverEtOAc a última lavagem e executar três lavagens cada uma com 2 ml de H 2 O. A remoção completa de EtOAc irá assegurar uma reacção de eliminação redutiva β-robusta. </li><li> Pipetar fora H2O e desidratar o gel por lavagem uma vez com 1 mL de ACN. NOTA: Após a secagem, os géis são desidratados pronto para β-eliminação em gel. Pedaços de gel desidratados podem ser armazenados a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> Parar o processo de lavagem em qualquer passo e armazenar os pedaços de gel a 4 ° C durante a noite, independentemente de qual tampão ou solução é aplicada ao gel (Ambic, ACN, H 2 O). Reinicie a preparação da amostra a qualquer momento dentro dos próximos dois dias. </li><li> Usar uma porção dos pedaços de gel descorado e desidratados para identificação de proteínas por abordagens proteomic padrão. </li></ol> 2. Em gel de-O-glicano A libertação por redutiva β-Eliminação <ol><li> Prepara-se uma solução stock de 1 M de hidróxido de sódio (NaOH), utilizando NaOH a 50% ou NaOH sólido e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. <ol&gt; <li> Tirar 5,2 ml de NaOH a 50% (ou 4 g de NaOH sólido) e ajustar o volume para 100 ml para fazer uma solução M de NaOH. Dilui-se a solução stock de NaOH a 1 M NaOH a 100 mM, que podem ser armazenadas a 4 ° C, até 6 meses, sem perda de eficiência em reacções β-eliminação redutiva. </li></ol></li><li> Adicione 2 M de boro-hidreto de sódio (NaBH4) em NaOH 100 mM. Dissolve-se 38 mg de NaBH4 em 0,5 ml de NaOH 100 mM. Geralmente, usam 0,5-1,0 ml da solução de boro-hidreto para cada amostra. Variar o volume da solução de reacção sobre a quantidade de pedaços de gel seco preparado no passo 1. Esperar para utilizar 0,5 ml de solução de boro-hidreto por 1-2 pedaços excisados ​​do gel (passo 1.3). </li><li> Adicionar 500 mL de NaOH 100 mM para os pedaços de gel desidratados e deixar repousar durante 3-5 min em gelo, a fim de equilibrar o gel às condições básicas que melhoram a recuperação de glicano. </li><li> Adicionar 500 ul de 2 M NaBH4 em NaOH 100 mM, resultando em concentrações finais de 1 M NaBH <sub&gt; 4 em NaOH 100 mM. Misturar suavemente o tubo e incubar a 45 ° C durante 18 h. <ol><li> Durante a primeira hora de incubação, misturam suavemente o tubo a cada 15 min. Evitar agitação forte, uma vez que pode fragmentar os pedaços de gel. Realizar a reacção num incubador / forno bem equilibrada ou num bloco de aquecimento. Assegure-se que os pedaços de gel são cobertos com uma solução de reacção. </li></ol></li><li> Parar a reacção por remoção do tubo de amostra a partir da incubadora ou do bloco de aquecimento e colocando-a em gelo. NOTA: Depois de se deixar a reacção β-eliminação prosseguir durante 18 h, o processo de dessalinização deve ser realizada no mesmo dia. </li></ol> 3. Cromatografia em Dessalinização permutadora de catiões <ol><li> Enquanto se mantém o tubo de amostra em gelo para evitar a formação de calor excessivo, adiciona-se lentamente 10% de ácido acético (AcOH) gota a gota a neutralizar a base. Gentilmente vortex o tubo de amostra entre as adições de AcOH. Tenha o cuidado de adicionar ácido lentamente e gota a gota, como o additino de ácido irá produzir um &quot;vulcão&quot; das bolhas. Centrifuga-se o tubo para eliminar as bolhas e evitar transbordamento, se necessário. <ol><li> A fim de remover a grande quantidade de sódio na mistura de reacção, passar a mistura de reacção através de uma coluna de permuta catiónica pequena (ou resina Dowex AG-50W-X8, na forma H +). </li><li> Lava-se a resina de permuta catiónica com NaOH e 1 M de HCl 1 M, antes da utilização, a fim de remover os contaminantes que interferem com a análise por MS, mesmo se a resina é de grau analítico. </li><li> Soak a resina em NaOH 1 M e remover a solução por decantação. Adicionar água deionizada, remover a água, em seguida, adicione 1 M HCl. </li></ol></li><li> Repita essas etapas até que a solução acima da resina é incolor. Lava-se a resina limpas com água deionizada e armazenar em 5% de AcOH a 4 ° C. </li><li> Para fazer com que uma pequena coluna de vidro, zero e quebrar a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro usando um cortador de cerâmica, de modo que a inclinação da ponta da pipeta é cerca de 1 cm de comprimento. Provocar uma separação de um tampão de lã de vidro e empurrar no sentido da ponta formando um suporte para o leito de resina. Fixe a coluna pipeta com uma pinça ou prendedor de roupa e coloque sobre um tubo de ensaio de vidro. </li><li> Lava-se a pipeta de vazio com 1 ml de metanol (MeOH) e 3 ml de 5% de AcOH. Redemoinho H + Dowex ou pasta de resina de permuta catiónica AG50 armazenado em 5% de AcOH e transferir suficiente da lama para produzir um volume de leito de 1 ml na coluna pipeta de Pasteur. </li><li> Lavar a coluna com cinco volumes de 5% de AcOH. Verifique fluir através do aparecimento de partículas de resina e não use a coluna de resina se for detectado. </li><li> Coloque coluna sobre um novo tubo de tampa de rosca de vidro (16 x 125 mm) e amostra de carga. Recolhe-se o fluxo através de glicanos e eluir com, pelo menos, 3 volumes de 5% de AcOH no mesmo tubo. </li><li> Cobrir o tubo com Parafilm e fazer pequenos furos com uma agulha. Colocar o tubo de amostra a -80 ° C ou em gelo seco. Uma vez congelado, secar a amostra por liofilização. Armazenar o material seco a -20 °C até à sua utilização. </li></ol> 4. Remoção Borato <ol><li> Prepare a 10% de AcOH em MeOH. Tomar 10 ml de ácido acético glacial e ajustar o volume a 100 ml com metanol. Guarde este reagente em um frasco de vidro com tampa forrada de Teflon para até 6 meses. </li><li> Adicionar 300 ul de AcOH a 10% em MeOH à, liofilizada tubo de amostra seca e vortex. Remover o borato de trimetilo resultante por evaporação sob uma corrente de N 2. NOTA: Mistura de sais borato com metanol sob condições ácidas produz borato de trimetilo, que é um composto volátil. </li><li> Seca-se sob fluxo de N2, a 37 ° C. Após a secagem, adiciona outra aliquota de AcOH em MeOH como se descreveu na etapa 4.2. Seca-se o líquido durante 5 min sob atmosfera de azoto (N 2) fluxo a 37 ° C. <ol><li> Repetir a ressuspensão e secagem, pelo menos, 3 vezes. Armazenar o material seco a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol></li></ol> 5. C18 Clean-up <ol><li> Equilibrar a coluna de cartucho C18(Tamanho 1 ml, 100 mg de resina), utilizando três volumes de ACN e cinco volumes de 5% AcOH. Acelerar a passagem das soluções equilibrantes através da aplicação de pressão positiva de ar suave. </li><li> Adicionar 500 ul de 5% de AcOH para o tubo de amostra dessalinizada e livre de borato dissolver e por vórtice. </li><li> Carga da amostra ressuspensa numa coluna C18, equilibrada e recolher o fluxo através de um tubo em vidro com tampa de rosca (13 x 100 mm). Eluir O-glicanos com 3 ml de 5% de AcOH para o mesmo tubo. </li><li> Parafilme o tubo, fazer pequenos buracos com uma agulha pequena ou use a tampa forrada de PTFE frouxamente fechada para cobrir o tubo, e congelar a amostra a -80 ° C ou em gelo seco. Remover o solvente por liofilização. Armazenar a amostra seca a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 6. Preparação Base para permetilação NOTA: A fim de alcançar permetilação robusto, preparar NaOH pasta fresca. Toda a vidraria utilizado para reacções de permetilação deve ser extensivamente limpo. <ol><li> Para preparar o reagente de base para permetilação, adicionar 400 ul de NaOH a 50% para um tubo de tampa de rosca de vidro limpas (13 x 100 mm). Adicionar 800 mL de MeOH anidro e vortex. </li><li> Adicionar 4 ml de dimetil sulfóxido anidro (DMSO) e vortex para gerar um precipitado branco. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 1 min para sedimentar o precipitado. Pipeta off sobrenadante e descartar. Adicionar um adicional de 4 mL de DMSO anidro para o sedimento. Vortex. </li><li> Repita o passo 6.2 e 6.3, no mínimo, mais três vezes, ou até que forme um precipitado branco. </li><li> Dissolva a base peletizada em 3 ml de DMSO anidro e misture delicadamente por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur limpa. </li><li> Utilize a base imediatamente para a reacção seguinte como a permetilação não pode ser armazenado. </li></ol> 7. permetilação de glicanos libertados <ol><li> Adicionar 200 ul de DMSO anidro para a amostra C18-purificado e vortex ou sonicado para ressuspender. </li><li> Adicionar 300 ul da resusppasta base de ended para a amostra e imediatamente adicionar 100 ml de iodometano (MEI). Selar tubo com tampa forrada de Teflon e vigorosamente para misturar 5 min por vórtice. </li><li> Para parar a reacção permetilação, adicionar 2 ml de 5% de AcOH em gelo e vortex. Pipeta solução cima e para baixo cinco vezes para reduzir o volume restante de MeI por evaporação. NOTA: O AcOH neutraliza a solução de MeI e remoção aumenta a eficiência da extracção de glicanos sulfatados para a fase aquosa durante a-partição de fase. </li><li> Adicionar 2 ml de diclorometano (DCM) e vortex. Centrifugar a 600 xg durante 1 min à temperatura ambiente para separar as fases aquosa e orgânica. </li><li> Transferir a camada superior (fase aquosa que contém a maioria dos glicanos sulfatados permetilado) para um novo tubo de vidro (13 x 100 mm). </li><li> Adicionar 2 ml de H 2 O para a fase orgânica e vortex. Centrifugar a 600 xg durante 1 min para separar as fases aquosa e orgânica e combinar esta segunda fase aquosa com o abetofase aquosa st (passo 7.5). </li><li> Repetir o passo 7.6 e 7.5 mais três vezes, mas não há necessidade de guardar as fases aquosas resultantes das partições subsequentes. </li><li> Retirar a camada final de topo (fase aquosa), tanto quanto possível a partir da camada inferior (fase orgânica) e transferir a camada inferior (fase orgânica) para um tubo de vidro de novo separada usando uma pipeta de Pasteur limpa. </li><li> Seca-se a fase orgânica sob fluxo de N2 a 42 ° C. </li><li> Cobrir o tubo com parafilme e armazenar a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 8. C18 Clean-up de permetilado Sulfatado O-glicanos da fase aquosa <ol><li> Equilibrar a coluna de cartucho C18 com três volumes de ACN e cinco volumes de 5% de AcOH. </li><li> Carregar as fases aquosas recolhidas e combinadas a partir dos passos 7.5 e 7.6 na coluna. </li><li> Lava-se a coluna com 10 ml de H 2 O para dessalinização. </li><li> Eluir a permetilado sulfatado O-glicanos para um novo tubo de vidro com 2 mlde 50% de ACN. Use uma eluição adicional com 85% de ACN para melhorar a recuperação de permetilado sulfatados O-glicanos em oligossacarídeos maiores. </li><li> Eluatos secos sob corrente de azoto a 42 ° C. </li><li> Armazenar o material seco a -20 ° C até 6 meses antes da análise por MS. </li></ol> 9. Espectrometria de Massa de permetilado O-glicanos <ol><li> Analise permetilado O-glicanos por infusão directa para um espectrómetro de massa adequado usando uma fonte de nanoelectrospray a um caudal de 0,40-0,60 seringa ul / min a 210 ° C de temperatura de capilar. Para fragmentação por CID em MS / MS e MS n de um instrumento ion trap, aplicar 30-40% da energia de colisão. </li><li> Para o modo de ião negativo, reconstituir permetilado sulfatado O-glicanos em 50 mL de metanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM de acetato de amónio aquoso (16: 3: 3: 2 em volume). Para o modo de ião positivo, reconstituir permetilado neutros / O-glicanos sialilados em 50 ul de 1 mM de sódio hidrohidróxido O em metanol / água (1: 1). </li><li> Use o mapeamento de íons (TIM) e varredura de perda neutra (varredura NL) funcionalidade do pacote de software Xcalibur versão 2.0 para análise MSN para caracterizar estruturas O-glicano individuais 13,19. </li></ol>

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J. 5 (4), 397-409 (1988).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Lapadula, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+3.+OSCAR:+an+algorithm+for+assigning+oligosaccharide+topology+from+MSn+data.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).</li><li>Ashline, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+structural+isomers+analyzed+by+sequential+mass+spectrometry.">Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).</li><li>Thomsson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+mucin+MG1+(MUC5B)+carries+a+repertoire+of+unique+oligosaccharides+that+is+large+and+diverse.">The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse.</a> Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).</li><li>Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+techniques+and+strategic+workflow+for+sulfoglycomics+based+on+mass+spectrometry+mapping+and+sequencing+of+permethylated+sulfated+glycans.">Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans.</a> Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+mass+spectrometry-based+sulfoglycomic+mapping+for+identification+of+terminal+sulfated+lacdiNAc+glycotope.">Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope.</a> Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).</li><li>Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+&#946;-elimination+and+aqueous-organic+partition+for+improved+O-+and+sulfoglycomics.">In-gel &#946;-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

Combining in-gel reductive &#946;-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t...

A glicosilação é uma modificação essencial de proteínas pós-tradução, contribuindo para a fisiologia do organismo, a patologia do tecido, e reconhecimento celular 1-3. Apesar dos grandes avanços na glycoscience analítica, caracterizando a diversidade completa de glicanos em uma proteína específica continua a ser uma tarefa extremamente desafiadora, especialmente em proteínas isoladas de fontes biológicas primárias. No entanto, o microheterogeneidade de glicanos glicoproteína freqüentemente afeta as interações funcionais com outras proteínas. Portanto, a caracterização da diversidade de glicano é essencial para compreender o significado fisiológico de 4,5 glicosilação celular e tecidual. A fim de compreender a contribuição de glicoproteína de glicosilação para a fisiologia e patofisiologia tecido, robusto, sensível e técnicas analíticas glycomic abrangentes tornaram-se cada vez mais importante. Na análise proteômica, identificações de proteína são geralmente alcançado por LC-MS/ MS de péptidos trípticos 6. Digestão de proteínas pode ser realizada utilizando uma proteína ou proteínas purificadas resolvidas por SDS-PAGE após digestão em gel com proteases tais como tripsina 7-9. Pré-enriquecimento da mistura de proteína por SDS-PAGE aumenta a profundidade e precisão de identificação de proteínas. O desenvolvimento de estratégias análogas para análise glycomic de glicoproteína glicosilação se encontra na vanguarda da glycoscience. As duas principais classes de glicanos estão ligados a espinha dorsal de proteínas, quer através de ligação ou N-O-ligação. Glicanos ligados a N estão ligados a asparagina (Asn) resíduos encontrados como parte de um sequon definido como Asn-X-Ser / Thr / Cys (X é qualquer aminoácido excepto prolina), e pode ser libertado por digestão enzimática com N pï¿½tido -glycanase (PNGaseF ou A), quer em solução, em gel, ou sobre-blot 10-12. Glicanos ligados a O estão ligados principalmente a serina (Ser) ou treonina (Thr) resíduos. No entanto, apenas uma enzima foi idenficada que é capaz de libertar os glicanos ligados em O de glicoproteína e tem uma especificidade de glicano extremamente limitada, libertando apenas os glicanos ligados em O mais simples. Estratégias de liberação química continuam sendo o método de escolha para a liberação completa de glicanos ligados em O de glicoproteínas. Β-eliminação redutiva ou não-redutora, ou hidrazinólise são técnicas de liberação química bem caracterizados e são atualmente as abordagens mais comumente usadas para a liberação glicanos ligados em O de glicoproteínas 13,14. Embora β-eliminação redutiva foi usado para libertar os glicanos ligados em O a partir de glicoproteínas separadas por SDS-PAGE, as abordagens anteriores necessária separação por HPLC para análise subsequente 15-17. Análise multidimensional MS (MS n) fornece atualmente a mais rica fonte de dados estruturais para a caracterização de glicanos libertados de glicoproteínas isoladas nos valores esperados da maioria das fontes biológicas. A profundidade da EMcaracterização estrutural baseado é muito facilitada por permethylating os glicanos divulgados antes da sua análise. Permetilação aumenta ionização e tende a igualar as respostas sinal molares através de uma ampla gama de estruturas de glicano 18,19. Além disso, permetilação inequivocamente Tag metades monossacarídeos terminais e substituídos com massas distintas, aumentando assim elucidação estrutural 20-23. Por exemplo, glicanos ácidas são geralmente difíceis de detectar, como espécies não permetilado por MS. Embora glicanos ácidas pode ser detectado no modo de iões negativos por MS, é impossível detectar ambos os glicanos ácidas e neutras no mesmo modo de ião. Uma grande vantagem do permetilação glicano é que todos os grupos hidroxilo livres (OH) em substituintes de monossacárido de um glicano vai ser tapado com um grupo metilo (OCH3 ou OMe), assim taxas de sialilados de glicano são neutralizados, tornando-os como detectável como permetilado neutro (ásialo) glicanos. No entanto, os hidroxilos de metades de sulfato em sulfoglycans são resistentes a permetilação, resultando na retenção de carga aniónica, o qual suprime a ionização e diminui a sensibilidade. Esta supressão impede actualmente análise glycomic abrangente de glicoproteínas muito complexas tais como mucinas, que carregam uma alta abundância de glicanos sulfatados 24-26. As recentes notícias sobre purificação sulfatada glicanos usado cobrado, cromatografia de fase reversa para purificar e glicanos permetilado separados antes da análise MALDI. Este método baseia-se na separação completa de glicanos sulfatados e não sulfatados com diferentes fases móveis para a eluição, o que temos encontrado para ser menos rigorosas do particionamento fase orgânica. Portanto, as novas técnicas adequadas para a detecção e enriquecimento de sulfoglycans são apresentados aqui. Estas técnicas permitem a recuperação quantitativa de glicanos sulfatados na fase aquosa de água seguinte: DCM (diclorometano)de extracção, que é realizado rotineiramente no final de reacções de glicano 27 permetilação. É importante ressaltar que esta separação robusto de sulfoglycans permetilado partir de uma mistura de glicanos não-sulfatados permetilado enriquece concomitantemente para espécies carregadas ao mesmo tempo, simplificando MS dois padrões de fragmentação. Também é apresentado um protocolo global para melhorar a análise de glicanos ligados-O em-gel. O protocolo melhorado aumenta a recuperação de glicano, aumenta a informação estrutural obtida através de análise de MS n glicanos permetilado, e melhora a sensibilidade das análises sulfoglycomic aplicadas às glicoproteínas essenciais isolados a partir de fontes biológicas. Este protocolo destina-se a análise de glicano ligado em O de extractos de glicoproteínas integrais ou de uma glicoproteína específica de interesse resolvidas por SDS-PAGE e é composto por três procedimentos experimentais; A) gel de limpeza, B) redutora β-eliminação em gel, e C) permethy glycanlação. O objectivo é a obtenção de dados glycomic ligados a O abrangentes para glicoproteínas colhidas a partir de fontes primárias de interesse biológico (Figura 1). As glicoproteínas separadas por SDS-PAGE são visualizadas por coloração e as bandas de interesse são excisadas e a banda de gel resultante é cortado em pequenos pedaços. Os pedaços de gel são descorado e sujeito a lavagens de acetato de etilo para remover contaminantes de gel (Figura 2A). Libertação de glicano é conseguida por eliminação redutiva β-em-gel (Figura 2B) e os glicanos libertados são permetilado. Aquoso-orgânico de extracção seguinte permetilação quantitativamente particiona os aniónicos sulfatados glicanos longe de glicanos neutros não-sulfatados (Figura 2C). Em gel de redutiva-β-eliminação acoplado a extracção aquosa-orgânica permite a caracterização e de glicanos ligados em O sulfoglycans libertados a partir de pequenas quantidades de glicoproteína separadas por SDS-PAGE. A visão estratégica é summarized na Figura 1 e os detalhes estão apresentados na Figura 2. Além disso, uma porção dos pedaços de gel descorado e lavados pode ser utilizada para identificação da proteína por técnicas de proteómica LC-MS / MS padrão.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:303px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:231px;">Water, deionized water</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Acetic acid, Glacial</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td style="width:303px;">Certified ACS&#8805;99.7 w/w %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td style="width:303px;">BioUltra, &#8805;99.5% (T), Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34998-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV Plus, for HPLC, &#8805;99.9%, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>34972-1L-R</td>
			<td style="width:303px;">LC-MS CHROMASOLV, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>213462-25G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99%, Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Iodomethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99.5%,&#160; Step 6.&#160; Store at 4 &#176;C until use.&#160; Sit at room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Sodium hydroxide solution, 50% w/w</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>SS254-1</td>
			<td style="width:303px;">Certified, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dimethyl sulfoxide, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>276855-1L</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, &#8805;99.9%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>322415-100ML</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, 99.8%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34856-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOL&#174;, for HPLC, &#8805;99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:231px;">Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200&#160;mesh</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>217506-500G</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">AG 50W-X8 Resin&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>142-1441</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:231px;">BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase</td>
			<td style="width:155px;">JT Baker</td>
			<td>JT-7020-01</td>
			<td style="width:303px;">Step 5 and 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bio-Safe Coomassie Stain&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>161-0786</td>
			<td style="width:303px;">G-250, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Silver Stain Kit for Mass Spectrometry</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>24600</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-16</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-15</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81265</td>
			<td style="width:303px;">volume 500&#160;&#956;L, needle size 22 ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81165</td>
			<td style="width:303px;">volume 250&#160;&#956;L, needle size 22 ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81065</td>
			<td style="width:303px;">volume 100&#160;&#956;L, needle size 22s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80965</td>
			<td style="width:303px;">volume 50&#160;&#956;L, needle size 22s ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton Calibrated Syringes</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80300</td>
			<td style="width:303px;">volume 10&#160;&#956;L, needle size 26s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Petri Dish Glass 100mm x 15mm</td>
			<td style="width:155px;">GSC INTERNATIONAL INC</td>
			<td>1500-4</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bard-Parker Surgical Blades</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>371310</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Reacti-Therm Heating/Stirring Module</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>18870</td>
			<td style="width:303px;">Step 1, 4 and 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Heating Blocks</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>125D</td>
			<td style="width:303px;">Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>CLS3950</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fused Silica CutterTubing cutter</td>
			<td style="width:155px;">alltech</td>
			<td>3194</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Multi-tube vortexers&#160;</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>444-7063</td>
			<td style="width:303px;">Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Lyophilizer 25EL Freezemobile</td>
			<td style="width:155px;">Virtis</td>
			<td>25EL</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>Clinical 50</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">LTQ Orbitrap Discovery</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved in-gel reductive &#946;-elimination for comprehensive o-linked and sulfo-glycomics by mass spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

Efeito de acetato de etilo Tratamento Antes de Na-gel redutiva β-Eliminação Um espectro de massa representativo do permetilado amostras de glicano ligadas em O libertados de bovino usando mucina redutiva β-eliminação no-gel é mostrado na Figura 3. A lavagem de EtOAc dos pedaços de gel de SDS e remove eficazmente poliacrílicos contaminantes que interferem com a subsequente análise por MS 27. <p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

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Improved In-gel Reductive &amp;#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

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Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

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