Les auteurs tiennent à remercier le Programme Initiative interdisciplinaire de l&#39;innovation, de l&#39;Université de l&#39;Illinois, 12035 accorder. SK a été financé à UIUC de la National Science Foundation (NSF) de Grant 0965918 IGERT: Former la prochaine génération de chercheurs en mécanique moléculaire et cellulaire et Bionanotechnology.

La fabrication et la fonctionnalisation des gels d&#39;AP de raideurs des microsphères fluorescentes incorporées à proximité de la surface de culture cellulaire ou moins. 1. fonctionnalisation des Top couvercle en verre glissades <ol><li> Nettoyer les lamelles de verre (# 1.0, 12 mm diam.) Avec de l&#39;eau et du savon, puis par de l&#39;éthanol pour enlever la poussière étrangère. </li><li> Lieu couvercle de verre glisse sur une surface râpée (c.-à-support d&#39;embout de pipette) de telle sorte qu&#39;ils ne se touchent pas pour faciliter l&#39;interaction avec les lamelles. </li><li> Enduire la surface de la couverture glisse avec Poly-D-Lysine (0,1 mg / ml) pendant 1 h (figure 1A). </li><li> Pendant ce temps, effectuer une dilution de 1: 10 000 de la solution de colloïde de 0,1 um de diamètre, les microsphères fluorescentes rouges avec désionisée (DI) de l&#39;eau pour obtenir une densité de particule d&#39;environ 1 pm 20 microsphères par deux sur la surface du gel. Voir la Figure 2 pour les résultats de différentes dilutions. Cette dilution peut être modifié pour répondre aux besoins des expériences spécifiques. </li><li> Placer la solution diluée dans un bain d&#39;eau à ultrasons pendant 30 min. </li><li> Après 1 heure, utiliser des pinces pour soulever soigneusement chaque lamelle et sécher à l&#39;air. Remettre les lamelles sèches à la surface râpé. </li><li> Retirer la solution colloïdale diluée du bain ultrasonique et pipette 150 ul sur chaque lamelle. Laisser reposer 10 min (figure 1B). </li><li> Utilisez des pinces pour soulever soigneusement chaque lamelle et sécher à l&#39;air. Retour la couverture sèche glisse à la surface râpé et magasin dans le noir jusqu&#39;au moment de servir. </li></ol> 2 Préparation PA gel directement sur le verre des boîtes de Pétri de fond <ol><li> Plaque de cuisson Préchauffer le four à 100 ° C. </li><li> Disposez le nombre désiré de fond de verre des boîtes de Pétri (35 mm plat 14 mm micro-bien, # 1.0) sur une surface plane dans une hotte chimique. </li><li> Couvrir la partie en verre de chaque boîte de Pétri micro-bien avec 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane (3 APTES) pendant 7 min pour l&#39;activation chimique. Prenez garde à éviter les entrées par inadvertance des 3-APTES à la surface de la matière plastique dans la boîte de Pétri pour éviter la dégradation du polystyrène. </li><li> Après 7 minutes, remplir la boîte de Pétri avec de l&#39;eau DI et disposer dans un contenant à déchets. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.4 3x pour chaque plat, puis secouez la boîte de Pétri pour éliminer l&#39;eau supplémentaire. Placez les boîtes de Pétri sur la plaque chauffante jusqu&#39;à ce que la partie en verre est sec. </li><li> Retirez les boîtes de Petri de la plaque chaude et revenir à une surface plane dans une hotte chimique. </li><li> Dans une hotte chimique, préparer une solution de glutaraldéhyde à 0,5% et couvrir la partie de verre de chaque boîte de Pétri avec la même solution pendant 30 min. Prendre des précautions pour éviter les entrées par inadvertance du glutaraldéhyde à la surface de la matière plastique dans la boîte de Petri pour éviter la dégradation de la matière plastique. </li><li> Après 30 minutes, remplir la boîte de Pétri avec de l&#39;eau déminéralisée et disposer dans un récipient des déchets de rincer et enlever le glutaraldehyde. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.4 3x pour chaque plat, puis secouez la boîte de Pétri pour éliminer l&#39;eau supplémentaire. Placez les boîtes de Pétri sur la plaque chauffante jusqu&#39;à ce que la partie en verre est sec. </li><li> Avant de mélanger les composants de la solution de gel PA, déplacer les lames de verre fonctionnalisées dans la hotte chimique de telle sorte qu&#39;ils sont facilement accessibles, ce qui permet la prise en sandwich rapide du gel avec le fond de verre des boîtes de Petri après mélange de la solution de gel. </li><li> Dans un tube à centrifuger de 15 ml, mélanger 40% de bisacrylamide, 2% d&#39;acrylamide et d&#39;acide acrylique, en succession immédiate dans les concentrations indiquées dans le tableau 1 (adaptation de protocole publié 10) pour obtenir l&#39;élasticité souhaitée de la matrice. </li><li> Ajouter 100 mM de HEPES, 10% de persulfate d&#39;ammonium et le TEMED en quantités indiquées dans le tableau 1 correspondant à l&#39;élasticité de la matrice souhaitée pour compléter la solution de gel. </li><li> Immédiatement pipette 15 ul de la solution de gélatine sur le centre de la partie en verredes boîtes de Pétri. </li><li> Ramasser immédiatement un verre lamelle fonctionnalisé avec des pincettes. <ol><li> Retourner la lamelle couvre-objet en verre au-dessus de telle sorte que les billes fluorescentes sont sur la prise de contact latéral avec la solution de gel. </li><li> Disposer la lamelle doucement sur ​​le dessus du gel maintenant PA-liquide de telle sorte que le côté fonctionnalisé est en contact avec le gel (Figure 1C). Remarque: Pour de meilleurs résultats, une deuxième personne est recommandé pour le rôle de l&#39;ajout de la lamelle afin d&#39;éviter le risque de polymérisation partielle tandis que le pipetage liquide solution de gel PA sur plusieurs boîtes de Pétri. </li></ol></li><li> Retournez toutes les boîtes de Pétri sur pour aider à éviter les effets de la gravité sur les nanoparticules fluorescentes de polymérisation dans les niveaux inférieurs du gel PA. </li><li> Attendez au moins 35 minutes, ou jusqu&#39;à ce que la solution mère de gel PA a visiblement polymérisé dans son tube de centrifugeuse. </li><li> Retourner les boîtes de Pétri à l&#39;endroit et de les remplir avec du PBS pour aider à enlever la lamelle. </li><li> Faire soigneusement tout contact avec la partie en verre de la boîte de Pétri et le contour de la lamelle, en utilisant des pinces à gratter de la circonférence de la lamelle. Effectuer plusieurs cycles jusqu&#39;à ce que la lamelle est délogé. Retirer la lamelle et éliminer dans un récipient approprié des déchets piquants ou coupants. </li><li> Après avoir retiré toutes les lamelles, perles fluorescentes ont transféré au gel (figure 1D). Couvrir les gels PA complètement avec du PBS, placez le plat couvercle Petri sur chaque plat, et conserver à 4 ° C. </li></ol> 3. fonctionnalisation gel PA avec la fibronectine <ol><li> Préparer les solutions ci-après prémélangés, comme décrit dans un protocole établi 11: solution de trempage (137 mM NaCl, 5% (v / v) de glycerol) et le tampon 2x de conjugaison (0,2 M 2 (N-morpholino) de l&#39;acide éthanesulfonique (MES), 10 % (v / v) de glycerol, pH 4,5). </li><li> Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer tous PBS des plats à fond de verre contenant les gels PA. </li><li> Pipette solution de trempage sur chaque gel tel que le gel est complètement submergé. Incuber à température ambiante pendant au moins 1 heure. </li><li> Chaud 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide chlorhydrate (EDC) et du N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) à température ambiante. </li><li> Mélanger 10x solutions d&#39;EDC (150 mM, 19 mg / ml dans de l&#39;eau DI) et NHS (250 mM, 29 mg / ml dans de l&#39;eau DI). </li><li> Mélanger 1 partie 10x EDC, une partie 10x NHS, 3 pièces d&#39;eau DI, et 5 parties 2x tampon de conjugaison. </li><li> Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer la solution de trempage. Assurez-vous que tout le liquide est enlevé de la surface du gel. </li><li> Ajouter suffisamment de solution NHS / EDC pour couvrir la surface du gel et de remplir le puits de la boîte de Petri (150-250 pi) à fond de verre. Incuber à température ambiante pendant 30 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Fibronectine décongeler à température ambiante. Une fois décongelé, mélanger l&#39;eau déminéralisée stérile pour créer un / ml solution de fibronectine 50 pg. </li><li> Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer les solu NHS / EDCtion. Assurez-vous que tout le liquide est enlevé de la surface du gel. </li><li> Ajouter 150 ul de solution de fibronectine à chaque gel. Incuber à température ambiante pendant 35 min pour permettre la fixation de fibronectine. </li><li> Après 35 min, ajouter PBS dans chaque boîte de Pétri et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines. </li></ol> 4 Expérimentations la force de traction <ol><li> Médias chaud de la cellule, du PBS, et de la trypsine à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Rincer gels 5x avec du PBS stérile, aspirer le PBS entre les rinçages, et laissez le à couvert dans la hotte. </li><li> Ajouter 1 ml de trypsine par cm 2 à 25 cellules du flacon contenant. Après que les cellules sont soulevés de ballon, diluer la trypsine avec les médias de cellules et de compter les cellules. Sur la base de la surface de gel, de déterminer le nombre de cellules nécessaires pour gel pour une densité finale de l&#39;ensemencement des cellules de 3.000 cellules / cm 2. Diluer ou concentrer la suspension de telle sorte que 150 ul du mélange cellules-support contient ce nombre de cellules. Aliquotes de 150 pi de suspens cellulairesd&#39;ions sur chaque gel. </li><li> Placez les boîtes de Pétri contenant des cellules dans un incubateur pendant 30 min. Ensuite, retirer soigneusement les boîtes de Pétri et remplir le reste de la boîte de Pétri avec les médias (environ 2 ml) de telle sorte que la surface de la boîte est complètement submergé. </li><li> Placez les boîtes de Pétri dans l&#39;incubateur jusqu&#39;à ce que l&#39;acquisition de l&#39;image. </li><li> Préparez le système d&#39;acquisition microscope et données pour l&#39;imagerie: insérer l&#39;objectif à immersion 40x de l&#39;eau, insérer le contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) prisme, sélectionnez le mCherry ou filtre fluorescent équivalent, et tourner sur la chambre de l&#39;environnement. </li><li> Lorsqu&#39;il est préparé pour l&#39;imagerie, enlevez une boîte de Pétri de l&#39;incubateur et le placer délicatement sur la platine du microscope. Retirez le couvercle plat de Pétri pour l&#39;imagerie DIC. </li><li> Recherchez une seule cellule et capturer une image fixe unique de la cellule en DIC. </li><li> Sans bouger la platine du microscope, changer le mode d&#39;imagerie à fluorescence. Concentrez-vous sur les microsphères fluorescentes et record une image des microsphères. </li><li> Retirez délicatement les médias de la cellule à partir de la boîte de Pétri avec une pipette et ajouter 0,05% de trypsine-EDTA. </li><li> Image, les microsphères sous la cellule après avoir détaché les cellules. </li><li> Utilisation par images de particules (PIV) analyse ImageJ 12 pour calculer le champ de déplacement en raison des forces cellulaires. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

En utilisant cette technique, il est essentiel que la solution de talon est correctement dilué et les perles sont choisies en fonction du diamètre désiré, la rigidité du substrat PA de gel, et l&#39;échelle de la taille des phénomènes qui sont explorées dans l&#39;expérience souhaitée. Il faut être prudent lors de la dilution de la solution de billes avant fonctionnalisation top des lamelles de verre. L&#39;espacement entre les billes sur la surface du gel peut être modifiée en...

L&#39;interaction mécanique d&#39;une cellule vivante avec son environnement local a souvent été étudiée en utilisant des gels de l&#39;AP. Ces substrats reposent sur ​​un protocole simple et bien établi caractérisé par Wang et Dembo en 1997 1. L&#39;un des principaux avantages de ces substrats est que leur rigidité peut être ajustée en modifiant les concentrations des composants spécifiques de la solution de gel. Ceci fournit une plate-forme souhaitable d&#39;étudier l&#39;interaction des cellules avec des environnements de rigidités différentes. Lorsque gels PA sont recouvertes d&#39;matrice extracellulaire de protéines (ECM), les cellules adhèrent à eux, de génération de force. En raison de la force de la cellule, le gel se déforme comme un corps élastique. Cette déformation dépend de la grandeur de la force appliquée par les cellules et les propriétés élastiques du gel. Diverses études ont utilisé des gels PA pour enquêter sur les forces de traction cellulaires. Dans une variante de PA gel fabrication, microsphères fluorescentes (perles) sont intégrés tout au long de gel de quantifier les forces de traction cellulaire sur des gels de différentes rigidités 2. Lors de l&#39;application de la force de la cellule, les billes déplacent à partir de leur position initiale après une déformation de gel. Le champ de déformation est mesurée à partir des déplacements individuels de talons. Cette zone de déformation est utilisé par la théorie de l&#39;élasticité et les propriétés élastiques du gel de calculer les forces de traction. Ces mesures permettent de mieux comprendre la façon dont les cellules détectent et interagissent avec leur micro-environnement local 3 mécaniquement. Dans de nombreux protocoles gel de fabrication largement utilisées PA, les perles sont mélangées à travers le gel PA dans son état liquide, non polymérisé. Un gel PA entièrement polymérisé contient des billes fluorescentes dans tout son volume. Lorsque le calcul de forces de traction de la cellule, la plupart des perles près de la surface du gel (de l&#39;interface cellule-substrat) sont surveillés. Les déplacements de ces billes sont supposées se produire sur la surface de culture cellulaire pour la simplicité de la force CALCULn. La position réelle des perles au sein de la profondeur du gel n&#39;est pas respectée. Cependant, dans un milieu élastique (tel que le gel PA), un cordon plus proche d&#39;un point d&#39;application de la force se déplace plus d&#39;un bourrelet qui est plus éloignée de la pointe. Ainsi, le traitement du déplacement d&#39;un point (à l&#39;emplacement du bourrelet) distale par rapport à la surface que celle de la surface conduit à une sous-estimation des tractions cellulaires. Le degré d&#39;erreur dépend de la distance de la bille à partir de la surface. L&#39;erreur ne peut être estimée à l&#39;insu de l&#39;emplacement du cordon. Le besoin d&#39;une méthode simple pour limiter les perles très près de la surface de culture cellulaire a été traitée par plusieurs techniques. Un moyen consiste à augmenter la densité des billes de gel tout au long de telle sorte qu&#39;il y ait un nombre suffisant de billes dans le plan focal supérieur à mesurer le mouvement très près de la surface. Une autre technique consiste à construire une chambre d&#39;imagerie confocal pour l&#39;imagerie des cellules vivantes de telle sorte que la lumière provenant deseules les billes dans le plan focal le plus supérieur est recueilli 4. Une autre méthode consiste à superposer une couche extrêmement mince de gel PA contenant des billes sur le dessus d&#39;un gel déjà polymérisé sans billes 5. Un inconvénient de chacune de ces techniques est que l&#39;emplacement précis des billes dans le gel n&#39;est pas connue. Cela introduit une erreur dans le calcul du champ de déplacement des billes, et donc le calcul des forces de cellules. Une autre technique consiste à conjugaison de billes à la surface supérieure d&#39;un gel PA déjà polymérisé en utilisant sulfo-SANPAH 6. Cette technique assure les billes sont en effet uniquement sur la partie supérieure du gel PA, mais la mesure dans laquelle elles sont noyées dans l&#39;épaisseur du gel est inconnu. Cela pourrait créer une topographie locale pour les cellules, ce qui pourrait modifier le comportement de la cellule, comme un travail préalable a suggéré que les cellules peuvent sentir la force de quelques microns de distance 7. Récemment, une technique de structuration gels PA avec 1 um de diamètre fluorescent marqueurs fibronectine de points dans un tableau régularisée a été créé 8. Dans ce cas, la profondeur des marqueurs fluorescents est connu, et est pratiquement nul, car le motif de la fibronectine est indirectement imprimé sur la surface du gel. Cependant, cette méthode ne fournit pas un environnement continu sur lequel les cellules peuvent se fixer, comme la protéine d&#39;ECM est limitée à 1 um de diamètre des points. Une méthode pour intégrer pleinement les perles tracker dans des gels d&#39;AP et les confiner dans un endroit connu de très près de la surface n&#39;a pas encore été établie. Ici, on développe une technique pour contraindre sous-um de diamètre de billes fluorescentes um à un plan focal à proximité de la surface de culture cellulaire à l&#39;intérieur de gel PA. Un gel est habituellement durci par solution en sandwich de gel liquide non polymérisé entre deux plaques de verre. Une des plaques est fonctionnalisé de sorte que le gel adhère fortement à elle. L&#39;autre est non fonctionnalisé et est retiré après les cures de gel. Nous modifions ce verre amovible surface en le revêtant avec une couche de billes. Lors de la prise en sandwich entre le gel liquide fonctionnalisé et la surface de verre revêtue de talon, le transfert des billes de gel pendant qu&#39;il durcit. Cela limite la distance de l&#39;intégration des perles dans le gel à 1,6 um de la surface. Plats de Pétri à fond de verre sont utilisés en tant que la surface adhérente sur laquelle le gel est durci. Pour former une surface supérieure plate de gel au cours de la polymérisation, une lamelle circulaire de verre est utilisé pour prendre en sandwich le gel de la boîte de Pétri à fond de verre. Avant de gel fabrication, le couvercle en verre haut glissement est recouvert de poly-D-lysine (PDL), ce qui donne une charge de surface positive. Le PDL est soufflé avec de l&#39;air comprimé, et une solution de billes dans l&#39;eau est déposée sur les lamelles. Nous utilisons des microbilles fluorescentes carboxyles, qui portent une charge négative, et d&#39;interagir avec la surface chargée positivement créé par traitement avec PDL. Après soufflage de la solution de talon de la lamelle couvre-objet avec de l&#39;air comprimé, une seule couche deperles demeure électrostatique couplé à la lamelle sec. Le revêtement PDL n&#39;affecte pas l&#39;adhérence du verre à la surface du gel, comme les lames de verre sont en bon état et présente dans le gel PA intact. Les boîtes de Pétri à fond de verre sont faites adhérente par un traitement avec 97% de 3-aminopropyl-trimethoxysliane et 0,5% de glutaraldéhyde. Gels PA de rigidités souhaités sont créés en mélangeant des concentrations appropriées de bisacrylamide et d&#39;acrylamide par une procédure standard 9. Une goutte de la solution de gel est introduit à la pipette sur la boîte de Pétri à fond de verre. La lamelle couvre-objet en verre contenant les billes est utilisé pour prendre en sandwich le gel de la boîte de Pétri. Lorsque le gel est durci, le couvercle supérieur est enlevé, laissant glisser les perles noyées dans le gel à l&#39;intérieur de PA 1,6 um à partir de la surface.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">70% Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>111-30-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1M HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">2% Bisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fibronectin, Human, 1mg</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0700</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Acrylic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>147230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-14-1-N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glass cover slips, 12 mm diam.</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26023</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy

Gels PA ont longtemps été utilisés comme une plate-forme pour étudier les forces de traction cellulaire raison de la facilité de fabrication et la capacité d&#39;ajuster leurs propriétés élastiques. Lorsque le substrat est revêtu d&#39;une protéine de la matrice extracellulaire, les cellules adhèrent au gel et appliquent des forces, ce qui provoque le gel de se déformer. La déformation dépend de la traction de la cellule et les propriétés élastiques du gel. Si le champ de la surface de déformation est connu, la traction de la surface peut être calculée en utilisant la théorie de l&#39;élasticité. Gel de déformation est généralement mesurée par incorporation de perles de marqueur fluorescent uniformément dans le gel. Les sondes déplacent que le gel se déforme. Les sondes proches de la surface du gel sont suivies. Les déplacements signalés par ces sondes sont considérés comme des déplacements de surface. Leurs profondeurs de la surface sont ignorés. Cette hypothèse introduit une erreur dans l&#39;évaluation de la force de traction. Pour une mesure précise des forces de cellules, il est essentiel que l&#39;emplacement des billes, qui sera appelée. Nous avons développéune technique qui utilise la chimie simple de limiter les perles de marqueurs fluorescents, 0,1 et 1 pm de diamètre, dans des gels d&#39;AP, à l&#39;intérieur de 1,6 pm de la surface. On couche une lamelle couvre-objet avec du poly-D-lysine (PDL) et des billes fluorescentes. Solution de gel PA est alors pris en sandwich entre la lamelle et une surface adhérente. Les billes fluorescentes pour transférer la solution de gel au cours du durcissement. Après polymérisation, le gel contient des billes fluorescentes PA sur un plan proche de la surface du gel.

L&#39;imagerie confocale a été utilisé pour déterminer que les billes sont bien en dessous de la surface du gel et de quantifier leur localisation précise dans la profondeur de gel. Des billes fluorescentes de longueur d&#39;onde différente de celle à l&#39;intérieur du gel ont été autorisés à se déposer sur la surface, et la distance entre les nanoparticules fluorescentes incorporées et celles sur la surface a été calculée en utilisant un algorithme d&#39;identification du centre de gravité. L&#39;emp...

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A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Les techniques traditionnelles de fabrication de polyacrylamide (PA) des gels contenant des sondes fluorescentes consistent en sandwich un gel entre une surface adhérente et une lame de verre. Ici, nous montrons que le revêtement de cette lame avec la poly-D-lysine (PDL) et des sondes fluorescentes localise les sondes à l&#39;intérieur de 1,6 um à partir de la surface du gel.

Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K vues.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Les techniques traditionnelles de fabrication de polyacrylamide (PA) des gels contenant des sondes fluorescentes consistent en sandwich un gel entre une surface adhérente et une lame de verre. Ici, nous montrons que le revêtement de cette lame avec la poly-D-lysine (PDL) et des sondes fluorescentes localise les sondes à l'intérieur de 1,6 um à partir de la surface du gel. 

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Recherche

Bio-ingénierie

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescence-trempe d&#39;un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie optique

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Microscopie de traction intégrée à la microfluidique pour la migration collective chimiotaxique

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

Microscopie de force de traction pour étudier l’activation de lymphocyte de B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Application de la microscopie de force atomique pour détecter l’arthrose précoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...