Cette méthode permet de mesurer la distribution temporelle spatiale des forces appliquées par les cellules B à la synapse immunitaire et de les corréler avec le recrutement de protéines spécifiques. La microscopie de force de traction utilisant des gels de polyacrylamide est facile à implémenter. Ce protocole peut être utilisé pour configurer rapidement la mesure des capacités mécaniques de nombreuses cellules B.
Cette méthode est flexible et peut être adaptée pour grapher d’autres ligands comme les intégines ou pour étudier d’autres types de synapses immunitaires comme les cellules T ou la phagocytose frustrée. En raison des propriétés physiques et chimiques des gels requis par cette expérience, l’adaptation des méthodes classiques de microscopie de force de traction aux cellules B peut être délicate. Commencez par saliniser le support gel.
Activez le coverslip ou la boîte de Petri à fond de verre avec une lampe UV pendant deux minutes, puis salinisez-le avec 200 microlitres d’APTMS pendant cinq minutes. Ceci préparera le support pour la liaison covalente du gel. Lavez soigneusement le coverslip ou le plat de fond en verre avec de l’eau ultra pure et séchez-le à l’aide de l’aspiration sous vide.
Pour préparer les coverslips pour aplatir le gel, mettez-les dans un support de coverslip en céramique, mettez le support dans un petit bécher, et versez le reagent siliconizing au-dessus des coverslips en s’assurant de les couvrir complètement. Couvrir le bécher de papier d’aluminium et le laisser à température ambiante pendant trois minutes. Pendant ce temps, remplir un grand bécher d’eau ultra pure.
Après trois minutes d’incubation dans un reagent siliconizing, transférer le support de coverslip avec les coverslips au bécher avec de l’eau. Rincer soigneusement les coverslips à l’eau ultra pure. Séchez-les bien et placez-les sur des lingettes en papier.
Pour de meilleurs résultats, procédez immédiatement à la polymérisation du gel. Préparer un pré-mélange de gel Pascal de 500 selon les directives manuscrites, puis combiner 167 microlitres du pré-mélange avec 1,67 microlitres de perles. Vortex et sonicate le mélange dans un sonicator de bain pendant cinq minutes.
Protégez le mélange de la lumière avec du papier d’aluminium. Pour capitaliser la polymérisation, ajouter 1,67 microlitres de 10% de persulfate d’ammonium au mélange de gel, puis initier la polymérisation en ajoutant 0,2 microlitres de TEMED et en mélangeant le gel avec une pipette. Pour jeter le gel, pipette neuf microlitres de gel mélangent sur chaque coverslip salinisé ou plat de fond en verre.
Aplatissez immédiatement le gel avec le coverslip siliconisé, en appuyant dessus avec des forceps pour s’assurer que le gel se propage sur toute la zone du coverslip et qu’une partie de celui-ci s’écoule. Inversez le couvercle ou le plat de fond en verre dans une grande boîte de Pétri et appuyez-le sur le banc pour forcer les perles vers la surface du gel. Placez un tissu humidifié sur le plat pour créer une chambre humide.
Couvrez-le de papier d’aluminium et incubez-le pendant une heure. Après l’incubation, faciliter la libération de coverslip en ajoutant PBS à l’échantillon. Retirez soigneusement le coverslip à l’aide d’une aiguille, en inclinant légèrement le plat, mais en vous assurant que le gel est immergé dans le PBS.
L’agent siliconizing, l’acrylamide, l’acrylamide de base, et TEMED peuvent être toxiques par inhalation. Portez de l’équipement de protection individuelle standard et manipulez ces produits sous une hotte chimique. Aspirez le PBS des gels et ajoutez 150 microlitres de Sulfo-SANPAH à température ambiante.
Exposer le gel au traitement UV pendant deux minutes, puis laver le gel trois fois avec PBS. Répétez le traitement avec sulfo-SANPAH et les lavages PBS, puis ajouter 250 microlitres de lysozyme oeuf de poule ou HEL au gel et l’incuber toute la nuit dans une chambre d’humidité à quatre degrés Celsius recouvert de papier d’aluminium. Après l’incubation, retirer l’antigène HEL et laver le gel avec du PBS trois fois.
Enfin, couvrez le gel de 500 microlitres de médias de culture de cellules B et laissez-le à température ambiante. Utilisez un microscope confocal avec contrôle thermique et dioxyde de carbone pour l’imagerie. Aspirez les médias du gel, laissant environ 200 microlitres.
Placez le gel sur le microscope. Deux couches principales de perles apparaîtront sur le fond et le dessus du gel. Concentrez-vous sur le plan gel et de trouver un domaine même à l’image.
Choisissez soigneusement la zone d’imagerie et assurez-vous de rester au point. Une densité de perles appropriée et une surface même sont essentielles pour obtenir des mesures de force robustes et fiables. Ajouter 80 microlitres de lymphocytes B primaires de souris MD4 au gel, en évitant de toucher le gel pour maintenir la concentration.
Assurez-vous que l’accent est toujours correct et que les cellules peuvent être vus descendant dans la région. Lancez l’acquisition avant que les cellules n’atteignent le gel. Ouvrez le film comme une pile d’images dans ImageJ, puis exécutez le cropandsave.ijm macro.
Choisissez un répertoire de sortie et configurez les paramètres du canal d’attribut. Sélectionnez les régions d’intérêt avec l’outil rectangle et ajoutez-les à la liste roi à l’aide de la touche T. Une fois terminé, cliquez sur OK. Lorsque la macro propose un masque de la cellule, cliquez sur OK si elle est satisfaisante.
Si ce n’est pas satisfaisant, cliquez sur pas OK, puis sélectionnez manuellement une région fermée avec n’importe quel outil de sélection, puis cliquez sur continuer. Ouvrez MATLAB et courez tfmv1.m. Entrez les paramètres requis.
Plus précisément, vérifiez les propriétés de l’image, telles que la taille des pixels et l’intervalle de temps d’acquisition et les propriétés de gel telles que young modulus E et Poisson ratio. Une fois terminé, localisez les sorties du logiciel dans le même répertoire que le fichier d’origine. Les images correctes de perle ressemblent à une distribution uniforme et aléatoire des taches lumineuses semblables à un ciel étoilé.
Les données et l’analyse ne sont pas fiables lorsque le nombre de perles est trop faible ou que l’image est hors de discussion. Il est possible d’observer le mouvement des perles par œil à l’aide d’un cadre de référence qui a précédé le premier contact de la cellule avec le substrat. Des résultats approximatifs pourraient être obtenus à partir d’un seul suivi des particules.
L’analyse fournit une segmentation des perles dans l’image de référence comme un contrôle. À l’aide d’un logiciel, il est également possible d’obtenir le champ de déplacement et de stress, qui est le vecteur du stress local à chaque pixel et à chaque point de temps. Le produit scalaire des champs de déplacement et de force intégrés sur la zone de la cellule fournit le travail total exercé par la cellule sur le substrat.
Lorsque l’on compare deux conditions biologiques, une courbe moyenne ou une valeur moyenne au cours de la dernière période où l’énergie atteint un plateau peut être calculée. Lorsque l’information spatiale des forces est pertinente, il est également possible de comparer les points de temps unique de chaque condition. Un exemple de time-lapse d’extraction d’antigène de fluorescence est montré ici.
L’apparition progressive des signaux fluorescents à la synapse indique le détachement d’antigène du gel. Les données de fluorescence peuvent être utilisées pour construire une courbe d’extraction moyenne. L’étape la plus délicate du protocole est la polymérisation du gel sous le coverslip.
Cette étape doit être effectuée relativement rapidement et soigneusement en s’assurant que le gel est pressé uniformément sous le coverslip. À la suite de cette procédure, la protéine fluorescente exprimant les lymphocytes B peut être utilisée pour évaluer simultanément la localisation des structures intracellulaires et le modelage des forces. Cette technique peut être combinée avec des perturbations génétiques ou chimiques pour évaluer le rôle de protéines spécifiques sur la contractilité cellulaire et l’absorption des antigènes.
