Nous tenons à remercier le Dr Yang Xiaowen (service de clonage PROTEX) pour la préparation des constructions d&#39;expression utilisés pour ce travail et de l&#39;Université de Leicester Core Services biotechnologie. Ce travail a été soutenu par une bourse BBSRC, le Programme Wellcome Trust et subventions de chercheurs chevronnés WT085408 &amp; WT100237 et BBSRC accordent RM31G0224.

NOTE: Le protocole est adapté à toute échelle d&#39;expression, donc les volumes et les quantités de réactifs doivent être réduites proportionnellement. Un vecteur d&#39;expression de mammifère approprié doit être utilisé pour ce protocole. Ici, nous avons utilisé un vecteur modifié d&#39;expression pcDNA 3.1 qui permet facilement l&#39;inclusion ou l&#39;exclusion d&#39;un marqueur d&#39;affinité selon le choix des enzymes de restriction utilisées dans le clonage (Figure 1). Le protocole suivant décrit une transfection à grande échelle. 1. culture à grande échelle / transfection en bouteilles de 1 L à rouleaux Croître et maintenir les cellules en suspension adaptées HEK293F selon des protocoles standards. Typiquement, les cultures starter de 30 à 100 ml sont cultivés dans 250 ml de fioles coniques de culture cellulaire. <ol><li> des cellules de semences à 0,5 x 10 6 cellules / ml dans un volume final de 300 ml dans chaque flacon de 1 L rouleau. REMARQUE: Les flacons roulants accueillir un minimum de 150 ml pour un maximum de300 ml de culture en suspension. Pour les plus grands transfections échelle utiliser plusieurs bouteilles. </li><li> Incuber pendant 24 heures dans un agitateur incubateur orbital à 37 ° C, 120 rpm, et 5% de CO 2 jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent une densité de 1,0 x 10 6 cellules / ml (cellules devraient diviser environ toutes les 24 heures). </li><li> Introduire à la pipette un total de 300 pg d&#39;ADN stérilisée par filtration (voir méthode complémentaire) dans 30 ml de PBS et vortex vigoureusement pendant 3 sec. REMARQUE: Utilisez un total de 1 pg d&#39;ADN par million de cellules transfectées. Si deux ou plusieurs plasmides sont co-transfectés de réduire la quantité de chacune de sorte que le rapport de l&#39;ADN de cellules reste constant. </li><li> Ajouter 1,2 ml de 0,5 mg / ml, stérilisée par filtration PEI à la solution et vortex PBS / ADN vigoureusement pendant 3 sec. </li><li> Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Ajouter l&#39;ADN / PEI mélanger aux cellules - qui devrait être à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml (étape 1.3). </li><li> Après co-transfection, incuber les cellulesdans un incubateur à agitation pendant encore 48 heures à 37 ° C, 120 tours par minute, et 5% de CO 2. </li><li> Protéines intracellulaires de récolte par centrifugation des cellules à 3000 g pendant 5 min et stocker le culot à -80 ° C. REMARQUE: Vous pouvez également utiliser un standard (non-CO 2) en secouant incubateur, si l&#39;atmosphère au-dessus de la culture est remplacé par 5% de CO 2 et le couvercle de la bouteille est scellée. L&#39;ambiance devra être remplacé à chaque passage (normalement tous les 2 jours). </li></ol> 2.-protéine complexe purification de l&#39;extrait de cellules entières Ce protocole est optimisé pour la purification de complexes nucléaires utilisant des protéines de marquage Flag. <ol><li> Décongeler culot cellulaire dans ~ 40 ml de tampon de lyse pré-refroidi (100 mM d&#39;acétate de potassium, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glycerol, 0,3% de Triton X-100, les inhibiteurs de protéase) par litre de culture. </li><li> Re-suspendre le culot par aspiration et à plusieurs reprises (pour éviter la formation de mousse, ne pas vortex). </li&gt; <li> Bien remettre en suspension les cellules en utilisant un homogénéiseur en verre. Soniquer pendant 3 cycles (15 sec sur 15, s Arrêt). Centrifuger à 30 000 g pendant 25 min à 4 ° C et conserver le surnageant. </li><li> Equilibrer 1,25 ml d&#39;anticorps anti-flag emballé résine d&#39;agarose par litre de culture par lavage trois fois avec du tampon d&#39;équilibrage de la résine (100 mM d&#39;acétate de potassium, 50 mM Tris pH 7,5). </li><li> Incuber l&#39;ensemble de l&#39;extrait cellulaire de l&#39;étape 2.3 de la résine d&#39;affinité dans un ou plusieurs tubes de 50 ml à centrifuger et faire tourner doucement l&#39;échantillon pendant 30 à 120 min à 4 ° C. </li><li> Centrifugeuse à 3000 g pendant 1 min à 4 ° C, le surnageant défausse. </li><li> Laver la résine avec 45 ml de tampon de pré-réfrigérés 1 (100 mM d&#39;acétate de potassium, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glycerol, 0,3% de Triton X-100). Centrifuger à 3000 g pendant 1 min et éliminer le surnageant. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.7 en utilisant du tampon riche en sel (300 mM d&#39;acétate de potassium, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glycerol), suivie d&#39;un tampon pauvre en sel (50 mM d&#39;acétate de potassium, 50 mM de Tris pH 70,5, 5% de glycerol) et le tampon de clivage TEV (50 mM d&#39;acétate de potassium, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM de TCEP). REMARQUE: S&#39;assurer que chaque lavage est de courte durée est adéquat pour tout remettre en suspension la résine et plus. </li><li> Prélever un échantillon de 10 pi de résine et de diluer dans 1 volume de tampon 2x protéines de chargement pour l&#39;analyse (contrôle de protéines). Ne pas utiliser des agents réducteurs afin d&#39;éviter la libération de l&#39;anticorps de la résine. </li><li> Re-suspendre la résine dans 10.8 ml de tampon de pré-refroidie de clivage TEV et transférer dans un tube de centrifugation de 15 ml. </li><li> Ajouter ~ 40 mg de protéase TEV (en stock à 1 mg / ml) par litre de culture d&#39;origine et bien mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois. </li><li> Remplacer atmosphère tube avec 100% de N 2 gaz pour éviter l&#39;oxydation des protéines. </li><li> Tournez doucement O / N à 4 ° C. </li><li> Centrifuger à 3000 g pendant 10 min. Transférer le surnageant dans un filtre ultra centrifuge avec un poids moléculaire de coupure approprié et de se concentrerjusqu&#39;à 500 pi. </li><li> Prélever un échantillon de 10 pi de la protéine concentrée et diluée dans 1 volume de tampon de charge 2x protéine pour l&#39;analyse. (TEV éluat contrôle). </li><li> Prélever un échantillon de 10 pi de la résine et diluer dans 1 volume de tampon de charge 2x protéine pour l&#39;analyse. Ne pas utiliser des agents réducteurs afin d&#39;éviter la libération anticorps grandes quantités de la résine. (Post-TEV contrôle de résine). </li><li> Equilibrer la colonne de chromatographie d&#39;exclusion de taille avec du tampon de filtration sur gel (50 mM d&#39;acétate de potassium, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM de TCEP). </li><li> Filtrer la protéine à travers un filtre de 0,22 um </li><li> Chargez l&#39;échantillon dans la colonne et recueillir les fractions. </li><li> Échantillons exécuter des étapes 2.9, 2.15 et 2.16 et les fractions de filtration sur gel de l&#39;étape 2.19 sur une SDS-PAGE et de Coomassie pour analyse. NOTE: Il est recommandé d&#39;effectuer une SDS-PAGE d&#39;échantillons de mesures 2.9, 2.15 et 2.16 avant filtration sur gel pour confirmer l&#39;expression de la protéine cible.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli.">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li><li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells:+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology.">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+galenics+improve+in+vitro+gene+transfer+with+cationic+molecules+up+to+1000-fold.">Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold.</a> Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).</li><li>Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+(ethylenimine)+and+its+role+in+gene+delivery.">Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).</li><li>Beljelarskaya, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+systems+for+production+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).</li><li>Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+expression+of+foreign+genes+in+Pichia+pastoris.">Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris.</a> Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).</li><li>Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HDAC3+bound+to+co-repressor+and+inositol+tetraphosphate.">Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate.</a> Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).</li><li>Millard, C. J., Watson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+I+HDACs+Share+a+Common+Mechanism+of+Regulation+by+Inositol+Phosphates.">Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates.</a> Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).</li><li>Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+HEK293-EBNA1+Cells+in+Suspension+with+Linear+PEI+for+Production+of+Recombinant+Proteins.">Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins.</a> CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).</li><li>Baldi, L., Muller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Gene+Expression+in+Suspension+HEK&#8208;293+Cells:+Application+to+Large&#8208;Scale+Protein+Production.">Transient Gene Expression in Suspension HEK&#8208;293 Cells: Application to Large&#8208;Scale Protein Production.</a> Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Nous avons développé une méthode efficace simple et économique (coûte beaucoup moins cher que disponibles dans le commerce des réactifs de transfection lipophiles PEI) pour exprimer et purifier de grandes quantités de protéines recombinantes et complexes multi-unités à partir de cellules de mammifères. Transfection optimale et l&#39;efficacité de l&#39;expression peut être atteint si l&#39;ADN plasmidique très pur (260/280 entre 1,8 et 2,0) est utilisé en combinaison avec de la PEI, comme décrit dans la section de protocole. Les cellules doivent être cultivées dans des milieux sans sérum et sans antibiotique, par conséquent, une technique stérile est strictement nécessaire pour repiquage et la transfection de cellules afin d&#39;éviter les infections coûteuses et chronophages. La viabilité cellulaire doit être de 90% ou plus et les cultures ne doit pas être augmenté à des densités supérieures à 2,5 x 10 6 cellules / ml immédiatement avant une transfection, car cela permettra de réduire le rendement en protéines. Pour une transfection réussie, les cultures doivent contenir que des cellules individuelles ou de division. Grappes peuvent être brisés par la vigueurous vortex 20 à 30 secondes (Figure 5). Le rapport de chacun des plasmides utilisés dans la co-transfection peut être modifiée par l&#39;utilisateur en fonction de la stoechiométrie du complexe étant étudié. l&#39;efficacité de l&#39;expression peut être optimisé pour la protéine d&#39;intérêt, de sorte qu&#39;un temps d&#39;expression approprié peut être établi. La purification doit être effectué en gardant l&#39;échantillon de protéine froid à tout moment de réduire les risques de dégradation protéolytique indésirable. Le choix des mots-clés et des tampons de purification est indispensable, car ils peuvent interférer avec les éléments de structure ou des sites actifs de certaines protéines, ce qui entraîne souvent la solubilité et / ou la perte de l&#39;activité enzymatique réduite. Les petites transfections à grande échelle sont particulièrement utiles pour tester différentes constructions pour la purification de grands complexes de protéines. De nos jours, une grande variété d&#39;autres méthodes sont disponibles pour l&#39;expression de protéines eucaryotes recombinants (tableau 2). Par exemple, Baculovirus expression dans des cellules d&#39;insectes est largement utilisé en raison de sa haute efficacité de transduction et son manque de cytotoxicité par rapport à d&#39;autres espèces virales 6. Cependant, le procédé de fabrication du virus est fastidieux et son instabilité ne permet pas le virus d&#39;être stocké pendant de longues périodes. D&#39;un autre côté, les systèmes d&#39;expression de levure offrent la possibilité de cellules de très hautes densités de plus en plus dans des cultures de fermentation, ce qui entraîne des rendements élevés de protéines 7. Mais ils n&#39;ont pas encore la pleine variété de modifications post-traductionnelles requises pour les protéines eucaryotes à plier correctement et d&#39;interagir avec leurs partenaires protéiques. HDAC3, par exemple, est exprimé, mais ne se replie pas dans E. coli. Cependant, lorsqu&#39;il est exprimé dans les cellules 293F, nous avons été en mesure de purifier une enzyme active dans un complexe avec son co-répresseur (SMRT) et une molécule de l&#39;inositol tétraphosphate (IP4) 8, qui n&#39;est pas présente dans les cellules procaryotes. Cette méthode nous a également permis de purifier et de résoudre le cristal structure de HDAC1 interagir avec MTA1 dans le complexe de NuRD, qui est activé par de la même IP4 9. Idéalement, nous aimerions toujours pour exprimer des protéines eucaryotes dans leur environnement naturel, physiologique. Systèmes d&#39;expression mammifères employant HEK 293 cellules-EBNA1 dans des bioréacteurs 10-12 ont été décrites et obtenir des niveaux très élevés de protéines, mais elles peuvent être complexes à utiliser. Notre procédé est une alternative simple et accessible à l&#39;expression dans les systèmes de bactéries, levures et bioréacteurs. Procédé d&#39;expression est rapide et ne nécessite pas l&#39;utilisation d&#39;un matériel coûteux, surtout si la bouteille ou le flacon à rouleaux atmosphère est remplacé par 5% de CO 2 et les incubateurs serrant standard sont utilisés. Nous avons utilisé ces protocoles pour co-transfecter plusieurs plasmides et purifier des complexes avec jusqu&#39;à cinq protéines avec des rendements de&gt; 1 mg / L de culture. Fait intéressant, le système permet l&#39;identification des complexes stables bien élevés. Par exemple, expression du complexe binaire de HDAC1 et Sin3A a donné des rendements limités de protéines, encore plus de SDD3 abouti à 5 fois plus grandes quantités et guide donc le biologiste structurel dans le choix de constructions appropriées et des complexes stables pour la cristallisation.

Les progrès rapides de la biologie cellulaire et moléculaire et le besoin constant de médicaments améliorés en médecine a créé un besoin pour les biologistes structurels à regarder structures de protéines de plus en plus complexes. Ceux-ci peuvent souvent exiger notamment des modifications post-traductionnelles, chaperons moléculaires et des co-facteurs pour soutenir leur repliement complexe et l&#39;activité enzymatique. Alors que la grande majorité des structures présentes dans la Protein Data Bank ont ​​été obtenus en utilisant des systèmes d&#39;expression bactériens, les procaryotes sont incapables de réaliser un grand nombre de ces modifications et n&#39;ont pas beaucoup de co-facteurs essentiels eucaryotes. Cela peut être un problème pour l&#39;étude de grands complexes multi-sous-unités qui sont activés par de petites molécules de signalisation, ainsi que pour le nucléaire, la surface cellulaire et les protéines sécrétées qui nécessitent mécanismes de pliage élaborés. Un certain nombre de E. souches de E. coli ont été conçues pour surmonter certaines de ces limitations 1. Ces dernières années, cependant, l&#39;utilisation de msystèmes d&#39;expression ammalian n&#39;a cessé d&#39;augmenter, car ils produisent de manière fiable des protéines eucaryotes qui sont par ailleurs problématique pour exprimer dans d&#39;autres systèmes 2. Aujourd&#39;hui, il est possible d&#39;obtenir des lignées de cellules d&#39;expression de mammifère stables et transitoires par une variété de techniques qui vont de la transduction virale de la transfection médiée par des produits chimiques, de transfert de gène physiques telles que l&#39;électroporation et l&#39;injection directe 3. Bien que toutes ces méthodes ont leur propre ensemble d&#39;avantages et les inconvénients, seuls quelques-uns d&#39;entre eux sont adaptés pour des études structurales étant soit trop cher et / ou de temps. Nous décrivons ici une méthode très simple, rapide, peu coûteuse et très efficace pour l&#39;expression de complexes protéiques pour la biologie structurale dans les cellules de mammifères de suspension grandi. L&#39;approche utilise co-transfection transitoire d&#39;une ligne de rein embryonnaire humain (HEK) de la cellule (par exemple, les cellules HEK Freestyle 293F). Ces cellules ont été tirés de la CE HEK 293ligne ll, sont adaptés à croître dans des cultures en suspension, pour atteindre des densités élevées dans un milieu sans sérum (comme FreeStyle 293 Expression moyen). Les cellules sont ensuite transfectées de manière transitoire en utilisant une version de la polyéthylèneimine ramifiée (PEI), un polymère réactif peu coûteux qui a été rapporté pour fonctionner sur une large gamme de cellules mammaliennes 4 en formant des complexes de PEI / ADN qui pénètrent dans la cellule hôte par endocytose 5. Cette méthode est adaptée à la fois à petite échelle (30 ml) et à grande échelle (jusqu&#39;à 300 ml) expériences et peut produire des niveaux élevés de complexes protéiques purifiés. Il est particulièrement utile pour l&#39;étude de protéines qui nécessitent mécanismes complexes de pliage, des co-facteurs particuliers ou des modifications post-traductionnelles qui ne peuvent pas être effectuées par des bactéries, des levures et des cellules d&#39;insectes. Dans ce protocole, nous présentons l&#39;expression et la purification de l&#39;échafaudage central de trois protéines du complexe de répression de la transcription de Sin3A. Il s&#39;agit d&#39;histoneDéacétylase 1 (HDAC1), suppresseur de défectueux de Silence 3 (SDD3) et Switch-3 indépendante (Sin3A). Le complexe purifié est utilisé pour les essais de cristallisation à haut débit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle HEK 293F cells&#160;</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:315px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td style="width:119px;">12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td style="width:140px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Roller bottles with vented caps</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">01836-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Polyethylinamine, 25 kDa, branched</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">408727</td>
			<td style="width:292px;">Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mammalian expression vector</td>
			<td style="width:140px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Superdex&#160; 10/300 GL</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-5175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

Ici, nous montrons une 2 L (8 x 250 ml de cultures) la co-transfection transitoire et purification de la HDAC1, SDD3, Sin3A complexe ternaire. HDAC1 et SDD3 interagissent avec Sin3A à travers le domaine HDAC-interaction (HID) de Sin3A. A typiques rendements de purification jusqu&#39;à 1 mg de complexe par litre de culture. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: Représentation schématique du vecteur pcDNA 3.1 d&#39;expression modifié. Le plasmide a été digéré par EcoRV et EcoRI pour y inclure la balise d&#39;affinité et la zone de clivage TEV sur l&#39;extrémité amino-terminale de Sin3A. Pour cloner des versions non marquées de HDAC1 et SDD3, le vecteur a été digéré avec Kpnl et EcoRI. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2: SDS-PAGE montrant la première étape de la purification. L&#39;&quot;protéine liée&quot; voie montre le complexe lié à la résine d&#39;affinité. Suite à la digestion TEV, l&#39;étiquette présente sur Sin3A-HID est clivé et le complexe est élué de la résine, comme indiqué dans les deuxième et troisième voies de gel. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 Chromatogramme de purifié en utilisant une Chromatographie d&#39;exclusion de taille de la protéine du complexe. Notez que le complexe pur élue dans le volume vide, car il forme un dimère en solution. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4: SDS-PAGE montrant les fractions de filtration sur gel montre la figure 3. Figure 5 TRYPAN cellules HEK 293F colorées en bleu à 2.3x10 6 cellules / ml prêt à être transfectées. Cellules ne devraient être présents comme des cellules individuelles ou de division, alors que les grands groupes peuvent être brisés par vortex vigoureuse pendant environ 25 secondes. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Problème </td><td> Les causes possibles </td><td> Action </td></tr><tr><td rowspan="4"> Faible rendement en protéine. </td><td> Faible nombre de cellules transfectées. </td><td> Assurez-vous que la densité des cellules est d&#39;environ 1,0 x 10 6 avant d&#39;ajouter le mélange de réaction de transfection de la culture. </td></tr><tr><td> Les cellules peuvent avoir été repiquées trop de fois. </td><td> Utiliser des cellules de base fraîches après environ 90 passeâges. </td></tr><tr><td> L&#39;ADN peut être dégradé ou avoir une grande quantité d&#39;impuretés. </td><td> Assurez-vous que l&#39;ADN plasmidique utilisé a un rapport 260/280 entre 1,8 et 2,0. Exécution de l&#39;ADN sur un gel d&#39;agarose est recommandé d&#39;évaluer sa qualité. </td></tr><tr><td> Protéine (s) étant exprimées ne sont pas stable ou suffisamment soluble. </td><td> Testez différentes constructions à petite échelle avant de mettre à l&#39;échelle les transfections. Assurez-vous que les balises ne pas interférer avec la structure de la protéine (s) d&#39;intérêt. </td></tr><tr><td> Cellules regarder nuageux et avoir une couleur et / ou une odeur inhabituelle. </td><td> Les cellules sont infectées par des bactéries ou des levures. </td><td> Une bonne technique stérile doit être utilisé en tout temps. La fumigation des hottes à flux laminaire et de désinfection UV-la chambre de culture de cellules en cas d&#39;infection aide contenant le problème. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Les cellules ont une faible viabilité. </td><td> PH mal dans les médias. </td><td> Assurez-vous que les cultures sont cultivées à 5-8% de CO 2à tout moment. </td></tr><tr><td> Les cellules ont été cultivées jusqu&#39;à une densité de plus de 3.0x10 6 cellules / ml. </td><td> Les cellules ne doivent pas être cultivées jusqu&#39;à des densités au-dessus de 2,5 x 10 6 cellules / ml immédiatement avant une transfection et jamais au-dessus de 3,0 x 10 6 cellules / ml. </td></tr><tr><td rowspan="2"> La purification par affinité ne fonctionne pas </td><td> Protéine (s) n&#39;est pas exprimé. </td><td> Voir ci-dessus. </td></tr><tr><td> Conditions de purification peut être erroné. </td><td> Régler les conditions de tampon (par exemple, forte teneur en sel, faible teneur en sel, pH). </td></tr></tbody></table> Tableau 1 Dépannage. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Système </td><td> Avantages </td><td> Inconvénients </td></tr><tr><td> E. coli </td><td><ul><li> RapideSystème d&#39;expression </li><li> Des rendements élevés de protéines </li><li> Peu coûteux </li><li> Convient pour la production de protéines abordables marqués par des isotopes </li></ul></td><td><ul><li> Manque de chaperons importantes qui peut être nécessaire pour le repliement des protéines </li><li> Manque de nombreuses modifications post-traductionnelles </li><li> Peuvent manquer de co-facteurs qui sont importants pour la fonction des protéines et / ou d&#39;assemblage complexe. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul><li> Peut effectuer la majorité des modifications post-traductionnelles </li><li> Peu coûteux </li></ul></td><td><ul><li> Manque certaines modifications post-traductionnelles </li><li> Peuvent manquer de co-facteurs qui sont importants pour la fonction des protéines et / ou d&#39;assemblage complexe. </li></ul></td></tr><tr><td> Expression baculovirus dans des cellules d&#39;insecte </td><td><ul><li> Peut effectuer toutes les modifications post-traductionnelles &lt;/ Li&gt; <li> Baculovirus est moins cytotoxique que les autres souches virales </li></ul></td><td><ul><li> Préparation du virus de la transduction est temps </li><li> Le virus n&#39;est pas stable et ne peut pas être stocké pendant de longues périodes de temps </li><li> Les cellules d&#39;insecte peuvent manquer de co-facteurs qui sont importants pour la fonction de la protéine et / ou d&#39;un assemblage complexe. </li></ul></td></tr><tr><td> Bioréacteurs avec les mammifères </td><td><ul><li> Peut effectuer toutes les modifications post-traductionnelles </li><li> Peut fournir tous les co-facteurs nécessaires pour la fonction de la protéine et l&#39;assemblage complexe </li><li> Can cellules en culture à des densités très élevées </li><li> Peut exprimer toutes les protéines de mammifères qui nécessitent machines de pliage complexes </li><li> Des rendements très élevés de protéines </li></ul></td><td><ul><li> Nécessite un personnel spécialisé à utiliser le bioréacteur. </li><li> Équipement coûteux est nécessaire. </li><li> Optimisation de la condition d&#39;expressions peut prendre beaucoup de temps. </li></ul></td></tr><tr><td> Cellules en suspension des cellules HEK 293F </td><td><ul><li> Peut effectuer toutes les modifications post-traductionnelles </li><li> Peut fournir tous les co-facteurs nécessaires pour la fonction de la protéine et l&#39;assemblage complexe </li><li> Peut exprimer toutes les protéines de mammifères qui nécessitent des machines de pliage complexe </li><li> Protocole de transfection rapide et intuitive </li><li> Relativement peu coûteux par rapport aux bioréacteurs et / ou d&#39;autres réactifs de transfection disponibles dans le commerce. </li></ul></td><td><ul><li> Bien abordable, pas aussi pas cher que l&#39;expression chez les bactéries </li></ul></td></tr></tbody></table> Tableau 2: Avantages et inconvénients des principaux systèmes d&#39;expression.

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach at JoVE.com

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Expression de protéines recombinantes pour la Biologie Structurale HEK 293F cellules en suspension: une approche nouvelle et accessible

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

recombinant-protein-expression-for-structural-biology-hek-293f

Research

JoVE Journal

Biology

53.3K vues.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Vidéo: Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Un procédé de production de protéine recombinante mCD1d en cellules d&#39;insectes.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Recherche

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Stratégie de transfection optimisés pour l&#39;expression et l&#39;enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

La production efficace et purification de recombinant murin Kindlin-3 à partir de cellules d&#39;insectes pour les études biophysiques

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Une analyse comparative des recombinant expression des protéines dans différents bio-usines: bactéries, cellules d&#39;insectes et Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...