Wir möchten Dr. Xiaowen Yang (PROTEX Klonen Service) zur Herstellung der Expressionskonstrukte für diese Arbeit und der Universität von Leicester Kern Biotechnologie Services verwendet bedanken. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium unterstützt BBSRC, der Wellcome Trust und Senior Investigator Programme Zuschüsse WT085408 &amp; WT100237 und BBSRC gewähren RM31G0224.

HINWEIS: Das Protokoll ist geeignet für jede Skala des Ausdrucks, also Volumen und Mengen von Reagenzien werden proportional skaliert werden. Eine geeignete Säugetierexpressionsvektor muss für dieses Protokoll verwendet werden. Hier wurde eine modifizierte pcDNA 3.1 Expressionsvektor, der bequem ermöglicht den Einschluss oder Ausschluss von einer Affinitätsmarkierung in Abhängigkeit von der Wahl der Restriktionsenzyme in dem Klonierungsvektor (Abbildung 1). Das folgende Protokoll beschreibt eine große Skala Transfektion. 1. Large Scale Kultur / Transfektion in 1 L Rollerflaschen Entwickeln und zu pflegen HEK293F Suspension-adaptierten Zellen nach Standardprotokollen. Starterkulturen typischerweise zwischen 30 und 100 ml, werden in 250 ml konischen Zellkulturflaschen gezüchtet. <ol><li> Samenzellen bei 0,5 x 10 6 Zellen / ml in einem Endvolumen von 300 ml pro 1 Liter Rollflasche. HINWEIS: Roller-Flaschen aufnehmen mindestens 150 ml auf maximal300 ml Suspensionskultur. Für größere Transfektionen verwenden mehrere Flaschen. </li><li> Inkubation für 24 h in einem Schüttler-Inkubator bei 37 ° C, 120 rpm und 5% CO 2, bis die Zellen eine Dichte von 1,0 x 10 6 Zellen / ml erreicht (Zellen sollte etwa alle 24 h unterteilen). </li><li> Pipettieren insgesamt 300 ug sterilfiltriert DNA (siehe Zusatz Verfahren) in 30 ml PBS und kräftig vortexen für 3 Sekunden. HINWEIS: Verwenden Sie insgesamt 1 ug DNA pro Million transfizierten Zellen. Wenn zwei oder mehrere Plasmide sein cotransfiziert reduzieren die Menge von jedem, so daß das Verhältnis von DNA zu Zellen konstant bleibt. </li><li> 1,2 ml von 0,5 mg / ml filtersterilisiert PEI zum PBS / DNA-Lösung und kräftig vortexen für 3 Sekunden. </li><li> Inkubieren der Mischung bei RT für 20 min. </li><li> Wird die DNA / PEI mischen, um die Zellen - die zu einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml (Schritt 1.3) sein sollte. </li><li> Nach Co-Transfektion, Inkubation der Zellenin einem Orbitalschüttler Inkubator für weitere 48 h bei 37 ° C, 120 rpm und 5% CO 2. </li><li> Ernteintrazelluläre Proteine ​​durch Zentrifugieren Zellen bei 3000 × g für 5 min und speichert das Pellet bei -80 ° C. HINWEIS: Alternativ können Sie ein Standard-(Nicht-CO 2) Schüttelinkubator, wenn die Atmosphäre über der Kultur wird mit 5% CO 2 ersetzt, und die Flasche Deckel verschlossen. Die Atmosphäre muss bei jedem Durchgang (in der Regel alle 2 Tage) ersetzt werden. </li></ol> 2. Proteinkomplex Reinigung aus Gesamtzellextrakt Dieses Protokoll wird für die Reinigung der Kernkomplexe mit FLAG-markierten Proteinen optimiert. <ol><li> Abzutauen Zellpellet in ~ 40 ml vorgekühltes Lysepuffer (100 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% Glycerin, 0,3% Triton X-100, Protease-Inhibitoren) pro Liter Kultur. </li><li> Re-Aussetzung der Pellets durch Auf-und Abpipettieren mehrmals (Schaumbildung zu vermeiden, nicht Vortex). </li&gt; <li> Gründlich resuspendieren Zellen mit einem Glas-Homogenisator. Beschallen für 3 Zyklen (15 Sekunden ein, 15 Sekunden aus). Zentrifugieren bei 30000 × g für 25 min bei 4 ° C und der Überstand behalten. </li><li> Äquilibrieren 1,25 ml von Anti-Flag durch dreimaliges Waschen mit Harz Äquilibrierungspuffer (100 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5) gepackt Agarose-Harz pro Liter Kultur. </li><li> Inkubieren des gesamten Zellextrakts aus Schritt 2.3 mit dem Affinitätsharz in einem oder mehreren 50 ml-Zentrifugenröhrchen und sanft drehen die Probe für 30-120 min bei 4 ° C ist. </li><li> Zentrifuge bei 3000 × g für 1 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen. </li><li> Waschen des Harzes mit 45 ml vorgekühlten Puffer 1 (100 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% Glycerin, 0,3% Triton X-100). Zentrifuge bei 3000 g für 1 min und Überstand verwerfen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.7 mittels Hochsalzpuffer (300 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% Glycerin) mit Niedrigsalzpuffer (50 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7, gefolgt.5, 5% Glycerin) und TEV Spaltungspuffer (50 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP). HINWEIS: Stellen Sie sicher, jeder Wäsche ist kurz also ausreichen, um wieder vollständig zu suspendieren das Harz und nicht mehr. </li><li> Sammeln Sie 10 ul Probe von Harz und in 1 Volumen 2x Proteinladepuffer zur Analyse (gebundene Protein-Steuerung) zu verdünnen. Verwenden Sie keine Reduktionsmittel, um zu vermeiden Loslassen der Antikörper aus dem Harz. </li><li> Resuspendieren des Harzes in 8-10 ml vorgekühltes TEV-Spaltpuffer und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Hinzufügen ~ 40 ug TEV-Protease (ab Lager bei 1 mg / ml) pro Liter ursprüngliche Kultur und gut mischen durch Pipettieren von oben und unten mehrmals. </li><li> Rohr ersetzen Atmosphäre mit 100% N 2 Gas Protein Oxidation zu verhindern. </li><li> Sanft drehen O / N bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge bei 3.000 g für 10 min. Den Überstand in ein Ultrafilterzentrifuge mit einem geeigneten Molekulargewichts-Cutoff und konzentrierenauf 500 ul. </li><li> Sammeln einer Probe von 10 ul der konzentrierten Protein und in 1 Volumen 2x Proteinbeladungspuffer für die Analyse zu verdünnen. (TEV Eluat Kontrolle). </li><li> Sammle eine 10 ul Probe des Harzes und in 1 Volumen 2 × Proteinbeladungspuffer für die Analyse zu verdünnen. Verwenden Sie keine Reduktionsmittel, um zu vermeiden die Freigabe großer Mengen Antikörper aus dem Harz. (Post-TEV-Harz-Steuerung). </li><li> Äquilibrieren die Größenausschluss-Chromatographie-Säule mit Gelfiltrations-Puffer (50 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP). </li><li> Filtern des Proteins durch ein 0,22 um-Filter </li><li> Legen Sie die Probe in die Säule und sammelt die Fraktionen. </li><li> Führen Proben aus den Schritten 2.9, 2.15 und 2.16 und die Gelfiltration Fraktionen von Schritt 2.19 auf einem SDS-PAGE und Coomassie-Färbung für die Analyse. HINWEIS: Es wird empfohlen, eine SDS-PAGE der Proben von den Schritten 2.9, 2.15 und 2.16 vor Gelfiltration durchgeführt, um die Expression des Zielproteins zu bestätigen.</li>
</ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Wir haben eine einfache und kostengünstige Methode entwickelt (PEI kosten viel weniger als im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien lipophile) zur Expression und Reinigung von großen Mengen an rekombinanten Proteinen und Multi-Untereinheiten-Komplexen, die aus Säugetierzellen. Optimale Transfektion und Expressionseffizienz kann erreicht werden, wenn hochreine Plasmid-DNA (260/280 zwischen 1,8 und 2,0) in Kombination mit PEI wie in dem Protokoll beschrieben verwendet. Zellen müssen in serum-und antibiotikafreiem Medium kultiviert werden daher steriler Technik ist streng Passagierung und Transfektion von Zellen, um kostspielige und zeitraubende Infektionen zu vermeiden. Lebensfähigkeit der Zellen sollte 90% oder höher sein und Kulturen sollte nicht auf Dichten von mehr als 2,5 x 10 6 Zellen gezüchtet werden / ml unmittelbar vor einer Transfektion, da dies wird Proteinausbeute reduzieren. Für eine erfolgreiche Transfektion, sollte nur Kulturen enthalten einzelne oder teilenden Zellen. Cluster können durch Kraft gebrochen werdenOrganisationseinheiten Vortex 20 bis 30 sec (Abbildung 5). Das Verhältnis von jedem Plasmid in der Co-Transfektion verwendet werden, können durch den Benutzer gemäß der Stöchiometrie des Komplexes untersucht variiert werden. Expressionseffizienz für das Protein von Interesse optimiert werden, so dass ein geeignetes Expressionszeit hergestellt werden kann. Reinigung sollte durchgeführt halten die Proteinprobe Kälte zu jeder Zeit, um das Risiko von unerwünschten proteolytischen Abbau zu reduzieren. Die Auswahl des Tags und Reinigungspuffer ist kritisch, da sie strukturelle Elemente oder aktive Stellen von bestimmten Proteinen stören, was häufig zu einer reduzierten Löslichkeit und / oder Verlust der enzymatischen Aktivität. Klein Transfektionen sind besonders nützlich für das Testen verschiedener Konstrukte für die Reinigung von großen Proteinkomplexen. Heute ist eine große Vielfalt von alternativen Methoden sind für die Expression des rekombinanten eukaryontischen Proteinen (Tabelle 2) verfügbar. Zum Beispiel Baculovirus Expression in Insektenzellen wird häufig wegen seiner hohen Transduktionseffizienz und ihre mangelnde Zytotoxizität im Vergleich zu anderen viralen Spezies 6 verwendet. Jedoch ist das Verfahren zur Herstellung des Virus zeitaufwendig und seiner Instabilität nicht den Viren für längere Zeit gelagert werden. Auf der anderen Seite bieten Hefe-Expressionssystemen die Möglichkeit wachsenden Zellen zu sehr hohen Dichten in Fermenter-Kulturen, was zu hohen Proteinausbeuten 7. Aber noch nicht über die volle Vielzahl von post-translationalen Modifikationen für eukaryontische Proteine ​​erforderlich ist, um korrekt zu falten und die Interaktion mit den Proteinpartner. HDAC3 zum Beispiel exprimiert, aber nicht in E. falten coli. Wenn jedoch in 293F-Zellen exprimiert, waren wir in der Lage, ein aktives Enzym im Komplex mit seinem Co-Repressor (SMRT) und einem Molekül von Inositol-Tetraphosphat (IP4) 8, die in prokaryotischen Zellen gefunden wird, zu reinigen. Diese Methode hat sich uns auch die Möglichkeit zu reinigen und lösen das Kristall structure von HDAC1 Interaktion mit MTA1 im NuRD-Komplex, der in ähnlicher Weise durch IP4 9 aktiviert wird. Idealerweise würden wir immer gerne eukaryotischen Proteinen in ihrer natürlichen, physiologischen Umgebung auszudrücken. Säugetier-Expressionssysteme, die HEK 293-Zellen in Bioreaktoren EBNA1 10-12 beschrieben und ergeben sehr hohe Protein, diese können aber komplex in der Anwendung sein. Unser Verfahren ist eine einfache und leicht zugängliche Alternative zur Expression in Bakterien, Hefe und Bioreaktorsysteme. Expressionsverfahren ist schnell und erfordert nicht die Verwendung von teuren Geräten, insbesondere wenn der Rollflasche oder Kolbenatmosphäre mit 5% CO 2 und Standard Schüttelinkubatoren verwendet werden ersetzt. Wir haben diese Protokolle verwendet, um mehrere Plasmide co-transfizieren und zu reinigen Komplexe mit bis zu fünf Proteine ​​mit Ausbeuten von&gt; 1 mg / l Kultur. Interessant ist, hilft das System die Identifizierung von stabilen brav Komplexe. Zum Beispiel expression des binären Komplex von HDAC1 und Sin3A gab begrenzten Proteinausbeuten, noch Zusatz von SDS3 Folge 5-fach höhere Mengen und somit führt die Strukturbiologe bei der Wahl der geeigneten Konstrukte und stabile Komplexe für die Kristallisation.

Der rasche Fortschritt der molekularen Zellbiologie und der ständige Bedarf an verbesserten Drogen in der Medizin hat einen Bedarf an Strukturbiologen um bei zunehmend komplexer Proteinstrukturen aussehen erstellt. Diese können oft erfordern besondere post-translationale Modifikationen, molekulare Chaperone und Co-Faktoren, die ihre kunstvollen Falten und enzymatische Aktivität zu unterstützen. Während die überwiegende Mehrheit der in der Protein Data Bank wurden mit bakteriellen Expressionssystemen gewonnen worden gegenwärtigen Strukturen sind Prokaryoten nicht um eine große Anzahl dieser Modifikationen durchzuführen und es fehlt vielen wesentlichen eukaryotischen Co-Faktoren. Dies kann ein Problem für die Untersuchung von großen Multi-Untereinheiten-Komplexen, die bei kleinen Signalmolekülen sowie für nukleare, Zelloberflächen und sekretierte Proteine, die aufwendigen Faltung Maschinen erforderlich aktiviert werden. Eine Anzahl von E. coli-Stämme wurden entwickelt, um einige dieser Einschränkungen 1 überwinden. In den letzten Jahren wurde jedoch die Verwendung von mammalian Expressionssystemen ist gestiegen, weil sie zuverlässig eukaryotischen Proteinen, die sonst problematisch in anderen Systemen 2 auszudrücken produzieren. Heute ist es möglich, eine stabile und vorübergehende Expression Säugerzelllinien durch eine Vielzahl von Techniken, die aus viralen Transduktion chemisch vermittelte Transfektion Bereich zu erhalten, physikalischen Gentransfer wie Elektroporation und direkte Injektion 3. Während alle diese Verfahren haben ihre eigenen Vorteile und Nachteile, nur einige von ihnen sind für strukturelle Untersuchungen entweder zu teuer und / oder zeitaufwendig. Hier beschreiben wir eine sehr einfache, schnelle, kostengünstige, aber hochwirksames Verfahren zur Expression von Proteinkomplexen Strukturbiologie in Suspension gezüchtet Säugerzellen. Der Ansatz nutzt transiente Co-Transfektion einer humanen embryonalen Nierenzellen (HEK)-Zelllinie (zB Freestyle HEK 293F-Zellen). Diese Zellen wurden aus der HEK 293-CE abgeleitetll Linie dazu geeignet sind, in Suspensionskulturen wachsen und erreichte hohe Dichten mit Serum-freien Medien (wie FreeStyle 293 Expression Medium). Die Zellen werden dann vorübergehend mit einer verzweigten Version von Polyethylenimin (PEI), eine preiswerte Polymer Reagenz, das berichtet wurde, dass für eine Vielzahl von Säugetierzellen durch Bildung von 4 DNA / PEI-Komplexe, die die Wirtszelle geben durch Endozytose 5 funktionieren transfiziert. Dieses Verfahren eignet sich sowohl für kleine Skala (30 ml) und große (bis zu 300 ml) Versuchen und kann hohe gereinigtes Protein-Komplexe zu erzeugen. Es ist besonders nützlich für die Untersuchung von Proteinen, die komplexe Faltung Maschinen, Co-Faktoren oder bestimmte post-translationale Modifikationen, die nicht von Bakterien, Hefe und Insektenzellen durchgeführt werden kann, erforderlich. In diesem Protokoll zu präsentieren wir die Expression und Reinigung der drei zentralen Gerüstprotein aus der Sin3A Transkriptionsrepression komplex. Diese besteht aus HistoneDeacetylase 1 (HDAC1), Suppressor der Defekte Silencing 3 (SDS3) und Switch-unabhängige 3 (Sin3A). Das gereinigte Komplex ist für Hochdurchsatz-Kristallisationsversuche verwendet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle HEK 293F cells&#160;</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:315px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td style="width:119px;">12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td style="width:140px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Roller bottles with vented caps</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">01836-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Polyethylinamine, 25 kDa, branched</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">408727</td>
			<td style="width:292px;">Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mammalian expression vector</td>
			<td style="width:140px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Superdex&#160; 10/300 GL</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-5175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

Hier zeigen wir eine 2-L (8 x 250 ml-Kulturen) transiente Co-Transfektion und Reinigung der HDAC1, SDS3, Sin3A ternären Komplex. HDAC1 und SDS3 mit Sin3A interagieren durch die HDAC-Interaktionsdomäne (HID) von Sin3A. Eine typische Reinigungsausbeuten von bis zu 1 mg Komplex pro Liter Kultur. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1 Schematische Darstellung des modifizierten pcDNA 3.1 Expressionsvektor. Das Plasmid wurde mit EcoRV und EcoRI verdaut, um die Affinität-Tags und TEV-Spaltstelle am Aminoterminus Sin3A umfassen. Ungetaggte Versionen von HDAC1 und SDS3 Klonierung wurde der Vektor mit KpnI und EcoRI verdaut. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. SDS-PAGE zeigt den ersten Schritt der Reinigung. Der &quot;gebundene Protein&quot; Spur zeigt das an das Affinitätsharz gebundenen Komplexes. Nach TEV Verdauung, ist die vorliegende Tag auf Sin3A-HID abgespalten und der Komplex wird aus dem Harz eluiert, wie in der zweiten und dritten Spuren des Gels gezeigt. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3: Chromatogramm Protein-Komplexes unter Verwendung von gereinigtem Grßenausschlußchromatographie. Beachten Sie, dass der reine Komplex in dem Leervolumen eluiert, da sie ein Dimer bildet, in Lösung. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. SDS-PAGE, die die Bruchteile des in 3 gezeigten Gelfiltration. Abbildung 5. Trypanblau-gefärbten HEK 293F-Zellen in 2.3x10 6 Zellen / ml bereit, transfiziert werden. Zellen sollten nur als Einzel oder teilenden Zellen vorhanden sein, während große Cluster kann durch kräftiges Vortexen für ca. 25 Sekunden unterbrochen werden. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Problem </td><td> Mögliche Ursachen </td><td> Aktion </td></tr><tr><td rowspan="4"> Geringe Proteinausbeute. </td><td> Geringe Anzahl von Zellen transfiziert. </td><td> Stellen Sie sicher, Zelldichte etwa 1,0 × 10 6 vor dem Hinzufügen der Transfektion Reaktionsgemisch auf die Kultur. </td></tr><tr><td> Zellen können zu oft subkultiviert wurden. </td><td> Verwenden Sie frische Lager Zellen nach etwa 90 PassAltersgruppen. </td></tr><tr><td> DNA verschlechtert oder eine hohe Menge an Verunreinigungen sein. </td><td> Stellen Sie sicher, die Plasmid-DNA verwendet hat eine 260/280 Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0. Ausführen der DNA auf einem Agarose-Gel ist ratsam, seine Qualität zu beurteilen. </td></tr><tr><td> Protein (e) exprimiert sind nicht stabil oder löslich genug. </td><td> Testen Sie verschiedene Konstrukte im kleinen Maßstab vor, um up-Skalierung der Transfektionen. Stellen Sie sicher, Tags nicht mit der Struktur der Protein (e) von Interesse stören. </td></tr><tr><td> Zellen aussehen bewölkt und haben eine ungewöhnliche Farbe und / oder Geruch. </td><td> Zellen werden mit Bakterien oder Hefe infiziert. </td><td> Gute sterile Technik muss jederzeit verwendet werden. Räucherpatronen die Laminarströmungshauben und UV-Desinfektion des Zellkulturraum im Falle einer Infektion trägt das Problem enthalten. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Zellen haben eine geringe Überlebensfähigkeit. </td><td> Falscher pH-Wert in den Medien. </td><td> Stellen Sie sicher, Kulturen werden bei 5-8% CO 2 gewachsenzu allen Zeiten. </td></tr><tr><td> Zellen wurden bis zu einer Dichte von mehr als 3.0x10 6 Zellen / ml kultiviert. </td><td> Die Zellen sollten nicht bis auf Dichten von mehr als 2,5 x 10 6 Zellen / ml unmittelbar vor einer Transfektion und nicht über 3,0 x 10 6 Zellen / ml gezüchtet werden. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Affinitätsreinigung hat nicht funktioniert </td><td> Protein (e) wird nicht exprimiert. </td><td> Siehe oben. </td></tr><tr><td> Reinigungsbedingungen könnte falsch sein. </td><td> Passen Pufferbedingungen (zB hohe Salz, wenig Salz, pH-Wert.) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Fehlersuche. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> System </td><td> Vorteile </td><td> Nachteile </td></tr><tr><td> E. coli </td><td><ul><li> SchnellExpressionssystem </li><li> Hohe Proteinausbeuten </li><li> Billig </li><li> Geeignet für die kostengünstige Herstellung von isotopenmarkierten Proteine </li></ul></td><td><ul><li> Fehlen wichtiger Chaperone, die für die Proteinfaltung erforderlich sein können </li><li> Mangel an viele Post-translationale Modifikationen </li><li> Kann Co-Faktoren, die wichtig für die Proteinfunktion und / oder komplexe Montage sind fehlt. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul><li> Kann die Mehrheit der Post-translationale Modifikationen durchführen </li><li> Billig </li></ul></td><td><ul><li> Fehlen einige post-translationale Modifikationen </li><li> Kann Co-Faktoren, die wichtig für die Proteinfunktion und / oder komplexe Montage sind fehlt. </li></ul></td></tr><tr><td> Baculovirus Expression in Insektenzellen </td><td><ul><li> Können alle Post-translationale Modifikationen durchführen &lt;/ Li&gt; <li> Baculovirus weniger zytotoxische als andere Virusstämme </li></ul></td><td><ul><li> Herstellung des Virus für die Transduktion ist zeitaufwendig </li><li> Das Virus ist nicht stabil und kann für lange Zeiträume gelagert werden, </li><li> Insektenzellen können Co-Faktoren, die für die Proteinfunktion und / oder komplexe Montage sind fehlt. </li></ul></td></tr><tr><td> Bioreaktoren mit Säugetiersystemen </td><td><ul><li> Können alle Post-translationale Modifikationen durchführen </li><li> Können alle Co-Faktoren für die Proteinfunktion und komplexe Montage benötigt bieten </li><li> Können Kulturzellen mit sehr hohen Dichten </li><li> Können alle Säugerproteinen, die komplexe Faltung Maschinen bedürfen einer ausdrücklichen </li><li> Sehr hohe Proteinausbeuten </li></ul></td><td><ul><li> Erfordert Fachpersonal, den Bioreaktor zu verwenden. </li><li> Teure Ausrüstung erforderlich ist. </li><li> Optimierung der Expression Zustands kann zeitaufwendig sein. </li></ul></td></tr><tr><td> HEK 293F Suspensionszellen </td><td><ul><li> Können alle Post-translationale Modifikationen durchführen </li><li> Können alle Co-Faktoren für die Proteinfunktion und komplexe Montage benötigt bieten </li><li> Können alle Säugerproteinen, die komplexe Faltung Maschinen bedürfen einer ausdrücklichen </li><li> Schnelle und intuitive Transfektionsprotokolls </li><li> Relativ preiswert im Vergleich zu Bioreaktoren und / oder anderen im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien. </li></ul></td><td><ul><li> Obwohl erschwinglich, nicht so billig wie die Expression in Bakterien </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Vorteile und Nachteile der wichtigsten Expressionssysteme.

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Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

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Research

JoVE Journal

Biology

53.5K Aufrufe.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Serie: Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Protein in mCD1d Insektenzellen.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

Expression rekombinanter Proteine für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz