ברצוננו להודות לד&quot;ר Xiaowen יאנג (שירות שיבוט Protex) להכנת מבני ביטוי המשמשים לעבודה זו, והאוניברסיטה של ​​שירותי ביוטכנולוגיה Core לסטר. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת לימודי BBSRC, נאמנות תכנית Wellcome ומענקי חוקר בכירים WT085408 &amp; WT100237 וBBSRC להעניק RM31G0224.

הערה: הפרוטוקול מתאים לכל קנה מידה של ביטוי, ולכן היקפים וכמויות של חומרים כימיים צריכים להיות מדורגים באופן יחסי. וקטור ביטוי יונקים מתאים יש להשתמש בפרוטוקול זה. כאן השתמשנו בוקטור ביטוי pcDNA 3.1 שונה כי בנוחות מאפשר הכללה או אי הכללת תג זיקה בהתאם לבחירה של אנזימי הגבלה בשימוש בשיבוט (איור 1). הפרוטוקול הבא מתאר transfection בקנה מידה גדול. .1 תרבות בקנה מידה גדולה / Transfection בבקבוקי רולר 1 ליטר לגדול ולשמור על תאים מותאמים השעיה HEK293F על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. בדרך כלל תרבויות המתנע של בין 30 100 מ&quot;ל גדלים ב250 מ&quot;ל צלוחיות תרבית תאי חרוטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע ב0.5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל בנפח סופי של 300 מ&quot;ל בבקבוק אחד הרים L 1. הערה: בקבוקי רולר להכיל מינימום של 150 מ&quot;ל עד למקסימום של300 מ&quot;ל של תרבות השעיה. לtransfections קנה מידה הגדול יותר להשתמש בבקבוקים רבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 24 שעות באינקובטור שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס, 120 סל&quot;ד, ו 5% CO 2 עד תאים להגיע לצפיפות של 1.0 x 10 6 תאים / מ&quot;ל (תאים צריכים לחלק בערך כל שעה 24). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה כוללת של 300 מיקרוגרם של DNA-מעוקר מסנן (ראה שיטה נוספת) ל30 מ&quot;ל של PBS ומערבולת במרץ במשך 3 שניות. הערה: השתמש בסכום כולל של 1 מיקרוגרם של DNA למיליון תאי transfected. אם שניים או יותר פלסמידים יש שיתוף transfected-להפחית את הכמות של כל אחד, כך שהיחס של DNA לתאים נשאר קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1.2 מ&quot;ל של 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר מסנן מעוקר PEI לפתרון PBS / DNA והמערבולת במרץ במשך 3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת על RT עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את DNA / PEI לערבב לתאים - שאמור להיות בצפיפות של 1 x 10 6 מ&quot;ל תאים / (שלב 1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות שיתוף transfection, דגירה התאיםבחממת ייקר מסלולית ל48 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 120 סל&quot;ד, ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים תאיים קציר על ידי צנטריפוגה תאים ב3,000 XG למשך 5 דקות ולאחסן את גלולה ב -80 מעלות צלזיוס. הערה: לחלופין, להשתמש סטנדרטי (לא CO 2) רועד חממה, אם האטמוספרה מעל התרבות מוחלפת עם 5% CO 2 ואת מכסה הבקבוק אטום. האווירה צריכה להיות מוחלפת בכל קטע (בדרך כלל כל 2 ימים). </li></ol> .2 טיהור חלבון מורכב מתמצית תא כל פרוטוקול זה הוא מותאם לטיהור מתחמים גרעיניים באמצעות חלבונים מתויג דגל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר תא גלולה ל~ 40 מ&quot;ל של חיץ תמוגה טרום צונן (100 אצטט מ&quot;מ אשלגן, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5, גליצרול 5%, 0.3% טריטון X-100, מעכבי פרוטאז) לכל ליטר של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את גלולה ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים (כדי למנוע הקצפה, לא מערבולת). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות מחדש להשעות תאים באמצעות homogenizer זכוכית. Sonicate ל3 מחזורים (15 שניות על, 15 שניות כבויות). צנטריפוגה ב30,000 XG ל25 דקות ב 4 מעלות ולשמור supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן 1.25 מ&quot;ל של אנטי הדגל ארוז שרף agarose לליטר של תרבות על ידי שטיפת שלוש פעמים עם חיץ איזון שרף (אצטט אשלגן 100 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל תמצית התא מצעד 2.3 עם שרף הזיקה ב50 מ&quot;ל צינורות צנטריפוגה אחת או יותר ובעדינות לסובב את המדגם עבור 30-120 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 3,000 XG 1 דקות ב 4 ° C, supernatant קלפים שנזרקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השרף עם 45 מ&quot;ל של חיץ מראש צונן 1 (100 אצטט מ&quot;מ אשלגן, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5, גליצרול 5%, 0.3% טריטון X-100). צנטריפוגה ב3,000 XG 1 דקות וזורקי supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.7 באמצעות חיץ מלח גבוה (300 אצטט מ&quot;מ אשלגן, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5, גליצרול 5%), ואחריו חיץ נמוך מלח (אצטט אשלגן 50 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ טריס 7 pH.5, 5% גליצרול) וTEV מחשוף חוצץ (אצטט אשלגן 50 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5, 0.5 מ&quot;מ TCEP). הערה: ודא כל שטיפה הוא כלומר קצר, מספיק באופן מלא מחדש להשעות את השרף ועוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימת 10 μl של שרף ולדלל לתוך הנפח של 1 חיץ 2x טעינת חלבון לניתוח (שליטת חלבון קשורה). אין להשתמש בסוכני הפחתה על מנת להימנע משחרור הנוגדן מהשרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות Re השרף לתוך 8-10 מ&quot;ל של חיץ מחשוף TEV טרום צונן והעברה לצינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 40 מיקרוגרם של פרוטאז TEV (מהמלאי ב1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לכל ליטר של תרבות המקורית ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף אווירת צינור עם גז N 2 100% על מנת למנוע חמצון חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לסובב O / N ב4 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב3,000 XG עבור 10 דקות. מעבירים את supernatant לתוך מסנן צנטריפוגלי במיוחד עם ניתוק משקל מולקולרי מתאים ולהתרכזעד 500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימת 10 μl של החלבון המרוכז ולדלל לתוך הנפח של 1 חיץ טעינת חלבון 2x לניתוח. (TEV eluate שליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימת 10 μl של השרף ולדלל לתוך הנפח של 1 חיץ טעינת חלבון 2x לניתוח. אל תשתמש צמצום סוכנים על מנת להימנע משחרור כמויות הגדולות של נוגדנים מהשרף. (שליטת שרף Post-TEV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את העמודה כרומטוגרפיה הדרת גודל עם חיץ סינון ג&#39;ל (אצטט אשלגן 50 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5, 0.5 מ&quot;מ TCEP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את החלבון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם לתוך הטור ולאסוף את השברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות לרוץ מצעדים 2.9, 2.15 ו2.16 ושברי סינון ג&#39;ל מצעד 2.19 על SDS-PAGE וכתם Coomassie לניתוח. הערה: מומלץ לרוץ SDS-PAGE של דגימות מצעדים 2.9, 2.15 ו2.16 לפני ג&#39;ל סינון כדי לאשר ביטוי של חלבון המטרה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli.">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li><li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells:+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology.">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+galenics+improve+in+vitro+gene+transfer+with+cationic+molecules+up+to+1000-fold.">Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold.</a> Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).</li><li>Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+(ethylenimine)+and+its+role+in+gene+delivery.">Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).</li><li>Beljelarskaya, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+systems+for+production+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).</li><li>Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+expression+of+foreign+genes+in+Pichia+pastoris.">Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris.</a> Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).</li><li>Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HDAC3+bound+to+co-repressor+and+inositol+tetraphosphate.">Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate.</a> Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).</li><li>Millard, C. J., Watson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+I+HDACs+Share+a+Common+Mechanism+of+Regulation+by+Inositol+Phosphates.">Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates.</a> Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).</li><li>Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+HEK293-EBNA1+Cells+in+Suspension+with+Linear+PEI+for+Production+of+Recombinant+Proteins.">Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins.</a> CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).</li><li>Baldi, L., Muller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Gene+Expression+in+Suspension+HEK&#8208;293+Cells:+Application+to+Large&#8208;Scale+Protein+Production.">Transient Gene Expression in Suspension HEK&#8208;293 Cells: Application to Large&#8208;Scale Protein Production.</a> Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

פיתחנו שיטה יעילה פשוטה ועלות (PEI עולה הרבה פחות מאשר ריאגנטים transfection lipophilic זמינים מסחרי) לביטוי וטיהור כמויות גדולות של חלבונים רקומביננטי ומתחמים רב למקטע מתאי יונקים. ניתן להגיע transfection האופטימלי ויעילות ביטוי אם DNA הטהור ביותר פלסמיד (260/280 בין 1.8 ו2.0) משמש בשילוב עם PEI כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. תאים חייבים להיות מתורבת בתקשורת סרום ואנטיביוטיקה ללא, לכן, טכניקה סטרילית נדרש אך ורק לpassaging ותאי transfecting על מנת למנוע זיהומים יקרים וגוזל זמן. כדאיות תא צריכים להיות 90% או גבוהים יותר ותרבויות לא צריכים להיות מבוגרות כדי צפיפויות גדולות יותר מ2.5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל מייד לפני transfection, כשעושה זאת תפחית תשואת חלבון. לtransfection מוצלח, תרבויות צריכים להכיל רק תאים בודדים או החלוקה. אשכולות יכולים להיות שבורים על ידי מרץvortexing היחידות הארגוניות 20 עד 30 שניות (איור 5). היחס של כל פלסמיד המשמש בשיתוף transfection יכול להיות מגוון על ידי המשתמש בהתאם להרכב של ההוויה המורכבת למדה. יעילות ביטוי יכולה להיות מותאמת לחלבון של עניין, כדי שניתן יהיה הוקם זמן ביטוי מתאים. טיהור יש לבצע שמירה הקרה מדגם חלבון בכל העת כדי להפחית את הסיכון של השפלה פרוטאוליטים לא רצויה. הבחירה של תגים ומאגרי טיהור היא קריטית, שכן הם עלולים להפריע לאלמנטים מבניים או אתרים פעילים של חלבונים מסוימים, ופעמים רבות תוצאה מסיסות ו / או אובדן של פעילות האנזימטית מופחתים. transfections בקנה מידה הקטן הם שימושי במיוחד לבדיקת מבנים שונים לטיהור של קומפלקסי חלבונים גדולים. היום, מגוון רחב של שיטות חלופיות זמין לביטוי של חלבונים רקומביננטי אוקריוטים (טבלה 2). לדוגמא, Baculoviביטוי rus בתאי חרקים נעשה שימוש נרחב בשל יעילותה הגבוהה התמרה וחוסרה של cytotoxicity בהשוואה למינים נגיפיים אחרים 6. עם זאת, התהליך של קבלת הווירוס הוא זמן רב וחוסר היציבות שלה אינו מאפשר לנגיף להיות מאוחסן במשך תקופות ארוכות. מצד השני, מערכות שמרי ביטוי להציע את האפשרות של גידול תאי צפיפויות גבוהה מאוד בתרבויות פרמנטור, וכתוצאה מכך התשואות גבוהות של חלבון 7. אבל הם עדיין חסרים את המגוון המלא של שינויים שלאחר translational נדרשים לחלבונים אוקריוטים לקפל בצורה נכונה וליצור אינטראקציה עם שותפי החלבון שלהם. HDAC3, למשל, בא לידי הביטוי, אך לא לקפל בE. coli. עם זאת, כאשר באו לידי ביטוי ב293F תאים, היינו יכול לטהר את האנזים פעיל בקומפלקס עם העמיתים למדכאים שלה (SMRT) ומולקולה של tetraphosphate אינוסיטול (IP4) 8, שלא נמצא בתאים פרוקריוטים. שיטה זו גם אפשרה לנו לטהר ולפתור את הגביש structure של HDAC1 אינטראקציה עם MTA1 במתחם NuRD, אשר מופעל באופן דומה על ידי 9 IP4. באופן אידיאלי, היינו תמיד רוצים להביע את החלבונים אוקריוטים בסביבה הטבעית, הפיזיולוגית שלהם. מערכות ביטוי של יונקים העסקת תאי 293-EBNA1 HEK בbioreactors 10-12 תוארו ותנבנה רמות גבוהות מאוד של חלבון, אבל אלה יכולים להיות מורכבים לשימוש. השיטה שלנו היא חלופה פשוטה ונגישה לביטוי במערכות חיידקים, שמרים וbioreactor. שיטת הביטוי היא מהירה ואינה דורשת שימוש בציוד יקר, במיוחד אם אווירת בקבוק רולר או בקבוק מוחלפת עם 5% CO 2 וחממות רועדות סטנדרטיים משמשות. יש לנו בשימוש בפרוטוקולים אלה לשיתוף transfect פלסמידים מרובים ולטהר מתחמים עם עד חמישה חלבונים עם תשואות של&gt; 1 מ&quot;ג / L של התרבות. מעניין לציין, כי המערכת מסייעת בזיהוי של קומפלקסים מחונכים יציבים. לדוגמא, לשעברpression של המתחם בינארי של HDAC1 וSin3A נתן תשואות מוגבלות של חלבון, אך תוספת של SDS3 הביאה 5 פי סכומים גבוהים יותר, ולכן מנחה את הביולוג המבני בבחירה של מבנים מתאימים ומתחמים יציבים לגיבוש.

ההתקדמות המהירה של ביולוגיה מולקולרית של תא והצורך התמידי בתרופות השתפרו ברפואה יצרו צורך בביולוגים מבניים להסתכל על מבנים חלבוניים יותר ויותר מורכבים. אלה לעתים קרובות יכולים לדרוש שינויים מסוימים שלאחר translational, מלווים מולקולריים ושיתוף גורמים לתמוך מתקפלים המשוכלל שלהם ופעילות האנזימטית. בעוד הרוב המכריע של מבנים קיימים בחלבון נתוני הבנק התקבלו תוך שימוש במערכות ביטוי בקטריאלי, פרוקריוטים אינכם מצליחין לבצע מספר רב של שינויים אלה וחוסר שיתוף גורמים אוקריוטים חיוניים רבים. זה יכול להיות נושא למחקר של מתחמים רב למקטע גדולים שמופעלים על ידי מולקולות איתות קטנות, כמו גם לגרעין, פני תא וחלבונים מופרשים הדורשים מנגנונים קיפול משוכללים. מספר א &#39; זני coli כבר מהונדסים כדי להתגבר על חלק מהמגבלות אלה 1. בשנים האחרונות, עם זאת, השימוש במ &#39;מערכות ביטוי ammalian כבר גדלו, כי הם אמינים לייצר חלבונים האיקריוטים כי הם בעייתיים מבחינה אחרת להביע במערכות אחרות 2. כיום ניתן להשיג שורות תאי יונקים ביטוי יציבים וחולפות באמצעות מגוון רחב של טכניקות שנעות בין התמרה ויראלית לtransfection בתיווך כימי, גן העברה פיזית כגון electroporation והזרקה ישירה 3. בעוד שכל השיטות האלה יש קבוצה של יתרונות וחסרונות משלהם, רק מעטים מהם מתאימים ללימודים מבניים להיות גם רב יקר ו / או גם הפעם. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה מאוד, מהירה, זולה עדיין יעילה ביותר לביטוי קומפלקסי חלבונים לביולוגיה מבנית בתאי יונקים השעיה גדלה. הגישה משתמשת בשיתוף transfection החולף של קו הכליה העוברית אנושי (HEK) תא (לדוגמא, תאי Freestyle HEK 293F). תאים אלה כבר נגזרו מce HEK 293שורת ll, מותאמת לגדול בתרבויות השעיה, הגיעה צפיפות גבוהה באמצעות סרום ללא מדיה (כגון FreeStyle 293 ביטוי בינוני). תאים אז זמני transfected משתמשים בגרסת קנים של polyethylenimine (PEI), מגיב פולימרים זולים שכבר דווח לתפקד לטווח גדול של תאי יונקים 4 על ידי יצירת דנ&quot;א / מתחמי PEI שלהיכנס לתא המארח על ידי אנדוציטוזה 5. שיטה זו מתאימה לשניהם בקנה מידה קטן (30 מ&quot;ל) ובקנה מידה גדול (עד 300 מ&quot;ל) ניסויים ויכולה לייצר רמות גבוהות של קומפלקסי חלבונים מטוהרים. זה שימושי במיוחד ללימוד חלבונים הדורשים מנגנונים מורכבים מתקפלים, שיתוף גורמים או לאחר translational שינויים מסוימים שלא יכול להתבצע על ידי חיידקים, שמרים ותאי חרקים. בפרוטוקול זה אנו מציגים את הביטוי והטיהור של הפיגום המרכזי שלושת חלבון ממתחם דיכוי תעתיק Sin3A. זה מורכב מהיסטוןDeacetylase 1 (HDAC1), מדכאי לקויים השתקת 3 (SDS3) והמתג עצמאי 3 (Sin3A). המורכב המטוהר משמש לניסויי התגבשות תפוקה גבוהה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle HEK 293F cells&#160;</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:315px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td style="width:119px;">12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td style="width:140px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Roller bottles with vented caps</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">01836-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Polyethylinamine, 25 kDa, branched</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">408727</td>
			<td style="width:292px;">Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mammalian expression vector</td>
			<td style="width:140px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Superdex&#160; 10/300 GL</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-5175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

כאן אנו מראים L 2 (8 x 250 תרבויות מ&quot;ל) שיתוף transfection החולף וטיהור של HDAC1, SDS3, מורכב משולש Sin3A. HDAC1 וSDS3 אינטראקציה עם Sin3A דרך תחום HDAC-האינטראקציה (HID) של Sin3A. תשואות טיהור טיפוסיות עד 1 מ&quot;ג של מתחם לליטר של התרבות. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 סכמטי של וקטור pcDNA 3.1 ביטוי שונה. פלסמיד היה מתעכל עם EcoRV וEcoRI לכלול זיקת תג ואתר מחשוף TEV בתחנה הסופית אמינו של Sin3A. לשבט גרסאות לא מתויגות של HDAC1 וSDS3, הווקטור היה מתעכל עם KpnI וEcoRI. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 SDS-PAG<html> E מראה את הצעד הראשון של הטיהור. הנתיב &quot;החלבון קשור&quot; מציג את המורכבות קשורות לשרף הזיקה. בעקבות עיכול TEV, הווה התג על Sin3A-HID הוא ביקע את ומורכב הוא eluted מהשרף כפי שמוצג בנתיבים השניה והשלישי של ג&#39;ל. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 chromatogram של כרומטוגרפיה מטוהרת חלבונים מורכבים באמצעות הדרת גודל. שים לב שמורכב הטהור eluted בחלל הנפח כי זה יוצר דימר בפתרון. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 SDS-PAGE מראה את השברים של סינון ג&#39;ל שמוצג באיור 3. r.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig5highres.jpg" width="500" /> תאי איור 5 Trypan המוכתם כחולים HEK 293F ב2.3x10 6 תאים / מ&quot;ל מוכן להיות transfected. תאים צריכים להיות רק בהווה כתאים בודדים או החלוקה, ואילו אשכולות גדולים עשויים להיות שבורים על ידי vortexing הנמרץ במשך כ 25 שניות. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בעיה </td><td> סיבות אפשריות </td><td> פעולה </td></tr><tr><td rowspan="4"> תשואת חלבון נמוכה. </td><td> מספר נמוך של תאי transfected. </td><td> הפוך צפיפות תאים בטוחה היא כ 1.0 x 10 6 לפני הוספת תערובת תגובת transfection לתרבות. </td></tr><tr><td> תאים שאולי היו subcultured יותר מדי פעמים. </td><td> להשתמש בתאי המניה טריים לאחר כ 90 לעבורגילים. </td></tr><tr><td> DNA יכול להיות מושפל או יש כמות גבוהה של זיהומים. </td><td> יש ודא בשימוש פלסמיד דנ&quot;א יחס 260/280 בין 1.8 ו2.0. ריצת DNA על ג&#39;ל agarose מומלץ להעריך את איכותה. </td></tr><tr><td> חלבון (ים) שהביע אינו יציב או מסיס מספיק. </td><td> בחן את המבנים שונים בקנה מידה קטנה לפני הגמלון-transfections. הפוך תגים בטוחים לא מפריעים למבנה של החלבון (ים) של עניין. </td></tr><tr><td> תאים נראים מעונן ויש לי צבע ו / או ריח מוזר. </td><td> תאים נגועים בחיידקים או שמרים. </td><td> טכניקה סטרילית טובה חייבת להיות בשימוש בכל העת. לאוורור זרימת הברדסים למינרית וUV-חיטוי חדר תרבית תאים במקרה של זיהום מסייע המכיל את הבעיה. </td></tr><tr><td rowspan="2"> יש לי תאים כדאיות נמוכה. </td><td> pH שגוי בתקשורת. </td><td> ודא תרבויות בטוחים גדלים ב5-8% CO 2בכל העת. </td></tr><tr><td> תאים היו בתרבית עד צפיפות מעל 3.0x10 6 תאים / מ&quot;ל. </td><td> לא צריכים להיות מבוגרים תאים עד צפיפויות מעל 2.5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל מייד לפני transfection ולא x מעל 3.0 10 6 / תאים למ&quot;ל. </td></tr><tr><td rowspan="2"> טיהור זיקה לא עבדה </td><td> חלבון (ים) לא בא לידי ביטוי. </td><td> ראה לעיל. </td></tr><tr><td> תנאי טיהור עשויים להיות שגויים. </td><td> התאם תנאי חיץ (למשל, מלח גבוה, נמוך מלח, pH.) </td></tr></tbody></table> טבלת 1 פתרון בעיות. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מערכת </td><td> יתרונות </td><td> חסרונות </td></tr><tr><td> חיידק </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירמערכת ביטוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשואות גבוהה של חלבון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתאים לייצור במחיר סביר של חלבונים שכותרתו isotopically </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוסר מלווים חשובים שעשויות להידרש לקיפול חלבונים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוסר שינויים שלאחר translational רבים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייתכן חוסר שיתוף גורמים החשובים לתפקוד חלבון ו / או הרכבה מורכבת. </li></ul></td></tr><tr><td> פ pastoris </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לבצע את רוב שינויי translational הודעה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זול </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסר כמה שינויים שלאחר translational </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייתכן חוסר שיתוף גורמים החשובים לתפקוד חלבון ו / או הרכבה מורכבת. </li></ul></td></tr><tr><td> ביטוי baculovirus בתאי חרקים </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לבצע את כל השינויים שלאחר translational &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Baculovirus הוא פחות רעיל לתאים מאשר זנים נגיפיים אחרים </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת הווירוס לתמרה היא זמן רב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הווירוס הוא לא יציב ולא יכול להיות מאוחסן במשך פרקי זמן ארוכים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי חרקים עשויים חוסר שיתוף גורמים החשובים לתפקוד חלבון ו / או הרכבה מורכבת. </li></ul></td></tr><tr><td> ריאקטורים עם מערכות יונקים </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לבצע את כל השינויים שלאחר translational </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לספק את כל שיתוף הגורמים נחוצים לתפקוד חלבון והרכבה מורכבת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול תאי תרבות בצפיפויות גבוהות מאוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לבטא את כל החלבונים של היונקים הדורשים מנגנונים קיפול מורכבים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשואות חלבון גבוהות מאוד </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דורש צוות מיוחד כדי להשתמש bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד יקר הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצב ביטוי אופטימיזציהים עשוי להיות זמן רב. </li></ul></td></tr><tr><td> תאי השעיה HEK 293F </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לבצע את כל השינויים שלאחר translational </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לספק את כל שיתוף הגורמים נחוצים לתפקוד חלבון והרכבה מורכבת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לבטא את כל החלבונים של היונקים הדורשים מכונות קיפול מורכבות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול transfection מהיר ואינטואיטיבי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זול יחסית בהשוואה לbioreactors ו / או חומרים כימיים transfection זמינים מסחרי אחרים. </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות מחיר סביר, לא זול כמו ביטוי בחיידקים </li></ul></td></tr></tbody></table> יתרונות טבלה 2 וחסרונות של מערכות ביטוי עיקריות.

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach at JoVE.com

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

recombinant-protein-expression-for-structural-biology-hek-293f

Research

JoVE Journal

Biology

53.3K Views.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Video: Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

שיטה לייצור של חלבון רקומביננטי mCD1d בתוך תאים חרקים.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...