Nous remercions l&#39;Unité des affections malignes lymphoïdes, Elisa dix Hacken, Lydia Scarfo, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, et Angela Cattaneo. Ce projet a été soutenu par: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant et moléculaire Programme spécial Clinical Oncology - 5 pour mille # 9965) CS et BA conçus l&#39;étude, les expériences réalisées, ont analysé les données et rédigé le manuscrit. MTSB, UR, FBPR aidé à la rédaction du manuscrit. PG et FCC conçus les échantillons de l&#39;étude ont fourni des patients et des données cliniques.

REMARQUE: Tous les échantillons de tissus ont été obtenus avec l&#39;approbation du comité d&#39;éthique de l&#39;hôpital San Raffaele (Milan, Italie). 1. échantillons de tissus humains et de cellules purification (Figure 1) REMARQUE: les lymphocytes leucémiques ont été obtenues à partir du sang périphérique (PB) de patients atteints de LLC, diagnostiqués selon Mulligan et al 9. 1.1) cellules leucémiques séparation de PB <ol><li> Recueillir PB en collecte de sang tubes Vacutainer avec héparine de sodium. </li><li> Transférer le sang dans un tube de 15 ml et ajouter des cellules B humaines enrichissement cocktail à 50 ul / ml de sang entier. Bien mélanger et incuber 20 min à température ambiante. </li><li> Diluer l&#39;échantillon avec un volume égal de PBS + 2% de FBS, mélanger le sang avec douceur et précaution superposition sur le Ficoll, veillant à ne pas briser l&#39;interface. Utilisez au moins une partie de Ficoll à 2 parties de l&#39;échantillon dilué (soit 4 ml de Ficoll + 10 ml de sang dans un 15 ml tube). </li><li> Centrifuger à 400 xg, à température ambiante (20 ° C) pendant 20 min sans frein. Les cellules mononucléaires seront à l&#39;interface. </li><li> Aspirer soigneusement l&#39;interface pour récupérer les cellules et les placer dans un nouveau tube. Laver les cellules une fois avec du PBS et on centrifuge à 300 x g, 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant 5 minutes. Le culot sera en bas. </li><li> Jeter le surnageant. Reprendre le culot dans le surnageant restant en tapotant le tube d&#39;avant en arrière avec les doigts. On dilue le culot avec 10 ml de milieu RPMI complet (RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal et 15 mg / ml de gentamicine) et compter les cellules à l&#39;aide de la méthode d&#39;exclusion au bleu Trypan. </li></ol> 1.2) L&#39;évaluation de la pureté REMARQUE: Pureté de toutes les préparations doit toujours être supérieure à 99%. <ol><li> Incuber 100 pi de suspension cellulaire purifiée avec les anticorps suivants (disponibles dans le commerce; voir le tableau des matériaux): CD3 FITC (5 pi / test), CD14 PE (5 pi / essai), CD19 DPE (6 pi / essai), CD16-CD56 PC5 (2 pi / essai), CD5 PC7 (4 pi / essai), pendant 20 min à 4 ° C dans un Tube FACS. </li><li> Laver l&#39;échantillon avec 4 ml de PBS (centrifugeuse pendant 5 min à 300 g) et vérifier la pureté par flux cytometry.Check dans le complot du% de cellules leucémiques (&gt; 99%) qui co-expriment CD19 et CD5 sur leur surface comme représenté sur la figure 1 (6). Veiller à ce que les préparatifs sont pratiquement dépourvues de NK, lymphocytes T et les monocytes en cochant la% de CD3, CD14 et CD16-56 dans le complot, qui devrait être proche de zéro. </li></ol> 1.3) Les échantillons de stockage <ol><li> Pour les études protéomiques, collecter 25 x 10 6 cellules dans un tube de 1,5 ml, les cellules de centrifugation à 300 g pendant 10 min, jeter le surnageant et lyophiliser boulettes pendant 4 heures. Conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Pour les essais de validation, remettre les cellules en RPMI complet (quantité dépend de l&#39;analyse en outre que c&#39;estchoisi) et passez à l&#39;étape 4. </li></ol> 2 électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) (figure 2) 2.1) isoélectrofocalisation (IEF) <ol><li> Solubiliser les cellules CLL pastilles avec un volume final de 380 ul de 2-DE tampon (344 ul d&#39;une solution RBthio (9 M d&#39;urée, Tris 10 mM, 4% de CHAPS), 30 pl de 65 mm de DTT, 6 ul de 2% IPG ampholine tampon pH 7.4). </li><li> Appliquer les échantillons de protéines (1 mg) à 18 bandes IPG (pH 4-7) et effectuer IEF suivant le protocole standard telle que décrite par Conti et al. 10 </li><li> Equilibrer les bandes dans 2 ml de tampon d&#39;équilibration (EB: tampon 50 mM pH 8.8 contenant du Tris-HCl 6 M d&#39;urée, 30% de glycerol, 2% de SDS), additionné de 2% de frais de DTT pendant 15 minutes à température ambiante. Jeter EB + TNT et ajouter 2 ml de EB complétés avec 2,5% Iodoacetamide. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur un agitateur oscillant. </li></ol> 2.2) SDS-PAGE <ol><li> Sécher les plaques sur un papier sans toucher le gel pour éliminerl&#39;excès de EB. Chargez chaque bande sur le dessus d&#39;un gel de 9-16% de SDS-PAGE gradient. Ajouter une petite quantité d&#39;électrophorèse SDS-tampon (Tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1% p / v) sur le dessus du gel, pour faciliter le chargement de la bande. </li><li> Sceller le gel par addition de ~ 5 ml de solution d&#39;agar (0,8%) afin d&#39;éviter de flotter la bande, puis l&#39;assemblage de l&#39;unité d&#39;électrophorèse et remplir avec du tampon SDS-électrophorèse. Effectuer la course à 60 mA / gel pendant 4 heures à 4 ° C. </li><li> Retirer le gel de l&#39;unité d&#39;électrophorèse et le placer dans la boîte de bonne coloration. </li></ol> 2.3) coloration à l&#39;argent pour préparative de gel <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> FIXER </td><td> 50% methanol 12% d&#39;acide acétique 0,05% de formol </td><td> 2 heures (ou toute la nuit) * </td></tr><tr><td> TAMPON DE LAVAGE </td><td> 35% Ehanol </td><td> 20 min (répéter l&#39;étape trois fois) </td></tr><tr><td> SENSIBILISATION </td><td> 0,02% de thiosulfate de sodium </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 5 min (répéter l&#39;étape trois fois) </td></tr><tr><td> NITRATE D&#39;ARGENT </td><td> 0,2% de nitrate d&#39;argent 0,076% formol </td><td> 20 min </td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 1 min (répéter l&#39;étape deux fois) </td></tr><tr><td> DÉVELOPPEUR </td><td> 6% de carbonate de sodium 0,0004% de thiosulfate de sodium 0,05% de formol </td><td> Jusqu&#39;à ce que la coloration est suffisante </td></tr><tr><td> Arrêtez </td><td> 50% de méthanol </td><td> 30 min </td></tr><tr><td></td><td> * 2 heures est le temps minimum nécessaire pour fixation de la protéine </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. REMARQUE: les taches de protéines peuvent être visualisées par coloration des gels avec MS compatible coloration à l&#39;argent 11. Toutes les solutions nécessairespour coloration à l&#39;argent sont énumérées dans le tableau 1. <ol><li> Préparer environ 200 ml de chaque solution / gel et procéder comme indiqué dans le tableau 1. Ajouter délicatement chaque solution à la boîte de coloration contenant le gel. Effectuer toutes les incubations sur une plate-forme à bascule. </li><li> Après la coloration, enlever la solution d&#39;arrêt et laisser le gel dans une solution de 1% d&#39;acide acétique jusqu&#39;à ce que l&#39;acquisition. </li></ol> 2.4) Gel d&#39;acquisition et d&#39;analyse <ol><li> Acquérir des images à haute résolution à l&#39;aide d&#39;un densitomètre dans les 3 jours à partir de la coloration. </li><li> Analyser les modèles de protéines 2-D en utilisant un logiciel de 2-DE gels. REMARQUE: Le logiciel permet une comparaison d&#39;image rapide et fiable. <ol><li> Créez un projet en choisissant &quot;créer un nouveau projet&quot; dans le menu contextuel. Créez un dossier et importer les gels en choisissant &quot;images de gel d&#39;importation&quot; avec .tif, png. ou .gel prolongation. </li><li> Une fois que les gels sont importés et ajoutés à la workspace, effectuer une détection d&#39;angle automatique en sélectionnant les gels pour la détection de place et en choisissant &quot;edit&gt; place&gt; détecter&quot; dans le menu. </li><li> Ensuite, effectuer une soustraction de fond en sélectionnant dans le menu &quot;fond soustraction&quot;. Remarque: Après cela, il est possible de comparer plusieurs gels et de détecter des différences ou des similitudes par l&#39;analyse quantitative et / ou qualitative. </li></ol></li></ol> 3 Identification des protéines par MALDI-TOF MS (Figure 3) 3.1) La digestion des protéines <ol><li> Rincer le gel avec des taches d&#39;eau et d&#39;accise d&#39;intérêt à partir de gels soit par manuel (coupant avec un scalpel propre) ou par excision automatisée. </li><li> Laver les particules de gel avec de l&#39;eau (100-150 pi), tourner vers le bas (30 sec à 400 xg) et enlever le liquide. </li><li> Ajouter un volume égal (en fonction du volume de gel) de CH 3 CN pour les morceaux de gel et attendre pendant 10-15 min jusqu&#39;à ce que les morceaux de gel se rétrécir. Sécher les particules de gel ina centrifugeuse sous vide. </li><li> Ajouter 75 à 100 ul de 10 mM de dithioérythritol dilué dans 50 mM de NH 4 HCO 3 et incuber pendant 30 min à 56 ° C (étape de réduction). Réduction de nouveau les morceaux de gel avec CH 3 CN comme décrit à l&#39;étape 3.1.3. </li><li> Procéder à alkylation en ajoutant 75-100 ul d&#39;une solution à 55 mM Iodoacetamide dilué dans 50 mM NH 4 HCO 3 et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Réduction de la taille des morceaux de gel une fois avec CH 3 CN en utilisant un volume suffisant pour recouvrir les morceaux de gel comme décrit dans l&#39;étape 3.1.3. Sec dans une centrifugeuse sous vide. </li><li> Réhydrater les particules dans un tampon contenant 25 mM de NH 4 HCO 3, 5 mM de CaCl2, et 12,5 ng / ul de trypsine à 4 ° C pendant 20 min. Utilisez un volume suffisant de tampon pour couvrir les morceaux de gel. Eliminer le surnageant de non absorbé par les morceaux de gel et ajouter mM NH 25 4 HCO 3, 5 mM de CaCl2 sans trypsine à cover le gel. </li><li> Laisser les échantillons à 37 ° C au moins 3 heures (le délai minimum requis pour le peptide digestion) pour la nuit. </li></ol> 3.2) Spectrométrie de masse analyse (technique de gouttelettes séchées) <ol><li> Coin 1 ul aliquote de chaque échantillon sur une plaque MALDI en acier inoxydable et mélanger avec 1 pi d&#39;α-cyano-4-hydroxycinnamique comme matrice, préparées dans 50% de CH 3 CN et 0,1% de TFA. </li><li> Obtenir des spectres de masse sur un spectromètre de masse MALDI-TOF. Accumuler environ 200 spectres par endroit, en ajustant l&#39;intensité du laser pour éviter la saturation du signal ou pour augmenter le signal. spectres de processus via le logiciel Data Explorer comme décrit ci-dessous: <ol><li> Importez le fichier dat et effectuer la correction de base en choisissant &quot;processus&gt; correction de base&quot;. Calibrer masses en utilisant les produits d&#39;autolyse de la trypsine et les sommets de la matrice en choisissant &quot;processus&gt; étalonnage de masse&gt; étalonnage manuel; sélectionnez pics proches de m / z 855,1 et 2163,1 by faisant glisser à gauche et sélectionner les masses de référence correspondant, puis cliquez sur «complot» et «s&#39;applique calibrage&quot; dans la fenêtre de calibrage manuel. </li><li> Régler le seuil de détection de crête (&quot;pic&gt; détection de crête&quot;), dupliquer la trace active (&quot;affichage&gt; dupliquer trace active&quot;), sélectionnez la nouvelle trace et effectuer la deisotoping (&quot;pic&gt; deisotoping&quot;). Utilisation de la macro &quot;getpeaklist&quot;, générer une liste de masses à être utilisé pour l&#39;identification. Si nécessaire, supprimer manuellement les signaux de bruit cueillis comme des pics pour nettoyer la liste et obtenir une meilleure identification. </li></ol></li><li> Identifier les protéines par la recherche d&#39;une base de données de protéines non-redondant complet utilisant profonde et Mascot les moteurs de recherche 12. <ol><li> Utilisez les paramètres suivants dans toutes les recherches: on a manqué clivage par peptide, l&#39;oxydation de la méthionine comme modification dans une variable, la cystéine carbamidomethylation que la modification fixe et une initial masse tolérance de 50 ppm. </li></ol></li></ol> 4. cytosquelette des tests d&#39;activité (Figure 4) REMARQUE: Remettre en suspension les cellules purifiées à l&#39;étape 1 dans du milieu RPMI complet (10 6 cellules / 200 ul). 4.1) Migration dosage. Cet essai permet la quantification de la capacité de migration des cellules analysées (lymphocytes). Utiliser une chambre Transwell de 6,5 mm de diamètre et 5,0 pm de taille de pores et effectuer les essais en triple exemplaire. Optimiser la taille des pores et le temps de migration (étape 4.1.3) dans le cas de différents types de cellules. <ol><li> Préparer la chambre inférieure en ajoutant 600 ul de RPMI complet avec ou sans stimuli spécifiques (SDF-1) pour mesurer la migration spontanée et induite par l&#39;respectivement. </li><li> Mettre la chambre supérieure et à laisser le système s&#39;équilibrer pendant 30 minutes à 37 ° C dans l&#39;incubateur. </li><li> Semences 10 6 cellules / 200 pi dans la chambre haute (nombre total de cellules) et incuberla plaque pendant 4 heures à 37 ° C dans l&#39;incubateur. </li><li> Retirer la chambre haute, recueillir les médias dans la chambre inférieure et laver la chambre basse une fois avec 1 ml de PBS. Recueillir le PBS dans le tube. </li><li> Centrifugeuse 5 minutes à 300 g, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 500 ul de PBS. </li><li> Par cytométrie en flux, compter le nombre de cellules ayant migré après 1 min de l&#39;acquisition. Dans le cas d&#39;une population cellulaire isolée, il n&#39;est pas nécessaire d&#39;ajouter un anticorps de surface. Vérifiez le nombre de cellules dans un complot point bidimensionnel considérant les disperse secondaires des cellules et le nombre d&#39;événements visualisés en 1 min, ce qui est le nombre à utiliser pour le calcul. </li><li> Calculer l&#39;indice de migration (MI) que: <img alt="L&#39;équation 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq1.jpg" /></li></ol> 4.2) test d&#39;adhérence. Ce test permet de mesurer la capacité d&#39;adhérence des cellules. Effectuer les essais en triple exemplaire. <ol><li> Pré-manteau 96 wells plaque (-fond plat) avec 50 ul / puits soit de 2% de BSA-PBS (comme arrière-plan) ou 1 ug d&#39;ICAM-1 dilué dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver la plaque deux fois avec du PBS et de bloquer les sites non spécifiques par addition de 2% de BSA-PBS (100 pl / puits) pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Dans les cellules attendant de remettre les à 5 x 10 6 / ml dans RPMI complet, les étiqueter avec tracker cellule 1 mM CMFDA-vert et incuber 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 1 x 10 6 cellules / puits dans les puits pré-enduits après avoir écarté la solution de blocage (étape 4.2.2) et incuber 1 h à 37 ° C. </li><li> Quantifier l&#39;adhérence à l&#39;aide d&#39;un lecteur ELISA (excitation filtre: 485 nM, filtre d&#39;émission: 535 nm). Effectuer une première mesure sur l&#39;apport total (INPUT). </li><li> Laver la plaque doucement avec 2% de BSA-PBS (200 pl / puits) 4 fois (x). Effectuer une lecture de la plaque après chaque étape de lavage (adhérence de x). </li><li> Après soustraction de fond pour chaque mesure, calculer ADHES spécifiquesion (ADHESION): <img alt="L&#39;équation 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq2.jpg" /></li></ol> 4.3) essai de polymérisation. Il s&#39;agit d&#39;un test colorimétrique qui quantifie la polymérisation de l&#39;actine F. Effectuer les essais en triple exemplaire. <ol><li> Remettre en suspension 1x10 ^ 6 cellules dans 100 pl d&#39;préchauffé RPMI complet et ajouter le stimulus spécifique (c.-à-α-IgM 20 pg / ml) pendant 10 min. </li><li> Arrêter la réaction avec 400 pl de 4% de paraformaldéhyde et de fixer les cellules pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver 3 fois avec du PBS (centrifugation à 300 xg pendant 5 min, 4 ° C). </li><li> Jeter le surnageant et perméabiliser les cellules avec du PBS-saponine 0,2% (200 ul) sur de la glace pendant 2 min. </li><li> Laver 3 fois avec du PBS-saponine 0,1% (centrifugeuse à 100 g pendant 5 min, 4 ° C), jeter le surnageant et remettre en suspension dans 100 ul de PBS-saponine 0,1%. </li><li> Colorer avec phalloïdine-AlexaFluor 488 (3 pg / ml) pendant 30 min à la salle tEMPÉRATURE dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver 3 fois avec du PBS-0.1% saponine. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 300 ul de PBS. </li><li> Quantifier la quantité de F-actine par cytométrie de flux, calcul de l&#39;intensité Floraison moyenne (MFI) de la phalloïdine. Analyser les données générées dans une parcelle de dimension unique afin de produire un histogramme basé sur l&#39;intensité de fluorescence, la valeur de MFI est indiqué dans le rapport de graphique. </li><li> Mesurer la polymérisation d&#39;actine (Δ F-actine) comme: <img alt="L&#39;équation 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq3.jpg" /></li></ol>

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S., Kohn, E. C., Azad, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ongoing+evolution+of+proteomics+in+malignancy.">The ongoing evolution of proteomics in malignancy.</a> Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).</li><li>Ummanni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clinically+relevant+protein+targets+in+prostate+cancer+with+2D-DIGE+coupled+mass+spectrometry+and+systems+biology+network+platform.">Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform.</a> PLoS One. 6, (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Le but de ce manuscrit est de décrire un protocole optimisé pour l&#39;identification de molécules impliquées dans la pathogenèse de la CLL, même si cette approche peut être étendue à d&#39;autres maladies et / ou d&#39;autres types d&#39;échantillons de 16 à 18. En comparant les profils protéomiques de 2 sous-ensembles de patients atteints de LLC, de bons vs mauvais pronostic 19, nous avons démontré que ils diffèrent dans l&#39;état de phosphorylation de HS1 et que s...

La leucémie lymphoïde chronique (LLC), la leucémie de l&#39;adulte le plus fréquent dans les pays occidentaux, découle de l&#39;accumulation de CD5 + lymphocytes B néoplasiques monoclonaux et est cliniquement très hétérogène. Il peut être présent sous une forme pré-leucémique, définie comme une lymphocytose monoclonal cellules B (MBL) 1,2,3. Dans d&#39;autres cas, la maladie peut apparaître soit avec une évolutivité clinique, qui peut rester stable pendant des années avant d&#39;avoir besoin de traitement, ou comme une maladie progressive avec chemorefractory mauvais pronostic malgré le traitement. Enfin, elle peut évoluer en un lymphome de haut grade fréquemment mortelle (syndrome RS de Richter) 2,3,4. Les patients sont généralement classés en deux sous-ensembles principaux: bon et mauvais pronostic, basé sur un ensemble de facteurs pronostiques qui fournit des informations complémentaires sur les prédicteurs de l&#39;issue de la maladie et de la survie. L&#39;hétérogénéité clinique reflète probablement l&#39;hétérogénéité biologique. Un certain nombre de facteurs génétiques, microenvironnement et CEIl a été démontré facteurs llular de concourir à la pathogenèse de la maladie mais pas de mécanismes fédérateurs ont été trouvés 5. Dans le détail, plusieurs études ont démontré que les différences dans l&#39;évolution clinique de la maladie peuvent s&#39;expliquer en partie par la présence (ou l&#39;absence) de certains marqueurs biologiques qui ont une valeur pronostique de 6,7,8. Ces données ont démontré qu&#39;une meilleure compréhension de la biologie de la maladie pourrait fournir des indices supplémentaires pour la prise en charge clinique de la pathologie, par l&#39;identification de deux marqueurs pronostiques et cibles thérapeutiques. L&#39;objectif du présent document est de montrer comment une combinaison de différentes techniques de protéomique peut être utilisé pour l&#39;identification de protéines impliquées dans la LLC apparition et la progression. Notre approche démontre qu&#39;il est possible de rejoindre protéomique ensemble de base et les données cliniques 5. Dans le présent flux de travail, les cellules leucémiques primaires chez certains patients(Bon vs mauvais pronostic) sont isolés et les lysats cellulaires sont ensuite utilisés pour obtenir des cartes protéomiques. 2DE permet la caractérisation du profil protéomique d&#39;une population de cellules, y compris des modifications post-traductionnelles, donnant ainsi des informations indirectes sur l&#39;activité biologique de chaque protéine. Des lysats de cellules entières sont réglées par un premier passage de dimension sur la base du point isoélectrique, suivie d&#39;une seconde dimension sur un gel de polyacrylamide qui permet de résoudre les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Analyse comparative des cartes protéomiques permet l&#39;identification de protéines différentiellement exprimés (à la fois en termes d&#39;abondance et de modifications post-traductionnelles) comme des taches sur le gel qui peuvent être coupés et analysés par spectrométrie de masse. Le rôle de chaque candidat peut alors être exploité par différents tests. Cette approche, limitée à CLL dans le manuscrit actuel, peut être facilement étendue à d&#39;autres maladies / échantillons, fournissant ainsi des informations sur la proteomic / les différences biologiques entre les deux groupes (c.-à-pathologiques vs normale, stimulés vs, de type sauvage non stimulées vs knockdown).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Acetonitril</td>
			<td style="width:160px;">MERCK</td>
			<td style="width:111px;">61830025001730&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">A6141-500G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">D9680-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Iodoacetamide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">I6125-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">223506-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:160px;">ROCHE</td>
			<td style="width:111px;">11418475001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">C2020-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">T6580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">ZipTip&#181;-C18</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td>ZTC18M096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>15064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBS</td>
			<td>EUROCLONE</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">FBS</td>
			<td>DOMINIQUE DUTSCHER</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Lymphoprep</td>
			<td>SENTINEL DIAGNOSTICS</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trypan Blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD19</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07770</td>
			<td>ECD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD5</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07754</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD3</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07746</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD14</td>
			<td>BD</td>
			<td>345785</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD16</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07767</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD56</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07789</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:160px;">GE-Healthcare</td>
			<td>11-0033-64&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Urea</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>U6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Tris-Hcl Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CHAPS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2020-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DTT</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D9163-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IPGstrips</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>17-1233-01&#160;</td>
			<td>Linear pH 4-7 18cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IPGbuffer</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>17-6000-86</td>
			<td>pH 4-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-3188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SDS</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acrilamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Agarosio</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Methanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acetic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Formalin</td>
			<td>BIO-OPTICAL</td>
			<td>05-K01009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>72049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Silver Nitrate</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>85228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageMaster 2D Platinum 5.0</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium Carbonate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A0250292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MALDI-TOF Voyager-DE STR</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Data Explorer software (version 3.2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">transwell chambre 6.6 mm diameter</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">RPMI</td>
			<td>EUROCLONE</td>
			<td>ECB2000L</td>
			<td>WITH L-GLUTAMINE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Gentamicin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SDF-1</td>
			<td>PREPROTECH</td>
			<td>300-28A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BSA</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">ICAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>720-IC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CMFDA</td>
			<td>Life Thechnology</td>
			<td>C7025</td>
			<td>Green</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IgM</td>
			<td>SOUTHERNBIOTECH</td>
			<td>2020-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Saponine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S-7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td>Life Thechnology</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa fluor 488</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from a 2de-gel spot to protein function: lesson learned from hs1 in chronic lymphocytic leukemia

L&#39;identification des molécules impliquées dans l&#39;initiation et la progression de la tumeur est essentielle à la compréhension de la biologie de la maladie et, en conséquence, pour la prise en charge clinique des patients. Dans le présent travail, nous allons décrire une approche protéomique optimisé pour l&#39;identification des molécules impliquées dans la progression de la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Dans le détail, les lysats de cellules leucémiques sont résolus par électrophorèse en 2 dimensions (2DE) et visualisées sous forme de &quot;taches&quot; sur les gels de 2DE. Analyse comparative des cartes protéomiques permet l&#39;identification de protéines exprimées de façon différentielle (en termes d&#39;abondance et de modifications post-traductionnelles) qui sont cueillies, isolé et identifié par spectrométrie de masse (MS). La fonction biologique des candidats identifiés peut être testée par des dosages différents (c.-à-migration, l&#39;adhésion et la polymérisation de l&#39;actine F), que nous avons optimisé pour les cellules leucémiques primaires.

Nous avons isolé les cellules leucémiques primaires B forment PB de patients atteints de LLC et nous avons analysé les cartes protéomiques. Les échantillons (n = 104) ont été regroupées en deux sous-ensembles principaux sur la base des caractéristiques cliniques de chaque patient (mauvais pronostic vs bon pronostic) et l&#39;analyse comparative des gels 2DE a été réalisée. L&#39;analyse a permis d&#39;identifier des points exprimés de manière différentielle entre les...

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From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

Nous décrivons ici un protocole que les couples deux techniques de protéomique, à savoir 2 dimensions électrophorèse (2DE) et la spectrométrie de masse (MS), d&#39;identifier exprimés de manière différentielle / protéines modifiées post-traductionnelles entre deux ou plusieurs groupes d&#39;échantillons primaires. Cette approche, avec des expériences fonctionnelles, permet l&#39;identification et la caractérisation de marqueurs / cibles thérapeutiques pronostiques.

D&#39;un spot 2DE-Gel de la fonction des protéines: Leçons apprises De HS1 dans la leucémie lymphoïde chronique

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

from-2de-gel-spot-to-protein-function-lesson-learned-from-hs1-chronic

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K vues.  IRCCS, San Raffaele Scientific Institute.  Nous décrivons ici un protocole que les couples deux techniques de protéomique, à savoir 2 dimensions électrophorèse (2DE) et la spectrométrie de masse (MS), d'identifier exprimés de manière différentielle / protéines modifiées post-traductionnelles entre deux ou plusieurs groupes d'échantillons primaires. Cette approche, avec des expériences fonctionnelles, permet l'identification et la caractérisation de marqueurs / cibles thérapeutiques pron...

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Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic processes that prepare the alimentary canal for digestion. Steady progress is being made towards understanding the early biochemical and molecular events underlying taste transduction (for a review, Breslin and Spector, 20081). However, progress to date has largely resulted from animal models. Yet, since marked differences in receptor specificity and receptor density vary among species, human taste transduction will only be understood by using human taste tissue. Here we describe a biopsy technique to collect human fungiform papillae, visible as rounded pink anterior structures, about 0.5 mm in diameter that contain taste buds. These biopsied papillae are used for several purposes including the isolation of viable taste bud cells, in situ hybridization, immunohistochemistry and, through techniques of molecular biology, the identification of taste-specific novel proteins.

Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Knowledge of molecular mechanisms underlying gustatory transduction has recently enjoyed significant advances, largely due to using animal models. However, the wide diversity in taste sensitivity and specificity among mammals warrants studies in human tissue. We describe a biopsy technique to collect living taste cells from the papillae on human tongue.

Technique pour collecter des fongiformes (goût) Papilles de la langue de l&#39;homme

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

Recherche

Médecine

Utilizing Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to Improve Language Function in Stroke Patients with Chronic Non-fluent Aphasia

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this experiment, we demonstrate the administration of low-frequency repetitive TMS (rTMS) to an optimal stimulation site in the right hemisphere in patients with chronic non-fluent aphasia. A battery of standardized language measures is administered in order to assess baseline performance. Patients are subsequently randomized to either receive real rTMS or initial sham stimulation. Patients in the real stimulation undergo a site-finding phase, comprised of a series of six rTMS sessions administered over five days; stimulation is delivered to a different site in the right frontal lobe during each of these sessions. Each site-finding session consists of 600 pulses of 1 Hz rTMS, preceded and followed by a picture-naming task. By comparing the degree of transient change in naming ability elicited by stimulation of candidate sites, we are able to locate the area of optimal response for each individual patient. We then administer rTMS to this site during the treatment phase. During treatment, patients undergo a total of ten days of stimulation over the span of two weeks; each session is comprised of 20 min of 1 Hz rTMS delivered at 90% resting motor threshold. Stimulation is paired with an fMRI-naming task on the first and last days of treatment. After the treatment phase is complete, the language battery obtained at baseline is repeated two and six months following stimulation in order to identify rTMS-induced changes in performance. The fMRI-naming task is also repeated two and six months following treatment. Patients who are randomized to the sham arm of the study undergo sham site-finding, sham treatment, fMRI-naming studies, and repeat language testing two months after completing sham treatment. Sham patients then cross over into the real stimulation arm, completing real site-finding, real treatment, fMRI, and two- and six-month post-stimulation language testing.

We explore the use of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to improve language abilities in patients with chronic stroke and non-fluent aphasia. After identifying a site in the right frontal gyrus for each patient that responds optimally to stimulation, we target this site during ten days of rTMS treatment.

Utilisant Stimulation magnétique transcrânienne répétitive pour améliorer la fonction de la langue chez les patients avec un AVC chronique aphasie non fluente

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Séché Blood Spot Collection de biomarqueurs de santé pour maximiser la participation à des études de la population

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

Réponses vessie distension évoqués viscéromotrice comme modèle pour douleur à la vessie chez la souris

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

L&#39;évaluation de la fonction vasculaire chez les patients atteints de maladie rénale chronique

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Méthode de isolé<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Lung perfusion dans un modèle rat: Leçons tirées élaboration d&#39;un programme EVLP Rat

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. Pulmonary Hypertension (PH) was induced in 3-week-old piglets by a progressive obstruction of the pulmonary vascular bed. A ligation of the left Pulmonary Artery (PA) was performed first through a mini-thoracotomy. Second, weekly embolizations of the right lower pulmonary lobe were done under fluoroscopic guidance with n-butyl-2-cyanoacrylate during 5 weeks. Mean Pulmonary Arterial Pressure (mPAP) measured by ritght heart catheterism, increased progressively, as well as Right Atrial pressure and Pulmonary Vascular Resistances (PVR) after 5 weeks compared to sham animals. Right Ventricular (RV) structural and functional remodeling were assessed by transthoracic echocardiography (RV diameters, RV wall thickness, RV systolic function). RV elastance and RV-pulmonary coupling were assessed by Pressure-Volume Loops (PVL) analysis with conductance method. Histologic study of the lung and the right ventricle were also performed. Molecular analyses on RV fresh tissues could be performed through repeated transcutaneous endomyocardial biopsies. Pulmonary microvascular disease in obstructed and unobstructed territories was studied from lung biopsies using molecular analyses and pathology. Furthermore, the reliability and the reproducibility was associated with a range of PH severity in animals. Most aspects of the human CTEPH disease were reproduced in this model, which allows new perspectives for the understanding of the underlying mechanisms (mitochondria, inflammation) and new therapeutic approaches (targeted, cellular or gene therapies) of the overloaded right ventricle but also pulmonary microvascular disease.

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) and Right Ventricular (RV) dysfunction were induced in piglets by progressive obstruction of the pulmonary arteries. Consequences were remarkably similar to those observed in CTEPH patients. This animal model would be a very useful tool for pathophysiology and therapeutic experiments on CTEPH and RV failure.

Chronique thromboembolique l&#39;hypertension artérielle pulmonaire et de l&#39;évaluation de la fonction ventriculaire droite dans la Porcinet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Modélisation chimiothérapie leucémie résistant<em&gt; In Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical activity and longer life expectancy. Despite its increasing prevalence, the underlying pathogenesis still remains unclear, and treatment is generally symptomatic. Recently, numerous therapeutic options, including growth factors, stem cells, and gene therapy, were investigated in hopes of enhancing the healing potency of the degenerative tendon. However, the majority of these research studies were conducted only on animal models or healthy human tenocytes. Despite some studies using pathological tenocytes, to the best of our knowledge there is currently no protocol describing how to obtain human degenerative tenocytes. The aim of this study is to describe a standard protocol for acquiring human degenerative tenocytes. Initially, the tendon tissue was harvested from a patient with lateral epicondylitis during surgery. Then biopsy samples were taken from the extensor carpi radialis brevis tendon corresponding to structural changes observed at the time of surgery. All of the harvested tendons appeared to be dull, gray, friable, and edematous, which made them visually distinct from the healthy ones. Tenocytes were cultured and used for experiments. Meanwhile, half of the harvested tissues were analyzed histologically, and it was shown that they shared the same key features of tendinopathy (angiofibroblastic dysplasia or hyperplasia). A secondary analysis by immunocytochemistry confirmed that the cultured cells were tenocytes with the majority of the cells having positive stains for mohawk and tenomodulin proteins. The qualities of the degenerative nature of tenocytes were then determined by comparing the cells with the healthy control using a proliferation assay or qRT-PCR. The degenerative tenocyte displayed a higher proliferation rate and similar gene expression patterns of tendinopathy that matched previous reports. Overall, this new protocol might provide a useful tool for future studies of tendinopathy.

In vitro use of degenerative tenocytes is essential when investigating the efficacy of novel treatment on tendinopathy. However, most research studies use only the animal model or a healthy tenocyte. We propose the following protocol to isolate human degenerative tenocytes during surgery.

Un protocole en vue d’acquérir la Tenocyte dégénérative de l’homme

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely correlated with a history of articular cartilage damage and ligament avulsion. Surgical animal models of OA of the knee play an important role in understanding the onset and progression of post-traumatic OA and aid in the development of novel therapies for this disease. However, non-surgical models have been recently considered to avoid traumatic inflammation that could affect the evaluation of the intervention. 
In this study, an intra-articular cartilage lesion rat model induced by in vivo cyclic compressive loading was developed, which allowed researchers to (1) determine the optimal magnitude, speed, and duration of load that could cause focal cartilage damage; (2) assess post-traumatic spatiotemporal pathological changes in chondrocyte vitality; and (3) evaluate the histological expression of destructive or protective molecules that are involved in the adaptation and repair mechanisms against joint compressive loads. This report describes the experimental protocol for this novel cartilage lesion in a rat model.

Here, we present the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee, generated by 60 cyclic compressions over 20 N, resulting in damage to the femoral condylar cartilage in rats.

Méthode non invasive pour générer le modèle de lésion cartilagineuse intra-articulaire induite par la charge cyclique du genou du rat

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...