Nous remercions George Giudice et Steven Eliason d’avoir fait don de fibroblastes cutanés humains et Ramesh Raghupathy pour l’aide avec l’algorithme de suivi des souches. Le soutien à ce travail a été fourni par une bourse d’aide aux diplômés du département de l’Éducation des États-Unis dans les domaines de besoin national (GAANN P200A120071).

1. Préparation du pochoir
Préparer un pochoir sur Parafilm pour mettre en page l’emplacement de chaque explant, en suivant la géométrie souhaitée(figures 1A et 1B). Espace chaque explant à environ 1-2 mm l’un de l’autre. Cette distance correspond à un espacement idéal pour générer l’alignement des fibres entre les explants. Fixez le pochoir sous la zone du verre de couverture où l’échantillon sera préparé avec du ruban adhésif.
2. Stérilisation
Nettoyez soigneusement tous les composants du bioréacteur à l’aide d’éthanol à 70% et stérilisez pendant 2-3 heures sous lumière UV avant l’expérimentation. Si un récipient alternatif est utilisé à la place d’un bioréacteur, des techniques de stérilisation appropriées doivent être utilisées. Voir l’étape 4.12 pour des commentaires sur l’utilisation d’une boîte de Pétri à fond de verre.
3. Préparation de gel de fibrine
Une fois que les composants du bioréacteur ont été stérilisés, jetez une fine couche de gel de fibrine sur la surface du verre de couverture. Les détails pour la préparation de solutions de stock de fibrinogène et de thrombine pour la fabrication de gels de fibrine de 6,6 mg /ml sont décrits dans Sander et al. 13 Un protocole similaire par Ye et al. 19 pour la fabrication de gels de fibrine de 3,3 mg / ml peuvent également être consultés sur le site Web de JoVE.
<ol><li>Préparer une solution de microbilles fluorescentes dans du DMEM à une concentration de 10 millions de billes/ml. Les perles seront utilisées pour aider à suivre les déplacements de gel. Pour atteindre cette concentration, combiner 0,017 ml de solution mère de microbilles et 0,149 ml de DMEM dans un tube de microcentrifugation.</li>
	<li>Soniquez cette suspension pendant 10 min pour disperser les perles et homogénéiser la solution.</li>
	<li>Solution de fibrine — Dans un tube en C de 15 ml, mélanger 0,22 ml de solution mère de fibrinogène avec 0,44 ml de tampon HEPES de 20 mM. Ajouter les 0,1667 ml de DMEM avec les microbilles créées à l’étape 3.1.</li>
	<li>Solution de thrombine — Dans un tube c séparé de 15 ml, mélanger ensemble 0,0328 ml de solution mère de thrombine, 0,131 ml de tampon HEPES de 20 mM et 0,00246 ml de 2 MCaCl2.</li>
	<li>Mélanger soigneusement la solution de thrombine (étape 3.4) avec la solution de fibrinogène (étape 3.3) en piper de haut en bas 5-10x jusqu’à ce que la solution soit uniformément distribuée. Évitez d’introduire des bulles autant que possible. Pour réduire la quantité de bulles produites, veillez à ne pas décharger complètement la pipette pendant le mélange.</li>
	<li>L’ajout de thrombine entraînera le gel rapide de la solution (~ 30 sec). Pipeter la solution mélangée sur le verre de couverture dès que possible. Laisser le gel polymériser à TA.</li>
	<li>Scellez le bioréacteur, insérez les blocs chauffants et connectez les thermocouples au régulateur de température. Incuber le gel à 37 °C pendant 15-30 min.</li>
</ol>4. Préparation de l’explantation cellulaire
<ol><li>Retirer le milieu du ballon T-75 contenant les cellules fibroblastiques dermiques humaines.</li>
	<li>Rincez soigneusement la surface avec environ 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les protéines sériques. Ajouter 1 ml de trypsine-EDTA et incuber pendant 3 min, ou jusqu’à ce que les cellules se soient levées.</li>
	<li>Une fois les cellules levées, faites tourner la suspension dans une centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et ressusciter le culot dans un volume de DMEM qui permettra une concentration finale de 20 millions de cellules/ml.</li>
	<li>Pendant que les cellules tournent dans la centrifugeuse, déconnectez le bioréacteur des blocs chauffants et des thermocouples. Transférer le bioréacteur dans une armoire de biosécurité et retirer soigneusement le couvercle en suivant les techniques asceptiques.</li>
	<li>Créez des explants en pipeté 0,3 μl de la suspension cellulaire sur le gel de fibrine polymérisé, en suivant le motif sur le pochoir. Chaque explant doit contenir environ 6 000 cellules. Assurez-vous que des pointes de micropipette à faible volume sont utilisées (0,1 à 10 μl).</li>
	<li>Laisser les cellules se déposer et se fixer à la matrice de fibrine pendant 1 h à 37 °C.</li>
	<li>Avec le bioréacteur encore ouvert, ajoutez approximativement 5 ml de DMEM complété avec 10% de sérum bovin foetal (FBS), 1% de pénicilline-streptomycine, 0,1% d’amphotéricine B, et 10 mg/ml d’aprotinin directement dans la chambre de bioréacteur. Le DMEM est tamponné au bicarbonate et nécessite 5% de CO2 pour maintenir un pH neutre. Étant donné que le bioréacteur n’est pas alimenté enCO2,conditionner le milieu dans un incubateur avec 5% deCO2 pendant 2-3 heures avant utilisation. L’aprotinine est un inhibiteur de la sérine protéase qui est largement utilisé pour réduire le taux de dégradation de la fibrine20.</li>
	<li>Refermez le bioréacteur. Utilisez une seringue pour administrer 5 ml supplémentaires de milieu conditionné auCO2 par l’intermédiaire de l’ajustement barbelé sur l’orifice d’entrée. Distribuez le milieu lentement et assurez-vous que tout le volume de la chambre du bioréacteur est rempli. Retirez soigneusement les bulles qui se forment dans le bioréacteur.</li>
	<li>Fournir un milieu frais conditionné à 5 % de CO2 au bioréacteur tout au long de l’expérience afin de maintenir le pH, de fournir des nutriments et d’éliminer les déchets. Installer une pompe à seringue avec une seringue de 10 ml ou 30 ml remplie de milieu conditionné à 5% deCO2. Connectez la seringue directement à l’orifice d’entrée sur le couvercle du bioréacteur avec un tube stérile équipé de Luer-lock. Retirez le raccord mâle et fixez le tube au raccord barbelé du bioréacteur (voir la figure 1C).</li>
	<li>Réglez le taux de perfusion à 0,01 ml/min. Connectez des morceaux de tubes modifiés aux deux orifices de sortie et placez les extrémités dans un bécher de 100 ml pour collecter les déchets.</li>
	<li>Utilisez un cric de laboratoire pour régler les hauteurs des alimentations d’entrée et de sortie afin qu’une différence de pression ne se développe pas dans le bioréacteur (consulter la figure 1D pour référence).</li>
	<li>Si un bioréacteur n’est pas disponible, préparez les échantillons dans des boîtes de Petri à fond de verre de 35 mm avec des plateaux en verre. Utilisez-en un avec une taille de lamelle de couverture optimisée pour l’ensemble spécifique d’objectifs à utiliser. Les échantillons préparés dans des boîtes de Pétri doivent être conservés dans un incubateur à 37 °C et 5 % deCO2. Remarque : Le polystyrène dépolarise la lumière et interfère avec l’imagerie DIC, de sorte que des plateaux en verre doivent être utilisés si l’imagerie DIC est effectuée. Le contraste de phase est une modalité alternative appropriée d’imagerie. Le transfert de plats entre l’incubateur et le microscope rendra l’enregistrement des images difficile. Si les images ne sont pas correctement enregistrées, la souche calculée à la section 6 ne sera pas exacte.</li>
</ol>5. Imagerie time-lapse
<ol><li>Une fois l’échantillon préparé, refermer le bioréacteur, reconnecter les blocs chauffants et les thermocouples et régler la température du bioréacteur à 37 °C.</li>
	<li>Réglez le bioréacteur sur l’étage motorisé monté au microscope. Placez l’objectif DIC 20X sous le view-port. Un objectif de grossissement inférieur est acceptable, en particulier si un étage motorisé de précision n’est pas disponible. Assurez-vous que le polariseur, l’analyseur et le prisme sont tous en place. Alternativement, les échantillons peuvent également être es imageés à l’aide du contraste de phase.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel d’imagerie.</li>
	<li>Concentrez l’objectif sur la zone entre les trois explants.</li>
	<li>Enregistrez les coordonnées (x, y et z) de cet emplacement dans le logiciel d’imagerie.</li>
	<li>Afin d’imager toute la zone entre et autour des explants, sélectionnez l’option d’acquérir une grande image et spécifiez la taille de la zone. Cela permettra l’acquisition de plusieurs images autour de la zone spécifiée et créera une image en mosaïque qui représente une plus grande région de l’exemple.</li>
	<li>Réglez le temps d’exposition et l’intensité lumineuse sur les valeurs les plus basses possibles pour éviter la mort cellulaire causée par la phototoxicité, tout en fournissant une résolution suffisante pour distinguer les cellules, les microbilles et les fibres de fibrine.</li>
</ol>6. Suivi des souches
Pour plus de détails et d’instructions sur le logiciel de suivi des souches(figure 2),voir Raghupathy et coll. 21 L’algorithme est un code MATLAB personnalisé qui peut être téléchargé à partir de <a href="http://www.license.umn.edu/default.aspx">http://www.license.umn.edu/default.aspx</a>. Notez que les images DIC ont souvent suffisamment de texture pour le suivi des déformations. Les microbilles sont incluses pour servir de contrôle sur les champs de déformation calculés. Si le suivi des souches est effectué, il est essentiel que les images obtenues soient prises exactement au même endroit afin que les images soient enregistrées. Les images non enregistrées promemeront de fausses souches.

<ol>
	<li>Grinnell, F., Petroll WM, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).</li><li>Sander, E. A., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , (2008).</li><li>Pedersen JA, ., Swartz MA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+in+the+third+dimension.">Mechanobiology in the third dimension.</a> Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).</li><li>Guidry, C., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+hydrated+collagen+gel+reorganization+by+human+skin+fibroblasts.">Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).</li><li>Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+human+primary+fibroblasts+undergo+apoptosis+in+three-dimensional+contractile+collagen+gels.">Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels.</a> J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).</li><li>Rosenfeldt, H., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+quiescence+and+the+disruption+of+ERK+signaling+in+mechanically+unloaded+collagen+matrices.">Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices.</a> J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).</li><li>Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+fibroblasts+in+contracted+collagen+gels:+Effects+on+cell+growth+and+biosynthetic+activity.">Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity.</a> J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).</li><li>Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+traction+as+a+mechanism+for+collagen+morphogenesis.">Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis.</a> Nature. 290, 249-251 (1981).</li><li>Stopak, D., Harris AK, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connective+tissue+morphogenesis+by+fibroblast+traction:+I.+tissue+culture+observations.">Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations.</a> Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).</li><li>Sawhney, R. K., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+local+movements+of+collagen+fibers+by+fibroblasts+drive+the+rapid+global+self-organization+of+collagen+gels.">Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels.</a> J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).</li><li>Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+fiber+alignment+pattern+alters+extracellular+matrix+synthesis+in+fibroblast-populated+fibrin+gel+cruciforms+and+correlates+with+predicted+tension.">Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension.</a> Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).</li><li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. 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Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).</li><li>Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+as+an+alternative+biopolymer+to+type+I+collagen+for+the+fabrication+of+a+media+equivalent.">Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).</li><li>Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+an+optically+accessible,+low-volume,+mechanobioreactor+for+long-term+study+of+living+constructs.">Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs.</a> Tissue Eng. 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Part A. 14 (1), 83-95 (2008).</li><li>Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myofibroblast+in+wound+healing+and+fibrocontractive+diseases.">The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases.</a> J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).</li><li>PaszeK, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nested+collagen+matrices:+A+new+model+to+study+migration+of+human+fibroblast+populations+in+three+dimensions.">Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions.</a> Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).</li><li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices.">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li><li>Wakatsuki, T., Kolodney MS, ., Zahalak GI, ., Elson EL, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+studied+by+a+reconstituted+model+tissue.">Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue.</a> Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).</li><li>De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast-mediated+fiber+realignment+in+fibrin+gels.">Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels.</a> , (2013).</li><li>Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+mechanical+simulations+of+cell+compacted+collagen+gels.">Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels.</a> J. Biomech. Eng. 135, (2013).</li></ol>

Aucun conflit d’intérêts déclaré.

Ce protocole a été développé dans le but d’observer et de quantifier la mécanique impliquée dans le remodelage de l’ECM à médiation cellulaire. De tels processus sous-tendent un certain nombre de phénomènes biologiques et ont des implications importantes pour l’ingénierie des tissus2,22, la réduction de la cicatrice1,23, et la compréhension du remodelage tissulaire pathologique12,24. L’utilisation de la microscopie DIC time-lapse permet de résoudre et de quantifier l...

Un outil important pour étudier les interactions cellule-matrice est le gel de collagène peuplé de cellules1,2. Le gel fournit un environnement 3D plus proche du caractère in vivo du tissu et mieux adapté à la compréhension du comportement cellulaire que ne le proposent les cultures 2D traditionnelles3. Les premières études dans lesquelles les fibroblastes ont été distribués de manière homogène dans un gel de collagène ont révélé que les cellules consolident rapidement les fibres de collagène et compactent le gel4,5. Les fibroblastes contractiles en gels flottants passent alors à un état de repos peu après que le gel a complètement atteint le compactage1,6,7. Les fibroblastes en gels qui sont contraints aux limites restent dans un état actif et synthétique8 et ils génèrent un alignement des fibres d’une manière dépendante de la géométrie du gel et des contraintes externes5,9. Les différences dans l’activité cellulaire semblent être le résultat de la tension interne (ou de l’absence de tension interne) qui se développe à mesure que les cellules exercent des forces de traction via des intégrines sur les fibres de collagène dans le gel.
Une variante de cette technique consiste à placer des explants de fibroblastes(c’est-à-dire des amas de cellules) à une distance l’un de l’autre au sein d’un gel de collagène et à observer les interactions cellule-matrice et le développement progressif de l’alignement des fibres entre les explants (parfois appelés sangles en forme de ligament)10-12. Le principal avantage du système explant est qu’il permet d’organiser les cellules en motifs géométriques simples, ce qui facilite la visualisation et le sondage des mécanismes sous-jacents au réalignement cellulaire des fibres. Ces modèles d’alignement — qui dépendent principalement de l’interaction entre les forces de traction cellulaire, la distribution spatiale cellulaire, la géométrie du gel et les contraintes mécaniques sur le gel — sont importants à comprendre car ils jouent un rôle central dans l’organisation tissulaire globale, la fonction mécanique et l’environnement mécanique local13.
Dans le domaine de l’ingénierie tissulaire, une stratégie pour produire des tissus mécaniquement fonctionnels et modifiés consiste à contrôler le modèle d’alignement des fibres qui se développe à partir du compactage cellulaire afin que le tissu modifié possède un alignement des fibres qui imite celui du tissu natif14,15. Un tel alignement est considéré nécessaire pour que les tissus modifiés reproduisent le comportement mécanique complexe des tissus natifs. Une modification de cette stratégie consiste à remplacer le gel de collagène par un gel de fibrine16. Le gel de fibrine développe un modèle d’alignement similaire à celui d’un gel de collagène pendant le compactage. Au fil du temps la fibrine est dégradée et remplacée par l’ECM cellule-synthétisé qui suit le modèle initial d’alignement de fibre de fibrine. La construction d’ingénierie résultante a considérablement amélioré les propriétés mécaniques par rapport aux constructions dérivées de gel de collagène17.
Le processus d’alignement et les événements de remodelage ultérieurs dans les gels de fibrine se déroulent d’une manière compliquée et mal comprise. Pour mieux caractériser ces interactions et leur effet sur le comportement cellulaire et le remodelage ECM, nous avons développé une procédure basée sur la méthode explant. Dans cette méthode, les explants de fibroblastes sont positionnés sur un gel de fibrine dans différents motifs géométriques. Les gels sont maintenus dans un bioréacteur18contrôlé par l’environnement et monté au microscope, et le processus de compactage et de réalignement des fibres est surveillé avec une microscopie à contraste d’interférence différentiel (DIC) en accéléré. Les champs de déplacement sont quantifiés à l’avec des algorithmes personnalisés. Les données obtenues à partir de ces expériences ont des implications variées pour un certain nombre de processus, y compris l’optimisation des stratégies d’ingénierie tissulaire, l’amélioration de la cicatrisation des plaies et le traitement du remodelage pathologique des tissus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Invitrogen</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lonza</td>
			<td>DE14-701F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular Probes</td>
			<td>F8858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GIBCO</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GIBCO</td>
			<td>11430-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisher-Scientific</td>
			<td>SS264-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Biotense Bioreactor</td>
			<td style="width:85px;">ADMET</td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti-Eclipe Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"># 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"># 0 35 mm Glass Top Petri Dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GTOP-0-20-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30600-65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing and quantifying fibroblast-mediated fibrin gel compaction

Les cellules incorporées dans les gels de collagène et de fibrine se fixent et exercent des forces de traction sur les fibres du gel. Ces forces peuvent conduire à une réorganisation locale et mondiale et à un réalignement de la microstructure du gel. Ce processus se déroule d’une manière complexe qui dépend en partie de l’interaction entre l’emplacement des cellules, la géométrie du gel et les contraintes mécaniques sur le gel. Pour mieux comprendre comment ces variables produisent des modèles globaux d’alignement des fibres, nous utilisons la microscopie de contraste différentiel d’interférence (DIC) time-lapse couplée à un bioréacteur contrôlé par l’environnement pour observer le processus de compactage entre les explants géométriquement espacés (amas de fibroblastes). Les images sont ensuite analysées avec un algorithme de traitement d’image personnalisé pour obtenir des cartes de la souche. Les informations obtenues à partir de cette technique peuvent être utilisées pour sonder la mécanobiologie de diverses interactions cellule-matrice, ce qui a des implications importantes pour comprendre les processus de cicatrisation des plaies, le développement de maladies et les applications d’ingénierie tissulaire.

Le remodelage tissulaire est un processus complexe qui est entraîné en partie par des interactions physiques réciproques entre les cellules et la matrice environnante. Les cellules réorganisent les fibres environnantes et génèrent une tension dans le réseau de fibres. L’alignement des fibres et de l’environnement mécanique contrôle à son tour le comportement des cellules, de sorte que les cellules et la matrice se réorganisent globalement pour produire des tissus remodelés. Dans cette expérience, les cel...

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Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Des techniques de microscopie et de traitement d’image de time-lapse ont été employées pour observer et analyser le compactage fibroblaste-négocié de gel et le réalignement de fibre de fibrine dans un bioréacteur commandé par l’environnement sur une période de 48 heures.

Observation et quantification du compactage du gel de fibrine médié par les fibroblastes

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

5.9K vues.  University of Iowa. Des techniques de microscopie et de traitement d’image de time-lapse ont été employées pour observer et analyser le compactage fibroblaste-négocié de gel et le réalignement de fibre de fibrine dans un bioréacteur commandé par l’environnement sur une période de 48 heures.

Vidéo: Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Recherche

Bio-ingénierie

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Fabrication de micro-tissus en utilisant des modules de gel de collagène cellules contenant

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

L&#39;encapsulation des cardiomyocytes dans un hydrogel de fibrine pour l&#39;ingénierie du tissu cardiaque

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Préparation de la 3D pour les applications de fibrine Échafaudages CULTURE DE CELLULES SOUCHES

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

Ingénierie à base de fibrine constructions de tissu de myofibroblastes et application des contraintes et de déformation à Provoquer Organisation cellulaire et collagène (Re)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral surgery. Unlike platelet rich plasma (PRP) that is a gel or a suspension, Leukocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) is a solid 3D fibrin membrane generated chair-side from whole blood containing no anti-coagulant. The membrane has a dense three dimensional fibrin matrix with enriched platelets and abundant growth factors. L-PRF is a popular adjunct in surgeries because of its superior handling characteristics as well as its suturability to the wound bed. The goal of the study is to demonstrate generation as well as provide detailed characterization of relevant properties of L-PRF that underlie its clinical success.

Leucocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) represents an FDA cleared preparation of autologous platelet concentrates that possesses unique fibrin architecture, enriched platelets and abundant growth factors. Here, we present a protocol for chair-side generation of L-PRF as well as evaluate its mechanical properties including uniaxial testing and suture retention strength testing.

Caractérisation de leuco-plaquettaire Rich fibrine, un roman biomatériaux

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (&gt; 4 &#181;m) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (&gt;4 &#181;m) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (&gt;100 &#181;m).

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Formant géants de taille polymersomes Utilisation Réhydratation Gel-assisté

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Une nouvelle technique de production et d&#39;observation de chimiluminescence en milieu biologique

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

A microfluidique débit Chambre Modèle pour Platelet Transfusion et Hémostase mesures Platelet Déposition et la formation de fibrine en temps réel

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Gel-seq : PROCEDE de Preparation de bibliothèque simultanée de séquençage de l’ADN et l’ARN à l’aide de Matrices d’Hydrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...