Nous remercions le Centre de bio-informatique et génomique fonctionnelle (CBFG) à l&#39;Université de Miami pour le support technique. Ce travail a été soutenu par l&#39;Université de Miami subvention de démarrage (YT) et la National Science Foundation (YT: IOS 0950964).

<ol>
	<li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo.">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li><li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium.">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li><li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum.">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li><li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera).">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera)+for+analyzing+adult+development.">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li><li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium.">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10 (2008).</li><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi.">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431 (2012).</li><li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles.">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li><li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Drosophila.">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li><li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects.">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., &amp; development. 1, 11-15 (1999).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection.">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li><li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle.">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li><li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain.">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5 (2013).</li><li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference.">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, 2456-2459 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li><li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest,+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum,+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps.">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+(II)+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless.">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

<html> Il ya un certain nombre de questions importantes qui doivent être pris en compte pour garantir le succès de l&#39;ARNi, dont la longueur et la concentration des molécules d&#39;ARN double brin, la concurrence entre les différentes molécules d&#39;ARN double brin (lors de la tentative multiples abattre), et la possibilité de hors-cible Effets (OTE). ARNdb Longueur La longueur des molécules d&#39;ARNdb affecte l&#39;efficacité de la réponse systémique ARNi, avec un ARN double brin plus long étant plus efficace pour déclencher l&#39;ARNi 7,14,15 (bien que la limite plus d&#39;ARNdb est actuellement inconnue). La longueur d&#39;ARNdb a besoin d&#39;être plus longue que 50 pb pour induire l&#39;ARNi efficace en T. castaneum 7. ARNdb de 150 pb et 500 pb semble être idéale pour des expériences d&#39;ARNi. Bien que plus des molécules d&#39;ARN double brin peuvent également être utilisés, ils auront une plus grande chance de l&#39;OTE et l&#39;étape de gène clonage va devenir de plus en plus difficile. ARN double brin Concentration ve_content &quot;&gt; Différents degrés de knock-down de gènes peuvent être obtenues en fonction de la concentration de l&#39;ARN double brin. 1 ug / apparaît ul à une concentration de départ raisonnable, ce qui produit souvent un phénotype quasi-nulle (peut varier selon le gène (s) d&#39;intérêt ). ARNi peut être effectuée avec une concentration plus élevée (par exemple, 7-8 ug / ul), pour obtenir un fort phénotype ARNi. ARNi avec une dilution en série de l&#39;ARN double brin peut parfois être intéressant de réaliser une série de phénotypes hypomorphic de données supplémentaires (Tomoyasu et al., 2009 8, et Borràs-Castells, données inédites). ARNi concurrence Knockdown de gènes multiples peut être réalisé en T. castaneum en injectant plusieurs molécules d&#39;ARN double brin différents simultanément. Cependant, il est également connu que la présence de plusieurs molécules d&#39;ARNdb différents présents au sein de l&#39;organisme se traduit souvent par la compétition entre les ARN double brin pour l&#39;accès aux composants d&#39;ARNi <sjusqu&#39;à&gt; 7,14. Il est important d&#39;utiliser la même longueur et la même concentration pour tous les ARN double brin lors d&#39;une tentative knockdown de gènes multiples pour éviter un ARN double brin hors-compétition les autres (bien que d&#39;autres ajustements de la longueur ARN double brin et la concentration peuvent être nécessaires lorsque les niveaux d&#39;expression varient beaucoup les gènes cibles). Nous, ainsi que d&#39;autres, avons effectué avec succès knockdown double et triple (par exemple, Tomoyasu et al., 2005 16, Tomoyasu et al., 2009 17, et Yang et al., 2009 18). Bien que possible, quadruple ARNi (ou plus) pourrait être difficile, car il risquerait vraisemblablement de causer une réduction significative de l&#39;efficacité ARNi pour les quatre gènes cibles. Off-ciblage OTE est une préoccupation inhérente aux approches basées sur l&#39;ARNi. Une façon de minimiser OTE est d&#39;identifier les régions dans le gène cible qui partagent des séquences similaires avec d&#39;autres gènes et d&#39;éviter ces régions lors de la conception d&#39;ARNdb. Une analyse BLAST simple contre le T. castaneum prédit ensemble des gènes peut identifier ces régions. Plusieurs outils en ligne permettent également l&#39;évaluation du potentiel OTE (par exemple, E-ARNi 19). Exécution de l&#39;ARNi pour deux régions non chevauchantes du gène cible est un moyen facile et efficace pour éliminer la possibilité que les phénotypes observés sont causés par l&#39;OTE. La possibilité de l&#39;OTE est minimisé si l&#39;ARNi pour deux régions ne se chevauchent pas produire les mêmes phénotypes (à moins que les deux régions ne se chevauchent pas partager une séquence similaire). L&#39;évaluation de gène démontable par un moyen autre que les analyses phénotypique est souvent essentiel à des données liées à l&#39;ARNi effectivement présents. Deux principales façons d&#39;évaluer knockdown de gènes sont qRT-PCR et l&#39;analyse Western blot. qRT-PCR est un moyen commode pour mesurer le niveau de l&#39;ARNm cible, et a été utilisé dans de nombreuses études liées ARNi, y compris ceux de T. castaneum (voir Miller et al. 2012 7 par exemple). Howeveuh, il faut être prudent, comme nous l&#39;avons vu récemment des cas où le niveau d&#39;ARNm cible est régulée à la hausse par l&#39;ARNi (si le produit de protéine est régulée à la baisse) (Borràs-Castells données non publiées). Il est actuellement inconnu si cet ARNm ARNi induit une régulation peut être généralisée ou unique de certains gènes. L&#39;analyse Western blot est une autre façon de confirmer knockdown de gènes. Cette méthode est très fiable car il mesure la quantité du produit de la protéine finale. L&#39;exigence d&#39;un anticorps spécifique contre la protéine produite par le gène cible est un inconvénient de cette approche. Utilisation de plusieurs mesures indépendantes en plus à l&#39;analyse phénotypique augmentera la confiance des données phénotypiques obtenues par l&#39;analyse basée sur l&#39;ARNi. Depuis sa création en T. castaneum, l&#39;ARNi a principalement été utilisée pour étudier la fonction des gènes dans le développement et la formation de structures. Ces T. études sur le développement castaneum ont très bien réussi à caracterizing fonctions évolutives conservées et ont divergé de gènes (revue dans Denell 2008 1 et Klingler 2004 2). Études basées ARNi Cependant, dans T. castaneum ne sont pas limités à la biologie du développement. Par exemple, l&#39;ARNi peut être utilisée pour étudier la fonction des gènes dans un large éventail de réponses physiologiques et comportementales, y compris la tolérance au stress, la prédation, l&#39;agression, le choix du partenaire, les modèles d&#39;activité, et les mécanismes de défense. Une difficulté d&#39;appliquer l&#39;ARNi à ces contextes est la probabilité d&#39;effets pléiotropiques. Souvent, les gènes d&#39;intérêt ont une variété de fonctions à travers le T. Cycle de vie du castaneum, permettant ainsi la suppression des gènes sans effets phénotypiques involontaires difficiles. Cependant, la possibilité d&#39;effectuer facilement ARNi à des stades différents peut souvent être une stratégie efficace pour éviter ces effets pléiotropiques. Par exemple, effectuer l&#39;ARNi chez les adultes au lieu de larves ou de pupes pourrait nous permettre de contourner UNINtendance létalité provoquée par knockdown de gènes au cours du développement précoce. La flexibilité de la réponse d&#39;ARNi dans T. castaneum ce qui rendait ce modèle un choix attrayant pour adapter l&#39;ARNi à des expériences de la fonction des gènes dans les réponses physiologiques et comportementales. Le T. système de castaneum est également idéal pour une utilisation dans un laboratoire d&#39;enseignement. T. castaneum peut être facilement mis en culture sur un mélange de farine / levure à température ambiante (25 ° C) sans repiquage fréquentes, et des techniques d&#39;ARNi dans T. castaneum sont suffisamment simples pour être adapté à un laboratoire avec des jeunes, des scientifiques d&#39;apprentissage. Comme ARNi devient une technique essentielle dans une variété de domaines de la biologie, il est essentiel que les élèves sont exposés à cette technique. La nature straight-forward de la technique ARNi larvaire dans T. castaneum encourage également davantage d&#39;élèves à être impliqués dans la recherche, ce qui rend T. castaneum un candidat de choix pour une salle de classe orientée système génétique. &lt;/ P&gt;

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>.

Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Le coléoptère rouge de la farine, Tribolium castaneum, gagne en popularité dans divers domaines de la biologie en partie à cause de la facilité d&#39;effectuer l&#39;interférence ARN (ARNi) 1-3. Techniques de gènes knockdown base ARNi permettent aux scientifiques d&#39;effectuer perte de fonction analyse sans utiliser des méthodes génétiques complexes. T. castaneum montrer une réponse de RNAi systémique robuste, ce qui permet d&#39;effectuer l&#39;ARNi à tout moment par simple injection d&#39;ARN double brin (ARNdb) dans une cavité du corps de l&#39;insecte 4-6. Knockdown simultanée de plusieurs gènes est également possible en T. castaneum par injection de deux ou plusieurs molécules d&#39;ARN double brin différents dans le même temps 7,8. En outre, une série de phénotypes hypomorphic peut être généré par réduction de la concentration d&#39;ARNdb injecté 8. Ces caractéristiques font de techniques de génétique inverse à base ARNi des alternatives intéressantes à la génétique à terme traditionnels en T. castaneum. Comme la quasi-tout T. castaneum tissus sont sensibles à des molécules d&#39;ARNdb extracellulaires 9, cette technique permet aux chercheurs d&#39;étudier un grand nombre de tissus dans divers contextes. En outre, bien que ce rapport met l&#39;accent sur ​​l&#39;exécution de l&#39;ARNi dans T. castaneum, de nombreuses procédures décrites ici sont applicables à d&#39;autres insectes. Par conséquent, ce protocole est utile pour ceux qui souhaitent effectuer perte de fonction des analyses dans leur contexte d&#39;intérêt en T. castaneum, ainsi que pour les chercheurs qui souhaitent appliquer une technique basée sur l&#39;ARNi à d&#39;autres insectes. L&#39;injection de l&#39;ARN double brin dans les larves permet l&#39;analyse fonctionnelle à des stades différents de la vie de scarabée, dont la larve, et met en scène des adultes 4,5,10. Nous avons précédemment rapporté notre protocole de RNAi larvaire global, y compris les procédures de biologie moléculaire 11. Dans le présent rapport, nous nous concentrons sur la description des procédures d&#39;injection d&#39;ARN double brin, qui sont les mieux expliquées avec des aides visuelles. Nous fournissonsprocédures détaillées étape par étape injection ainsi que des exemples de bonnes et de mauvaises injection. Ce protocole visuelle complète notre protocole précédent, et lorsqu&#39;ils sont combinés, ils fournissent une vue plus complète des procédures ARNi larvaires dans T. castaneum. En outre, nous discutons de paramètres pour les molécules d&#39;ARN double brin qui pourraient affecter le succès de l&#39;ARNi, l&#39;application de tests basés sur l&#39;ARNi pour la recherche en physiologie, ainsi que l&#39;applicabilité du protocole d&#39;ARNi larvaire dans un laboratoire d&#39;enseignement.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

Le coléoptère rouge de la farine, Tribolium castaneum, propose un répertoire d&#39;outils expérimentaux pour les études génétiques et de développement, y compris une séquence entièrement annotée du génome, transgénèse à base de transposons, et l&#39;interférence ARN efficace (ARNi). Parmi ces avantages, les techniques de gènes knockdown basés sur l&#39;ARNi sont au cœur de la recherche Tribolium. T. castaneum montrer une réponse de RNAi systémique robuste, ce qui permet d&#39;effectuer l&#39;ARNi à n&#39;importe quelle étape de la vie par simple injection de l&#39;ARN double brin (ARNdb) dans une cavité du corps de l&#39;insecte. Dans ce rapport, nous présentons un aperçu de notre technique ARNi larvaire dans T. castaneum. Le protocole comprend: (i) l&#39;isolement de la phase appropriée de T. larves de castaneum pour injection, (ii) la préparation pour le réglage de l&#39;injection, et (iii) l&#39;injection de l&#39;ARN double brin. Larvaire ARNi est une technique simple, mais puissant qui nous permet d&#39;accéder rapidement à phenotyp perte de fonctiones, dont plusieurs phénotypes knockdown de gènes ainsi que d&#39;une série de phénotypes hypomorphic. Comme pratiquement tous les T. tissus castaneum sont sensibles à extracellulaire ARN double brin, la technique ARNi larvaire permet aux chercheurs d&#39;étudier une grande variété de tissus dans divers contextes, y compris la base génétique des réponses organismales à l&#39;environnement extérieur. En outre, la simplicité de cette technique stimule plus la participation des étudiants à la recherche, ce qui rend T. castaneum un système génétique idéal pour une utilisation dans une salle de classe.

Une des étapes clés pour l&#39;injection réussie est de faire une bonne aiguille. Comme décrit dans l&#39;étape 6, la pointe de l&#39;aiguille doit être cassé avant l&#39;injection de T. castaneum. Des exemples de bonnes et de mauvaises aiguilles sont présentés dans la figure 1. Une bonne aiguille a une pointe acérée et rigide, avec un diamètre d&#39;ouverture d&#39;environ 0,05 mm (figure 1B). La figure 2 présente une injection réussie (Figures 2A et 2B), ainsi que plusieurs cas d&#39;injections infructueuses (figures 2C-2F). Avec une aiguille d&#39;injection de taille appropriée, la pointe de l&#39;aiguille pénètre dans la cuticule des larves avec une résistance minimale (figure 2A), et la solution d&#39;ARNdb (vert) s&#39;écoule dans les larves sans fuite (figure 2B). Ne pas sur injection, car il provoquer un débordement de la solution ARNdb même avec une aiguille d&#39;injection de taille appropriée (Figure2C). Si la pointe de l&#39;aiguille est trop mince, la pointe de l&#39;aiguille échoue souvent à pénétrer la cuticule et coudes larvaire, ce qui rend difficile l&#39;injection (figure 2D). Si cela se produit, tailler la pointe de l&#39;aiguille est parfois utile. Les aiguilles sont souvent encore utilisables, mais avec quelques difficultés à pénétrer la cuticule larvaire (figure 2E). Cependant, une grande quantité de la solution ARNdb est facilement poussée hors de l&#39;aiguille même avec une légère pression sur la seringue d&#39;injection, ce qui entraîne souvent un trop-plein de la solution d&#39;ARNdb (figure 2F). Lors de l&#39;ARNi, il est important d&#39;avoir un contrôle positif pour déterminer que l&#39;ARNi fonctionne correctement, et un témoin négatif pour vérifier que l&#39;effet observé n&#39;est pas un effet non spécifique de l&#39;ARN double brin ou une suite de procédures d&#39;injection (tels que le dommage causé par injection, ou une anomalie de etherisation). L&#39;injection d&#39;ARNdb ciblant EYFP peut servir d&#39;bon contrôle positif lors de l&#39;utilisation de la pu-11 souche 5,7. Lorsque EYFP ARNdb est injecté dans le dernier stade larvaire, une réduction significative de signal de EYFP dans les futures primordia des ailes peut être observée dès une post-injection de jours (Figure 3A). Le knockdown de EYFP est terminée deux jours après l&#39;injection de l&#39;ARN double brin EYFP (figure 3B) et ce knockdown persiste à travers le stade de pupe (figures 3C et 3D) et tout au long de la vie de l&#39;insecte si la concentration ARNdb est suffisamment élevée (par exemple 1 ug / ul) 7. EYFP ARNdb peut également être utilisé en tant que contrôle négatif comme il s&#39;agit d&#39;une séquence d&#39;un gène non endogène et ne doit pas provoquer des perturbations morphologiques et physiologiques (figures 3A-3D). Nous avons fourni des images de larves ARNi pour résiduelle (VG), un gène de l&#39;aile critique 12, comme un autre exemple de la façon efcaces cette technique ARNi basée injection est en T. castaneum. Lorsque l&#39;ARN double brin pour vg est injecté dans les larves de avant-dernière étape (une étape avant le dernier stade larvaire), une perte complète des structures d&#39;ailes peut être observée au stade de pupe (figures 3E et 3F). L&#39;adulte résultant manque aussi complètement des structures d&#39;ailes (figures 3G et 3H). Le résultat ARNi pour vg illustre à la fois la robustesse et la nature systémique de l&#39;ARNi dans T. castaneum. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: (A) Exemples d&#39;aiguilles non brisées, bonnes et mauvaises (B) La pointe d&#39;une bonne aiguille bien cassé (C) La pointe d&#39;une aiguille brisée qui est trop grand et pointu (D) La pointe... d&#39;une faillite<html> aiguille de n qui est trop mince. Les barres d&#39;échelle (rouge) sont de 0,05 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2:... (A) une aiguille d&#39;injection de taille appropriée insérée dans le dernier stade larvaire (B) Larve injecté de manière appropriée avec la solution vert ARNdb (C) de débordement de la solution de l&#39;ARN double brin au niveau du point causée par la sur-injection injection (D ) d&#39;une aiguille fine pour ne pas pénétrer dans la cuticule des larves. (E) Une grande aiguille d&#39;injection insérée dans le dernier stade larvaire. (F) Larve injecté avec une aiguille, entraînant le débordement et la fuite de la solution d&#39;ARNdb. Les flèches indiquent les aiguilles.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3: Exemples de réussite ARNi dans T. castaneum. (AD) Dernière injection larvaire des résultats EYFP ARN double brin dans une réduction de l&#39;expression de EYFP. (A) Les larves un jour après l&#39;injection. (B) Les larves deux jours après l&#39;injection. (C) pupes de contrôle. (D) chrysalides résultant de injection larvaire EYFP ARN double brin. Les témoins négatifs sont l&#39;injection de la mémoire tampon (A, B) et l&#39;introduction d&#39;ARNdb DsRed (C, D). Pointes de flèches et des flèches indiquent l&#39;expression de EYFP ou son absence dans les ébauches et les yeux aile, respectivement. (EH) Penultime larvaire ARNi pour vg. (E) de type sauvage chrysalide. (F) vg ARNi chrysalide. Le manque de structures d&#39;ailes est déjà visible au stade de pupe (flèche). G) de type sauvage adulte. (H) vg ARNi adulte. structures d&#39;ailes liées sont complètement absentes (flèche). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

l&#39;interférence ARN (ARNi) techniques de gènes knockdown-based sont au cœur de la recherche Tribolium. Ici, nous donnons un aperçu de notre technique ARNi larvaire dans Tribolium castaneum. Larvaire ARNi est une technique simple, mais puissant qui permet d&#39;accéder rapidement à des phénotypes perte de fonction, ce qui permet aux chercheurs d&#39;étudier les fonctions des gènes dans divers contextes.

Larvaire interférence de l&#39;ARN dans le rouge de la farine Beetle,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

15.9K vues.  Miami University.  l'interférence ARN (ARNi) techniques de gènes knockdown-based sont au cœur de la recherche Tribolium. Ici, nous donnons un aperçu de notre technique ARNi larvaire dans Tribolium castaneum. Larvaire ARNi est une technique simple, mais puissant qui permet d'accéder rapidement à des phénotypes perte de fonction, ce qui permet aux chercheurs d'étudier les fonctions des gènes dans divers contextes. 