This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

모든 동물 실험은 건강 지침의 국립 연구소를 본 및 웨이크 포레스트 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] 마우스 모델의 번식 쌍은 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 얻었다. 야생형 (WT) 여성과 SOD1G93A 남성 비 형질 [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A 마우스와 실험에 사용 된 비 형질 WT 한배 새끼를 생성하기 위해 사육되었다. 조사 1. 모델 <ol><li> 세포 배양 <ol><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 인간 배아 신장 세포 (HEK-T293), 10 % 열 불 활성화 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 1 % L- 글루타민이 보충 된 DMEM에서 세포를 유지한다. </li><li> T75 플라스크에 세포를 성장하고 그들이 90 % 컨 플루 언스에 도달 할 수있다. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 3 ~ 5 분 동안 트립신 (0.25 % 트립신 - EDTA)를 통해 세포 분할을 수행 </sub&gt; 700 XG에서 4 ℃에서 5 분 동안 세포의 동일한 세포 미디어의 볼륨 및 원심 분리와 트립신의 불 활성화. </li><li> 미디어를 기음 문화 매체에서 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 7 × 10 4 세포 T75에 해당 플라스크 또는 판에 씨앗 세포 치료 사이토 카인하기 전에 48 시간 플라스크. 이는 치료시 70 %에게 ~ 밀도를 제공해야합니다. </li><li> 혈청 굶어 셀 24 시간 후 매체를 흡인하고 혈청이없는 배지의 동일한 양 (DMEM, 멸균)로 교체하여. </li><li> 5 페이지 / μL, 10 NG / μL의 작업 농도로 초순수와 동결 건조 된 분말에서 TNF-α, IL1-β와 IFN-γ를 준비, 10 NG / μL, 각각 및 우물에 추가 / 플라스크. </li><li> 치료는 혈청 직접 해당 플라스크의 세포 배양 배지에 가용화 된 사이토 카인을 첨가하여 세포를 결핍. 치료는 각각의 사이토 카인의 3의 칵테일을 구성 (같은 &quot;* 3&quot;이라한다), 또는 아이돌대조군으로서 ILE 물 ( &quot;0&quot;이라한다). </li><li> 평가 및 수확 전 24, 48 또는 72 시간 동안 처리 한 세포를 품어. </li></ol></li><li> 세포 생존 능력 평가 <ol><li> 1X PBS에서 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일)의 5 ㎎ / ㎖ 용액 -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 만든다. </li><li> 12 웰 플레이트를 들면, 각 웰에 MTT 용액 100 ㎕를 추가하고 부드럽게 고른 분포를 보장하도록 소용돌이 친다. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 15 분-1의 시간에 대 한 번호판을 품어, 보라색 착색의 존재에 대한 현미경으로 확인합니다. 더 퍼플가 없으면 다시 소용돌이 보라색이 관측 될 때까지 세포를 5 분 간격으로 인큐베이션 할 수있다. 필요한 시간의 양은 각각의 연구자에 의해 결정되어야한다. </li><li> 모든 자색 셀을 떠났다까지 반복 피펫을 사용하여, 각 웰에 MTT 용매 (이소프로판올 4mm의 HCl 및 0.1 % NP40) 700 μL를 추가하고 50-10 분 동안 실온에서 플레이트 (들)를 흔들거나 . 보라색 ​​경우색상은 세포에서 나오는 용매의 추가 200 μl를 추가하고 소용돌이를 계속하지 않습니다. </li><li> 측정 값이 일치하는 설정으로 촬영 그러나 595 nm의 한도 가능, 분석을 위해, 잘 각각 100 μl를 타고 96 웰 플레이트에 배치하고 570 nm ()을 사용 플레이트 리더 및 630 nm의 기준 파장에서 읽을. </li></ol></li><li> ALS의 동물 모델 <ol><li> 모든 동물 실험은 건강 지침의 국립 연구소를 본 및 웨이크 포레스트 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] 마우스 모델의 번식 쌍은 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 얻었다. 야생형 (WT) 여성과 SOD1G93A 남성 비 형질 [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A 마우스와 실험에 사용 된 비 형질 WT 한배 새끼를 생성하기 위해 사육되었다. </li><li> 돌연변이 SOD1 (25)에 대한 표준 프라이머 유전자형을 수행합니다. </li></ol></li></ol> 미토콘드리아 2. 분리 참고 : 빠르게 작업이 절차가 끝날 때까지 얼음에 모든 것을 유지하는 것이 중요합니다. <ol><li> 미토콘드리아 분리 완충액 (MIB), 척수 분리 완충액 (SC의 MIB) 및 실험 완충액의 제조 (EB) <ol><li> 앞서 MIB와 EB 시간의 다음 원액을 준비합니다. </li><li> H 2 O 70 ㎖의 트리스 염기 12.1 g을 용해시켜 1 M 트리스 / MOPS 만들기 pH 7.4까지를 얻기 위해 건조 MOPS를 추가합니다. 100 ml의 결승전에 볼륨을 조정합니다. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장. </li><li> 80.2 K 2 HPO 4 ml의 KH 2 PO 4의 19.8 ml를 혼합하여 1 M Kphos을 확인합니다. 실온에서 보관하십시오. </li><li> H 2 O 10 ㎖에 EGTA 3.8 g을 첨가하여 0.2 M EGTA / 트리스 만들기 용해 ~ 30 ~ 40 ml의 때까지 1 M 트리스 / MOPS를 추가합니다. 50 ㎖, 실온에서 살균 필터 및 저장소에 조정합니다. pH가 6.7 ~ 일 것이다합니다. </li><li> 10 ㎖함으로써 1 M 글루타메이트 만들기글루탐산 1 M 용액. 필터 소독 및 저장 4 ° C에서. </li><li> 사과산의 1 M 용액 10 ㎖를하여 1 M 말라 테를 확인합니다. 50 mm로 트리스 / MOPS를 추가합니다. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장. </li><li> 200 MM의 자당, 10 mM 트리스 / MOPS, 산도 7.4, 1 mM의 EGTA / 트리스의 농도로 MIB을 확인합니다. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장. </li><li> 250 MM의 자당, 20 mM의 HEPES-KOH의 pH 7.5, 10 mM의 KCl을, 1.5 mM의의 MgCl 2, 1 mM의 EDTA, 1 mM의 EGTA, 1 mM의 DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일의 농도 SC의 MIB을 확인합니다. </li><li> 125 mM의의 KCl 농도 EB하기 위해선, 10 mM 트리스 / MOPS, pH가 7.4, 5 mM의 글루타민, 2.5mM의 사과산, 1 mM의 K 포스페이트, pH가 7.4, 10 mM의 EGTA / 트리스. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장. </li></ol></li><li> 세포를 수확하기 전에 장비 준비. <ol><li> 작은 유리 용기 및 균질화 갈리고을 멸균 수로 3 회 씻어 얼음에 배치합니다. </li><li> 이러한 표준 드릴, 휴대 scra으로 필요한 물품을 준비인사과, 1.5 ml의 15 및 50ml 튜브 및 솔루션을 제공합니다. </li></ol></li><li> 미토콘드리아 격리 <ol><li> 배양 된 세포 <ol><li> 각각의 샘플 유형의 경우, 세포의 두 T175 플라스크를 사용합니다. </li><li> 세포가 있는지 ~ 90 %의 합류를 확인하고 제어 실험, 또는 판에 사용하고 단계 1.2에서 상기와 같이 취급합니다. </li><li> 및 벤치 탑, 기음 미디어에 1X PBS의 15 ml의 때마다 두 번 부착 세포를 씻는다. </li><li> 버퍼 대기음 플라스크의 바닥으로부터 부착 세포를 제거하기 위해 플라스크를 긁어. </li><li> 각 플라스크, 소용돌이에 1X PBS의 15 mL를 넣어 얼음에 각각 15 ml의 원뿔 튜브와 장소를 전송합니다. </li><li> 스크랩은 스윙 버킷 로터를 사용하여 테이블 상단 원심 분리기를 사용하여 700 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기 튜브를 완료되면. </li><li> 기음 상층 액과 MIB 1 ml의 각 펠렛을 재현 탁. </li><li> 현탁액을 모두 합하고 균질화 작은 유리 용기에 옮긴다. </li><li> MIB 추가용기 버퍼는 첫 번째 라인에 도달 할 때까지. 세 패스에 대한 중간 속도에서 드릴에 부착 된 유 봉 세포를 균질화. 용기는 액체 위의 유봉을 제거하고 연속 패스와 안정된 속도를 사용하지 않는,이 단계에서 얼음에 있는지 확인하십시오. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 균질 솔루션을 전송합니다. </li><li> 18 게이지 1 ½ 인치 바늘을 사용하여 3 ML의 주사기에 솔루션을 그리고 27 게이지 ½ 인치 바늘로 얼음에 다시 원뿔 튜브로 추방. 세포막 파쇄 그 힘을 이용하도록 상기 튜브의 내벽에 대해 용액을 배출하도록주의한다. </li><li> 합계 5 회 주사기 단계를 반복한다. </li><li> 스윙 버킷 로터를 사용하여 테이블 상단 원심 분리기 600 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 솔루션을 전송합니다. </li><li> 조심스럽게 상층 액을 제거하고 세 1.5 ml의 튜브들 사이에서 배포합니다. 참고 : Mitocho세포막과 세포 펠렛 깨지지 동안 ndria이 먼저, 저속 회전 후에 상청액에있다. </li><li> 10,000 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터의 원심 분리기 튜브. </li><li> 대기음 상층 액 100 μL MIB의 알약을 결합하고 즉시 얼음에 배치합니다. 주 : 미토콘드리아이 고속 회전 후의 펠릿에있다. 미토콘드리아는 일반적으로 분리 후 2-3 이온 얼음 ~에 대한 자신의 막 잠재력을 유지하고 MIB의 농축 원액으로 가장 안정됩니다. </li></ol></li><li> 마우스 조직으로부터 단리 미토콘드리아 <ol><li> IACUC 프로토콜에 따라 마우스를 마취. 마취를 유도하기 위해 5.0 %로 기화기를 설정합니다. 눈에 접근 또는 면봉으로 도청 할 때 동물이 발 핀치 또는 깜박임 반사에 대한 반사의 부족으로 마취가 있음을 확인. 1.5 %와 2.0 % 사이 기화기를 유지하여 전체 수술을위한 마취 마우스를 유지합니다. </li><li> EXC이세 PBS 1X 얼음 추위 별도로 각 동물과 장소에서 간 및 척수는 - / - 어떤 피를 멀리 씻어합니다. </li><li> 간은, 얼음에 무게를 접시에 조직을 전송하고 1 분 동안 신선한 면도날을 사용하여 미세한 조각으로 잘라. </li><li> 버퍼가 첫 번째 줄에 도달 할 때까지 용기에 조직과 (척수에 대한 간 또는 SC MIB에 대한 MIB) 적절한 버퍼를 추가합니다. 오 패스에 대한 손으로 갈리고와 조직을 균질화. 용기는 액체 위의 유봉을 제거하고 연속 패스와 안정된 속도를 사용하지 않는,이 단계에서 얼음에 있는지 확인하십시오. </li><li> 균질 15 ml의 튜브를 청소 전송합니다. </li><li> 750 XG, 10 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터의 원심 분리기 튜브. </li><li> 깨끗한 튜브에 상층 액을 저장하고 얼음에 배치합니다. 주 : 세포막 및 세포 펠릿 깨지지 동안 미토콘드리아이 먼저, 저속 회전 후에 상청액에있다. </li><li> 척수 펠렛을 다시 중단 전N SC의 MIB의 500 μL. </li><li> 단지 SC MIB와 용기 반쯤 이때 충전 각각 세 번 다시 균질화. </li><li> 신선한 튜브에 새로운 균질을 전송합니다. </li><li> 원심 분리기 750 XG, 10 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터. </li><li> 각 샘플에서 첫 번째 상층 액으로, 더 미토콘드리아를 포함하는 새로운 상층 액을 결합합니다. </li><li> 10,000 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터의 원심 분리기 튜브. </li><li> 기음 상층 액 500 MIB의 μL, 50 μL 사우스 캐롤라이나 MIB의 척수 펠릿에 간 펠렛을 재현 탁하고 즉시 얼음에 놓습니다. 주 : 미토콘드리아이 고속 회전 후의 펠릿에있다. 미토콘드리아는 일반적으로 분리 후 2-3 이온 얼음 ~에 대한 자신의 막 잠재력을 유지하고 MIB의 농축 원액으로 가장 안정됩니다. </li><li> 미토콘드리아 용액의 농도를 추정하기 위해 단백질 농도 분석을 수행한다. 지침에 따라상업용 단백질 분석 키트 (26) 또는 유사한 방법을 사용하기위한 S. 미토콘드리아의 전형적인 농도는 2 T175 플라스크 수익률 ~ 2 ㎎ / ㎖, 1 마우스 간 ~ 3 ~ 5 ㎎ / ㎖, 1 마우스 척수 ~ 1-3 ㎎ / ㎖. </li></ol></li></ol></li><li> (제조업체가 제공하는 프로토콜에서 적응) Quantikine ELISA 키트 C R &amp; D 쥐 / 마우스 사이토 크롬을 사용하여 시토크롬 C 분석. <ol><li> 즉시 반응을 설정하기 전에, EB 0.5 ㎎ / ㎖ 작업 농도로 미토콘드리아를 희석 반응 (관 당 미토콘드리아의 일반적으로 30 ~ 50 μL) 1.5 ml의 튜브에 희석 미토콘드리아를 배포 할 수 있습니다. </li><li> 희석 된 미토콘드리아에, 전체 부피의 1 %에서, EB 또는 DMSO를 추가하고 7-10 분 동안 벤치 위에 반응을 배양한다. 긴 시간 프레임은 필요한 경우에 이들 반응은 실온에서 30 분 동안 안정하다. </li><li> 10,000 XG, 5 분 및주의 4 ° C에서 고정 된 각도 로터에서 원심 분리하여 펠렛의 미토콘드리아해동 상층 액을 분리하고 별도의 1.5 ml의 튜브에 각각 배치합니다. 참고 : 튜브는 하나 나중에 분석을 위해 -20 ℃에서 냉동 또는 즉시 사용할 수 있습니다. </li><li> 이 펠릿 상등액 27 시토크롬 C의 농도를 비교하여 사이토 크롬 C의 방출을 결정한다. <ol><li> 1X PBS에서 0.5 % TX-100 반응의 원래 볼륨에서 펠렛을 용해하여 샘플을 준비합니다. </li><li> 각 샘플의 경우, ELISA 플레이트에 2 우물, 지금 가용화 펠릿에 대한 하나의 사이토 크롬 C 복합체를 100 ㎕를 첨가하여 반응에서 뜨는 하나를 준비 (병에서 바로 사용) 플러스 0.5 % TX- 100 ㎕ 1X PBS 100, 다음 모든 펠렛 또는 상층 액 샘플. </li><li> 조심스럽게 커버를 혼합하고 1 시간, 37 ° C 부화 20 초 동안 판을 낮은 설정 (레벨 2-4) 와동. </li><li> 다음에, manufactur의에 따른 희석 플레이트를 세척 완충제로 4 회 세척어의 지시. 종이 타월에 우물을 눌러 초과 솔루션을 제거합니다. </li><li> 각 웰에 1 A + B 현상액 실온에서 어두운 곳에서 20 ~ 30 분 동안 플레이트를 인큐베이션 : 다음에, (1)의 150 μl를 추가. </li><li> 마지막으로, 각 웰에 스톱 용액 50 μL를 추가 한 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 흡광도 판독 값을 취. 각 반응 대 상등액 펠릿 시토크롬 C의 양을 비교하여 사이토 크롬 C의 방출 정도를 계산한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 미토콘드리아 (DYS) 함수 3. 평가 <ol><li> 반응이 설정되어 직전, 0.5 mg의 미토콘드리아를 희석 / ㎖ EB와 농도를 작업하고 (미토콘드리아의 일반적으로 30 ~ 50 μL가 튜브 당 사용되는) 반응에 1.5 ml의 튜브에 배치. </li><li> 미토콘드리아 치료 <ol><li> 50 nM의 발리 노마 이신 (Valinomycin)와 혼합 FCCP 적절한 치료를 추가 (EB 제어, 1 μM, 10 μM 로테 논5 μM의 oligomycin, 2 mM의 KCN, 또는 200 μM ADP, 최종 농도)로 희석 미토콘드리아의 총 부피의 1/10 번째에서 반응을 분리한다. 7 분 동안 벤치 위에 반응을 품어. 참고 : 해가 될 수있는 피부를 통해 실수로 섭취 또는 흡수 이러한 물질을 취급 할 경우주의가 취해 져야한다. </li><li> 100 μM의 농도로 작동 멸균 재구성 및 2 μM로, -20 ℃에서 보관, TMRE 희석시키고 미토콘드리아 반응 부피와 동일한 부피를 추가한다. </li><li> 7 분 동안 벤치 위에 반응을 품어. </li><li> 10,000 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터에서 원심 분리하여 펠렛의 미토콘드리아. </li><li> 로드 396 웰 판에 각 시료의 상등액 볼륨의 절반 형광을 읽어보십시오. 주 : TMRE의 여기 및 방출 파장에 사용되는 양과 플레이트를 이용하여 제조사의 지침에 따라 최적화되어야분석. 여기 / 방출 파장을 이용하여 1 μM TMRE 25 μL와 표준 384- 웰 블랙 플레이트 (최종 반응 농도) 강한 신호 얻었다 사용 &#160; 485 나노 미터 / 535 nm의. </li><li> 제어부 (EB) 및 대조군 샘플로부터 RFU 의한 실험 샘플 플레이트 판독기로부터 얻어지는 상대 형광 값 (RFU)를 분할하여 각각의 처리 사이에 형광 접이식 차이를 계산. </li></ol></li></ol>

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A., Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+dependence+and+ABT-737+sensitivity+in+acute+lymphoblastic+leukemia.">BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 111, 2300-2309 (2008).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+complex+I+inhibitor+rotenone+induces+apoptosis+through+enhancing+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production.">Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).</li><li>Hynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+drug-induced+mitochondrial+toxicity+using+fluorescence-based+oxygen-sensitive+probes.">Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes.</a> Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).</li><li>Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+optical+oxygen+sensing:+protocols+and+critical+analyses.">Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses.</a> Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+permeabilization+in+apoptosis.">Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis.</a> Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+BCL-2+family+members.">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.</a> Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).</li><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li><li>Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+cytochrome+oxidase+and+succinoxidase+in+the+cytoplasm+of+the+mammalian+liver+cell.">The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).</li><li>Marques-Fernandez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFalpha+induces+survival+through+the+FLIP-L-dependent+activation+of+the+MAPK/ERK+pathway.">TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e493 (2013).</li><li>Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity:+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li><li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture:+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li><li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model.">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader.">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li><li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader.">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li><li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry.">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li><li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion.">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

재조합 사이토 카인과 HEK-293T 세포의 치료는 48 시간 (그림 1)를 통해 세포 사멸의 적당한 양을 발생합니다. TNF-α 처리에 의해 유도 된 세포 사멸의 정도는 이전에보고 된 연구 (30)과 유사하고, 세포 생존율은 단독 또한 문헌 (31, 32)와 일치하는 사이토 카인과 총괄적 양보다 많은 여러 사이토 카인의 공동 투여 후에 감소한다. 금액과 사이토 카인 치료의 종류뿐만 아니라...

살아있는 세포는 지방과 탄수화물의 형태로 대사 에너지를 은행 및 생합성, 막 수송 및 이동이 에너지를 사용합니다. 일부 에너지는 당분 해 동안 직접적으로 ATP식이 당의 전환을 통해 세포질에서 얻어진다. 그러나, 셀의 ATP 생산의 주요 공급원은 미토콘드리아 호흡 사슬 1 통하여 미토콘드리아 내 동력화된다. 미토콘드리아의 구조는 효과적이고 효율적인 ATP 생산에 필요한 공간의 방향을 제공한다. 미토콘드리아는 구성 요소 막간 공간으로 함께 행렬, 가장 안쪽의 미토콘드리아 구획, 집으로 분리 된 이중 막을 소유하고 ATP 생성에 관여하는 화학 반응을 좌표입니다. 내막은 호흡 쇄뿐만 아니라 ATP 합성 효소, ATP의 형성과 함께 ADP 파이 가져온다 단백질 복합체를 포함하는 막 결합 단백질 복합체의 시리즈를 포함한다. 여관어 막은의 cristae로 접 히고 전자는 시토크롬 C, 막간 공간 내에서 단지 사이에 이동 가용성 전자 캐리어를 통해 호흡 사슬 복합체를 따라 전달됩니다. 전자가 이동함에 따라 감소 등가물의 산화가 발생하고 수소 이온이 막간 공간으로 매트릭스에서 펌핑. 막간 공간 내에서 높은 이온 농도의 결과로서, 전기 화학적 구배는 미토콘드리아 내막 (Δψ)이 걸쳐 막 전위의 결과로 만든다. 산소는 전자 수송 체인의 최종 전자 수용체이고, 수소 이온은 매트릭스로 다시 막간 공간에서 ATP 신타 흐르 그렇게 하므로써 직접 ATP 형성을 야기한다. 그 전체에 기재된 바와 같이이 과정은 산화 적 인산화로 알려져있다. 의 cristae의 주름은 최대 전자 수송 및 내 ATP 생산을 허용 내막의 표면적을 증가각각의 미토콘드리아. 단백질, 효소와 산화 적 인산화에 관여하는 다른 분자는 핵과 미토콘드리아 유전자 모두에서 파생됩니다. 미토콘드리아는 13 단백질뿐만 아니라의 tRNA와 ATP 생산 3에 필요한 mRNA에 대한 자신의 원형 DNA, 인코딩을 포함하고있다. 그러나, 더 많은 단백질이 필요하므로 인코딩 핵이다. 이러한 핵 부호화 대부분의 단백질은 전구 단백질의 N 말단에 presequences의 사용에 의해 미토콘드리아 타겟팅 행렬이며, 그들의 수입은 4,5- Δψ에 의해 부분적으로 구동된다. 세포의 생체 에너지에 기여 외에도 미토콘드리아 또한 TCA 베타 산화 칼슘 조절을 통해 세포 신호 전달, 세포 자멸사뿐만 아니라 6에서 중요한 역할로서 중요한 대사 과정에 영향을 미친다. 특히, 세포 스트레스의시기에 거주하거나 BCL-2 가족 단백질은 미토콘드리아를 일으킬 수있는 미토콘드리아 외막에 상호 작용외막 투과성 (MOMP) 7,8. MOMP 동안, 시토크롬 c와 다른 단백질은 여러 세포질 단백질과 함께 복잡한 apoptosome을 9,10이라고 형성 세포질로 방출하고있다. apoptosome을 세포 사멸의 실행 단계에서 세포 단백질과 DNA를 절단에 갈 카스파을 활성화합니다. MOMP가 발생하자마자 ΔΨ가 붕괴되고, ATP 생산은 중단. 따라서, 세포 사멸로 시작되는 미토콘드리아의 기능이 손상되고 ΔΨ의 변화는 미토콘드리아와 세포 건강 (12)에 상관 관계가 될 수있다. 아폽토시스는 또한 질병의 개시 및 / 또는 진행에 대한 중요한 정보를 얻을 수있는 다수의 질병 모델, ΔΨ 미토콘드리아 기능 변화 점이된다. 예를 들어, 미토콘드리아의 구조적 및 기능적 변화는 신경 퇴행성 질환 (13, 14)의 도중에 기록되었다. 프로토콜, ISO의 첫 번째 부분에서자신의 ΔΨ을 유지 그대로 미토콘드리아 만큼은 설명한다. HEK-293T 세포는 아폽토시스를 유도하는 다른 농도의 재조합 TNF-α, IL1-β와 IFN-γ의 조합에 노출시켰다. 그들이 자주 수용체 (6)에 결합하는 TNF-α의 상호 작용에 의해 트리거 될 수 있습니다 차 인간의 오수 샘플 (15)과 세포 사멸의 외부 경로에서 높은 것으로보고 있기 때문에 이러한 사이토 카인이 선택되었다. 배양 된 세포에 비해 기본 조직에서 기능 미토콘드리아를 분리하는 데 필요한 미묘한 변화가 있기 때문에 많은 연구가 동물을 이용하기 때문에, 그리고 프로토콜은 간 및 측삭 경화증 (ALS) 마우스 모델을 전방의 척수에서 미토콘드리아를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 프로토콜의 두번째 부분은 형광 플레이트 판독기로 전위 성 형광 색소를 이용하여 미토콘드리아 막 전위에 섭동을 모니터링하기 위해 개발되었다. 차휴대 상태 (비정상 대 즉, 건강) 간의들 미토콘드리아 막전위의 손실을 야기 모두 언 커플 링제, 호흡 쇄 억제제 복합체 억제제 및 이오 노 포어와 함께 격리 미토콘드리아 ΔΨ의 강도를 정량에 의해 구별된다. 따라서 미토콘드리아의 응답이 미토콘드리아 (DYS) 기능의 지표로 사용할 수 있습니다 미토콘드리아 억제제로 치료시 ΔΨ의 변화에​​ 더 큰, 미토콘드리아 건강. 오히려 기능의 현장 평가에 비해 고립 된 미토콘드리아의 사용은 병리 또는 치료를 직접 세포 소기관 16-18 변경을 조절한다는 결정적인 증거를 제공합니다. 배양 된 세포에서 미토콘드리아를 분리 할 수있는 문학의 방법이 있지만, 그들은 모호 (17) 및 / 또는 특수 장비 (16)을 사용한다. 이 프로토콜은 상세히 분리 방법을 기술하고있다조직 배양 및 주 13,14,19,20 포함한 다른 세포주 쉽게 구성. 많은 고립 미토콘드리아 연구는이 프로토콜뿐만 클락 전극에 사용되는 동일한 미토콘드리아 uncouplers 및 억제제를 다시 장비의 매우 구체적인 전문 조각 (21 문헌에서 많은 논문의 대표적인 예입니다) 사용합니다. 또한,이 전통적인 방법은 낮은 처리량과 높은 복잡성 22, 23 등의 제한이 미토콘드리아의 상당한 양 (~ 500 ㎍ / 반응)가 필요합니다. 이 프로토콜에서, 형광 막 전위 감지 프로브 TMRE는 많은 표준 실험실 기계 인 형광 플레이트 판독기와 함께 사용된다. 신속 세포 및 절연 미토콘드리아 들어가고 저농도 24에서 사용될 수 있기 때문에 TMRE 널리 간주된다. 여러 반응이 신속 탠덤 설정할 수 및 배치는이 프로토콜을 이용하여 분석 하였다. 또한, 반응의 격리 된 미토콘드리아 (~ / 반응 10 μg의)의 매우 적은 양이 필요합니다. 덜 재료를 요구함으로써, 작은 조직 또는 세포 배양 샘플 미토콘드리아 격리를위한 출발점으로 사용될 수있다, 이상의 복제물이나 반응은 설정 및 ATP 생산, 산소 소비량, 또는 임포트와 같은 다른 절연 미토콘드리아 실험 잠재적 충분한 재료 일 수있다 분석이 가능하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:137px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8304</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trisma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCN</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td align="right">6379</td>
			<td>Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8717-25mg</td>
			<td>Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>1x regular (high glucose).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3002101</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td>US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Protien Assay Dye (5x)</td>
			<td style="width:137px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:163px;">500-0006</td>
			<td>Any protein assay can substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BSA</td>
			<td style="width:137px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">BP1600-100</td>
			<td>Make 2mg/mL stock in water for protein assay.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTT powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2128</td>
			<td>Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tergitol solution (NP-40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NP40S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human IL-1B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PCH08014</td>
			<td>Once opened store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IFN-gamma</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td>PHC4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Dulbeccos PBS (-/-)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:163px;">D8537</td>
			<td>Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytochrom c ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DTC0</td>
			<td>Human for HEK-293T cells.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

200 pg / ml이다 TNF-α 40 ng의 / ㎖ IL1-β, 75 NG / ㎖의 IFN-γ와 함께 HEK-293T 세포의 치료 (* 3) 24 내지 48 시간 동안 세포 사멸의 양 시브 (도 1a에 이르게 ). 세포 생존은 MTT 분석을 사용하여 평가하고 일관성 ~ 24 시간 처리와 세포 생존율의 10 % 감소 시간 및 48 치료와 ~ 20 % 감소가 있음을 입증 하였다. 개인 사이토 카인과 유사한 농도 (100 페이지 / ㎖의 TNF-α, 40 NG / ㎖ IL1-β, 75 NG / ml의 IFN-γ) 48 시간...

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Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

39.3K 조회수.  Elon University. Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress. 

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Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

연구

생물학

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

효모 세포 Mitochondria의 정화

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

성인 마우스 Hippocampal 이가있는 이랑의 해부

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

마우스 기관에서 자연적으로 흐르는 것과 셀 및 Submucosal 글 랜드 덕트 세포의 분리

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

조직 해리 차동 여과 이식 미토콘드리아의 신속한 분리 및 정제

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...