Nous tenons à souligner l&#39;appui de financement pour ce travail par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), la Fondation Krembil famille, le président Halbert dans Neural Repair and Regeneration, Phillip et Peggy DeZwirek, et Gordon Yao pour la contribution à la figure 2 . Klaus Zweckberger a été financé par une subvention de la &quot;Deutsche Forschungsgesellschaft&quot; (DFG).

NOTE: Le protocole expérimental suivant a été approuvé par le comité de protection des animaux de l&#39;University Health Network (Toronto, Canada) et est conforme aux politiques établies dans le guide pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire préparés par le Conseil canadien de protection des animaux . 1. cervicale anévrisme clip Contusion / Compression Modèle <ol><li> Avant d&#39;instruments et de chirurgie de l&#39;autoclave maintenir des conditions stériles au cours de la procédure surgcial ensemble en mettant les instruments dans un bain d&#39;alcool à 70%. </li><li> Anesthésier rats Wistar (250-270 g) avec une combinaison de l&#39;oxygène (O 2), l&#39;oxyde nitreux (N 2 O) (1: 1), et de 1.8 à 2.2% isoflurane et soutenir la respiration spontanée via un masque d&#39;anesthésie de gaz. Pour l&#39;induction de l&#39;anesthésie commencer avec 5% d&#39;isoflurane pendant 1 minute et réduire par la suite. Avant de commencer la chirurgie, la profondeur de l&#39;anesthésie de contrôle en donnant un stimulus douloureux (par ex. Dans les pattes). Appliquer pommades grassesdans les yeux pour éviter la sécheresse et pour prévenir les infections ultérieures. </li><li> Mettez les rats sur un coussin de chauffage (37 ° C) et fixer la tête dans un cadre stéréotaxique. </li><li> Rasez la région chirurgicale autour de la colonne cervicale et désinfecter avec povidone iode et 70% d&#39;alcool. </li><li> Faire une incision médiane au-dessus de la colonne vertébrale de la vertèbre cervicale (C2) atteignant au Processus de premier plan du corps vertébral thoracique 2 (T2). </li><li> Couper à travers la couche extérieure des muscles vertébraux directement sur la ligne médiane (pour éviter les saignements) dans une direction cranio-caudale et encore disséquer les couches musculaires profondes carrément jusqu&#39;à ce que vous atteignez le apophyses épineuses et les lames. Insérez écarteurs. </li><li> Orienter l&#39;apophyse épineuse de premier plan du T2 de corps vertébral d&#39;observer les niveaux ciblés pour laminectomie. Après identification et micro-chirurgicale préparation des lames sélectionné, couper à travers la flavae ligamenti pour desserrer les lames et l&#39;apophyse épineuse. Enfin, cut travers les lames avec un latéral clipper os à la moelle épinière et enlever ceux doucement, en évitant toute compression de la moelle épinière elle-même. NOTE: La plupart niveaux communs sont C5 / 6, C6 / 7, ou C7 / T1. Le taux de mortalité périopératoire augmente plus rostrale la gravité des blessures. Saignement du sinus veineux paravertebral est commun et peuvent être traitées par la compression prudent avec éponge. </li><li> Avant d&#39;insérer le clip de traumatiser le cordon, identifier les nouvelles racines nerveuses de leur épargner l&#39;écrêtage (en particulier au niveau C5 / 6). </li><li> Afin d&#39;assurer le bon pince à induction, desserrer la dure-ventrale de la face dorsale des corps vertébraux avec un crochet et préparer un couloir pour le clip. </li><li> Enfin, insérer le clip ouvert et laissez-le se referment (fermeture rapide) pour atteindre une blessure contusion. force de fermeture du plan-séquence et la durée de fermeture de clip à déterminer l&#39;intensité du traumatisme et de l&#39;ampleur de la compression. Couramment utilisés sont des forces clip comprises entre 15-35 g et un clipping durée de 1 min, par exemple. (Figure 1). </li><li> Après le retrait du clip, adapter muscles en deux couches et fermer la plaie. </li><li> Arrêtez l&#39;anesthésie et de laisser le sillage des animaux sous votre observation continue jusqu&#39;à ce qu&#39;il reprenne conscience suffisante pour décubitus sternal. Enfin, mettre le rat dans une seule cage et suivez les directives de traitement post-opératoires. </li><li> Puisque les animaux se débattent avec la gravité de ce type de blessure, vous devez payer une attention particulière à des traitements post-opératoires: <ol><li> Administrer des analgésiques (buprénorphine et Meloxicam pendant 3 jours et 5 jours, respectivement et selon les symptômes cliniques). </li><li> Donnez solution saline supplémentaire sous-cutanée pendant trois jours (deux fois par jour, 5 à 10 millilitres (ml)). </li><li> Fournir des antibiotiques dans l&#39;eau potable 2 jours avant et jusqu&#39;à ce que la chirurgie de poste sept jours (par exemple, moxifloxacine) </li><li> Pressez la vessie 2-3 fois par jour jusqu&#39;à la récupération de la fonction de la vessie est constantely apparente. </li><li> Respecter les déficits neurologiques et état physiologique des animaux opérés au moins une fois par jour. </li></ol></li></ol> 2. Injection PAS et PNJ (14 jours après la lésion) <ol><li> Induire une anesthésie comme décrit dans 1.1. à 1,3, fixer la tête du rat dans un cadre stéréotaxique, enlever les points de suture ou clips plaies, et désinfecter la plaie et la zone chirurgicale avec de la povidone iode et 70% d&#39;alcool. </li><li> Disséquer soigneusement les muscles paravertébraux, insérez rétracteurs, enlever le tissu cicatriciel au microscope de la dure-mère, et ré-exposer le site de la lésion. </li><li> Préparer SAP à une concentration de 1% (p / v) pour effectuer un gel de matrice extracellulaire. PAS NQ6 ont un pH physiologiquement compatible et ne ont pas besoin d&#39;être tamponnée avant l&#39;injection. Pour la visualisation de programmes d&#39;ajustement structurel de la moelle épinière, utiliser un dérivé fluorescent de NQ6 (NQ6-FITC). </li><li> Injecter PAS (5 microlitres (ul) dans le centre de la lésion, répartis en deux portions, chacune2,5 ul bilatéral de la ligne médiane. Utiliser une seringue Hamilton relié au cadre stéréotaxique avec un micro-capillaire de verre (100 micromètres (um) de diamètre externe (OD)). Ouvrez la dure attentivement avec la pointe d&#39;une aiguille, et insérez le capillaire en verre stéréotaxique 2 millimètres (mm) dans la moelle épinière traumatisé. </li><li> Après l&#39;injection tiers du volume, retirez l&#39;aiguille à 1,5 mm de profondeur, et après un nouveau tiers-1 mm. Après l&#39;injection de la totalité du volume, et avant le retrait de la seringue, attendre 5 minutes afin de stabiliser la formation de gel. </li><li> Pour générer PNJ, utilisez la souris adulte DsRed (ou souris positives YFP, vert) et isoler et les cultiver de la zone paraventrical 4,18,21. </li><li> Évaluer la viabilité de NPC par coloration au bleu Trypan indiquant la présence de ~ 90% de cellules vivantes dans la suspension de cellules. Diluer les cellules dans un milieu de croissance (50 x 103 cellules vivantes / ul), puis les utiliser pour une transplantation de cellules. </li><li> Assurez-quatre 2 pi (8 pi vo totalelume, contenant 4 x 10 5 PNJ) injections intraspinales bilatéralement à 2 mm rostrale et caudale du site de la lésion. Après ouverture de la dure-mère, à insérer le micro-capillaire de Hamilton verre 1,5 mm sous la surface dorsale de la moelle épinière et injecter 2 ul de la suspension cellulaire. Choisissez un taux d&#39;injection à environ 0,5 pl / min (min). </li><li> A la fin de chaque injection et avant le retrait du capillaire sur le cordon, attendre au moins une minute tissu étirage permettant d&#39;accueillir le nouveau volume de la cellule. (Figure 2) </li></ol> 3. Implantation de sous-dural Pompes pour Growth Factor application <ol><li> Afin d&#39;enrichir le liquide céphalo-rachidien (LCR) avec des facteurs de croissance soutenir la survie cellulaire, utiliser des micro-osmotique pompes dilution des facteurs de croissance sous-durally tout au long de 7 à 14 jours, avec un taux de dilution de 0,5 ul / h, un diamètre de cathéter de 0,04 OD cm, et un volume de réservoir de 100 ul. </li><li> Choisissez facteurs de croissance préférés(Par exemple, le cerveau facteur de croissance dérivé (BDGF), le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur de croissance des fibroblastes (FGF)), à remplir les pompes 10.06 h implantation avant, et équilibrer pompes dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Immédiatement après injections NPC, préparer une cavité sous-cutanée de placer la pompe. Endroits préférés sont les flancs latéraux de thoraco région abdominale en évitant l&#39;inconfort local majeur causé par la pompe elle-même. </li><li> Pour obtenir la plus forte concentration de facteurs de croissance, se assurer que la pointe ouverte du cathéter se termine à proximité du site de la lésion. Par conséquent, effectuer un saut-laminectomie du niveau supérieur ou inférieur adjacent. Par exemple, si la SCI est au C7 / T1, effectuer une petite laminectomie C5. </li><li> Mettez la pompe dans la cavité sous-cutanée, de raccourcir le cathéter à la longueur nécessaire, et le fixer avec plusieurs sutures (6,0) sur les muscles paravertébraux évitant toute dislocation mouvement associé. </li><li> Après l&#39;ouverture de la dure-mère (par exemple, à C5) avec le bout pointud&#39;une aiguille, introduire le cathéter dans l&#39;espace sous-dural et laissez-le glisser dans une direction caudale sans résistance et sans blesser le cordon. La lame de sautée par exemple C6 sert point de fixation et la stabilisation du cathéter supplémentaire. </li><li> Assurez-vous que le cathéter fonctionne bien et ne plie pas. </li><li> Fermer muscles par couche, et la peau, avec des sutures ou des clips. (Figure 3) </li><li> Arrêtez l&#39;anesthésie et de laisser le sillage des animaux sous votre observation continue jusqu&#39;à ce qu&#39;il reprenne conscience suffisante pour décubitus sternal. Enfin, les remettre dans une seule cage et suivez les directives de traitement post-opératoires. </li><li> Fournir un traitement postopératoire spécial, même si, les animaux auraient récupéré en partie à ce point dans le temps: <ol><li> Administrer des analgésiques (Buprenorthine et Meloxicam pendant 3 jours et 5 jours, respectivement et selon les symptômes cliniques). </li><li> Fournir des antibiotiques dans des bouteilles d&#39;eau jusqu&#39;à 2 jours avant7 jours après la chirurgie (par exemple moxifloxacine). </li><li> Continuez à comprimer la vessie, se il est encore nécessaire. </li><li> Donnez fluides sous-cutanés supplémentaires, si les rats apparaissent déshydraté. </li><li> Gardez observant la fonction neurologique et l&#39;état physiologique des animaux opérés au moins une fois par jour. </li><li> Administrer un traitement immunosuppresseur deux jours injection PNJ préalable et jusqu&#39;à sept jours après transplanation (minocycline) et jusqu&#39;au sacrifice (Sandimmune), respectivement. </li></ol></li></ol> 4. évaluation de tissus <ol><li> Sacrifice des animaux à la fin de la période d&#39;observation (par ex. 4 semaines après la SCI) en anesthésie profonde (isoflurane à 5% pendant 2-3 min) et perfuser les transcardiaque avec 50 ml froid (4 ° C) suivie d&#39;une solution saline froide 150 ml 4 % de paraformaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Retirer la moelle épinière et le mettre dans 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS) pendant 24 heures. </li><li&gt; Mettez la moelle épinière dans une solution de saccharose de 25% pour cryoprotection pendant 48 heures. </li><li> Fournir cryosections longitudinales avec une épaisseur de &lt;30 pm. </li><li> Pour la coloration immunohistochimique de tous les noyaux cellulaires offrant une utilisation de fond DAPI (1: 1000). PNJ positifs DsRed apparaissent en rouge, QL-six FITC apparaît en vert, et les deux donc pas besoin d&#39;être teinté spécialement. (Figure 4). </li><li> Pour la microscopie électronique à balayage (MEB) permettent échantillons tremper dans glutaraldéhyde à 4 ° C pendant 2 heures, déshydratent les lentement en 10 étapes d&#39;incrémentation% d&#39;éthanol pendant 5 min et les placer dans un liquide sous pression CO 2 siphon pendant 1 heure. échafaudages Coat avec de l&#39;or à l&#39;aide d&#39;une coucheuse de pulvérisation. Prenez des photos avec un microscope électronique à balayage Hitachi S-3400N. (Figure 5) </li></ol>

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Clip design, behavioral outcomes, and histopathology.</a> J Neurotrauma. 19, 175-190 (2002).</li><li>Cigognini, D., Satta, A., Colleoni, B., Silva, D., Doneg&#224;, M., Antonini, S., Gelain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+early+and+late+effects+into+the+acute+spinal+cord+injury+of+an+injectable+functionalized+self-assembling+scaffolds.">Evaluation of early and late effects into the acute spinal cord injury of an injectable functionalized self-assembling scaffolds.</a> PLoS One. 6 (5), e19782 (2011).</li><li>Hou, T., Wu, T., Wang, L., Liu, Y., Li, M., Long, Z., Chen, H., Li, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+prostheses+fabricated+with+motor+neurons+seeded+in+self-assembling+peptides+promotes+partial+functional+recovery+afters+spinal+cord+injury+in+rats.">Cellular prostheses fabricated with motor neurons seeded in self-assembling peptides promotes partial functional recovery afters spinal cord injury in rats.</a> Tissue eng Part A. 18 (9-10), (2012).</li><li>Gelain, F., Cigognini, D., Caprini, A., Silva, D., Colleoni, B., Doneg&#224;, M., Antonini, S., Cohen, B. 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I., Carmody, M. A., Steinmetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+growth+factors+in+the+management+of+spinal+cord+injury.">Potential role of growth factors in the management of spinal cord injury.</a> World Neurosurg. (13), 1875-8750 (2013).</li><li>Kojima, A., Tator, C. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+trasplantation+of+adult+neural+presursor+cells+promotes+remyelination+and+functional+neurological+recovery+after+spinal+cord+injury.">Delayed trasplantation of adult neural presursor cells promotes remyelination and functional neurological recovery after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 26 (13), 3377-3389 (2006).</li><li>Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+neurite+outgrowth+by+neurotrophins+delivered+from+degradable+hydrogels.">Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 452-459 (2006).</li></ol>

Covidien supplied the QL6 SAP for this study.

Ce protocole a été développé pour permettre au lecteur de réaliser un modèle de lésion cervicale chez les rats et d&#39;utiliser une approche de traitement combiné avec les PAS et les PNJ favorisant une meilleure récupération après cervicale SCI. Surtout en comparaison à d&#39;autres modèles de traumatismes cervicaux, comme le (hémi) -transection modèle ou les modèles de chute de poids et une commotion cérébrale, le clip contusion / modèle de compression représente à la ...

Plus de 50% des lésions de la moelle épinière sont liés à la colonne cervicale. Dans la mise en clinique deux mécanismes physiopathologiques principaux sont décrits: le premier contusion de la moelle épinière et ensuite, la compression permanente causée par des fractures osseuses, des hémorragies ou de gonflement des tissus. Les mimétiques contusion / modèle de compression du clip d&#39;anévrisme deux mécanismes physiopathologiques: encliquetage du clip produit une contusion et la durée de coupure correspond à la composante de compression, en admettant que la compression dans les milieux cliniques causés par des fractures osseuses, des hémorragies ou de gonflement des tissus dernière étape de plus. Le clip d&#39;anévrisme utilisé est modifié par un ressort annulaire garantissant force de pincement exacte et reproductible. Surtout en comparaison avec l&#39;hémi-transection ou le modèle de contusion, ce clip d&#39;anévrisme imite modèle meilleurs paramètres cliniques. Bien que les patients souffrant de lésions thoraciques souffrent de paraplégie, la plupart des patients avec inj col de l&#39;utérusuries sont tétraplégique et complètement dépendante. La structure anatomique de la moelle cervicale, cependant, montre des différences significatives par rapport à la thoracique ou lombaire, et donc, se adresse en particulier dans ce protocole. Le développement des cavités médullaires et des cicatrices de tissus sont des obstacles pour la récupération et la régénération. Pour surmonter ces obstacles à l&#39;utilisation de matériel d&#39;échafaudage est une approche prometteuse. peptides auto-assemblage peuvent être injectés directement dans l&#39;épicentre de la lésion. Là, ils se assemblent en échafaudages nano-fibres de transition de la cavité et à améliorer l&#39;environnement en réduisant l&#39;inflammation inhibitrice et effarouchement des tissus. Bien que les matériaux rigides provoquent des dommages considérables de la moelle épinière lors de l&#39;implantation, les peptides peuvent être injectés de fluide en toute sécurité et sans dommage sévère supplémentaire. Amélioration de l&#39;environnement d&#39;inhibition avec des peptides d&#39;auto-assemblage avant la transplantation de cellules souches, par conséquent, supporte la cellule iNTÉGRATION, la différenciation et, enfin, la récupération fonctionnelle après lésion de la moelle épinière cervicale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="541">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:268px;">Company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aneurysmal clip</td>
			<td>SharpTech</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro injection system</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small animal stereotaxic instrument</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Subdural pumps</td>
			<td>Alzet osmotic micro pump 1007D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical instrument</td>
			<td>Fine Science tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane USP</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.9% Sodium Chloride injection USP</td>
			<td>Baxter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7.5% Povidone iodine</td>
			<td>Purdue Pharma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Isopropyl alcohol USP</td>
			<td>GreenField Ethanol Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QL6 SAP</td>
			<td>Covidien</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.4% Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibroblast Growth Factor (FGF)</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synergetic use of neural precursor cells and self-assembling peptides in experimental cervical spinal cord injury

Lésions de la moelle épinière (SCI) provoquent des troubles neurologiques graves et les conséquences psychologiques, économiques et sociales pour les patients et leurs familles. Cliniquement, plus de 50% de la SCI affecte la colonne cervicale 1. En conséquence de la lésion primaire, une cascade de mécanismes secondaires, y compris l&#39;inflammation, l&#39;apoptose et la démyélinisation se produisent finalement conduit à la cicatrisation des tissus et du développement de cavités intramédullaires 2,3. Tous deux représentent des barrières physiques et chimiques à la transplantation de cellules, l&#39;intégration et la régénération. Par conséquent, l&#39;environnement de mise en forme et d&#39;inhibition de pontage cavités pour créer un milieu propice à la transplantation de cellules et de régénération est une cible thérapeutique prometteuse 4. Ici, un modèle contusion / compression du col de l&#39;utérus SCI en utilisant un clip à anévrisme est décrite. Ce modèle est plus cliniquement pertinent que d&#39;autres modèles expérimentaux, puisque section complète ou ruptures du cordon sont rares. Toujours dans COMPARAISOn au modèle de perte de poids, ce qui en particulier les dommages colonnes de dos, la compression circonférentielle de la moelle épinière apparaît avantageux. force de fermeture Clip et la durée peuvent être ajustées pour obtenir différente gravité des blessures. Un ressort annulaire facilite étalonnage précis et la constance de pince vigueur. Dans des conditions physiologiques, les peptides d&#39;auto-assemblage synthétiques (SAP) auto-assembler en nanofibres et donc, lancent un appel pour l&#39;application de la SCI 5. Ils peuvent être injectés directement dans la lésion en minimisant les dommages au cordon. PAS sont des structures biocompatibles ériger des échafaudages pour combler les cavités médullaires et donc, équiper le cordon endommagé pour des traitements régénérateurs. K2 (QL) 6K2 (NQ6) est un roman de SAP introduit par Dong et un l. 6 En comparaison à d&#39;autres peptides, NQ6 auto-assemble en β-feuilles à pH neutre 6 0,14 jours après la SCI, après la phase aiguë, PAS sont injectés dans le centre de la lésion et les cellules précurseurs neurales (NPC) sont injeDECT dans les colonnes dorsales adjacentes. Afin de soutenir la survie des cellules, la transplantation est combinée avec l&#39;administration sous-dural continue de facteurs de croissance de micro-pompes osmotiques pendant 7 jours.

<html> Lors de l&#39;exécution de la procédure décrite ci-dessus, vous obtiendrez un SAP échafaudage combler la cavité et offrant une amélioration de l&#39;environnement inhibitrice, moins effarouchement des tissus et une augmentation de la survie de l&#39;APN. La figure 4 montre une section longitudinale d&#39;une moelle épinière de rat obtenu au site de la lésion six semaines après SCI et quatre semaines après l&#39;injection NQ6 SAP et PNJ transplantation. Peptides NQ6 ont été injectés a...

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Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Utilisation synergique des cellules neurales précurseurs et peptides d&#39;auto-assemblage dans la partie expérimentale moelle épinière cervicale blessures

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

synergetic-use-neural-precursor-cells-self-assembling-peptides

Research

JoVE Journal

Medicine

9.1K vues.  University Health Network, Krembil Neuroscience Centre. Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established. 

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Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) cases 1 and is the ultimate cause of death in patients with the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS) 2.
ALS is a devastating neurological disorder that is characterized by relatively rapid degeneration of upper and lower motor neurons. Patients ultimately succumb to the disease on average 2-5 years following diagnosis because of respiratory paralysis due to loss of phrenic motor neuron innnervation of the diaphragm 3. The vast majority of cases are sporadic, while 10% are of the familial form. Approximately twenty percent of familial cases are linked to various point mutations in the Cu/Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) gene on chromosome 21 4. Transgenic mice 4,5 and rats 6 carrying mutant human SOD1 genes (G93A, G37R, G86R, G85R) have been generated, and, despite the existence of other animal models of motor neuron loss, are currently the most highly used models of the disease.
Spinal cord injury (SCI) is a heterogeneous set of conditions resulting from physical trauma to the spinal cord, with functional outcome varying according to the type, location and severity of the injury 7. Nevertheless, approximately half of human SCI cases affect cervical regions, resulting in debilitating respiratory dysfunction due to phrenic motor neuron loss and injury to descending bulbospinal respiratory axons 1. A number of animal models of SCI have been developed, with the most commonly used and clinically-relevant being the contusion 8.
Transplantation of various classes of neural precursor cells (NPCs) is a promising therapeutic strategy for treatment of traumatic CNS injuries and neurodegeneration, including ALS and SCI, because of the ability to replace lost or dysfunctional CNS cell types, provide neuroprotection, and deliver gene factors of interest 9.
Animal models of both ALS and SCI can model many clinically-relevant aspects of these diseases, including phrenic motor neuron loss and consequent respiratory compromise 10,11. In order to evaluate the efficacy of NPC-based strategies on respiratory function in these animal models of ALS and SCI, cellular interventions must be specifically directed to regions containing therapeutically relevant targets such as phrenic motor neurons. We provide a detailed protocol for multi-segmental, intraspinal transplantation of NPCs into the cervical spinal cord ventral gray matter of neurodegenerative models such as SOD1G93A mice and rats, as well as spinal cord injured rats and mice 11.

Neural precursor transplantation is a promising strategy for protecting and/or replacing lost/dysfunctional cervical phrenic motor neurons in spinal cord injury (SCI) and the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS). We provide a protocol for cell delivery to cervical spinal cord ventral horn in rodent models of ALS and SCI.

Cell Transplantation intraspinale pour le ciblage du col corne ventrale de la sclérose latérale amyotrophique et les lésions de la moelle épinière

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) ...

Recherche

Médecine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory testing in rat SCI models is needed. However, until recently, no single testing approach had been validated for SCI so that standardized methods have not been implemented across labs. Additionally, available testing methods could not be implemented acutely or when severe motor impairments existed, preventing studies of the development of SCI-induced allodynia3. Here we present two validated sensory testing methods using von Frey Hair (VFH) monofilaments which quantify changes in tactile sensory thresholds after SCI4-5. One test is the well-established Up-Down test which demonstrates high sensitivity and specificity across different SCI severities when tested chronically5. The other test is a newly-developed dorsal VFH test that can be applied acutely after SCI when allodynia develops, prior to motor recovery4-5. Each VFH monofilament applies a calibrated force when touched to the skin of the hind paw until it bends. In the up-down method, alternating VFHs of higher or lower forces are used on the plantar L5 dermatome to delineate flexor withdrawal thresholds. Successively higher forces are applied until withdrawal occurs then lower force VFHs are used until withdrawal ceases. The tactile threshold reflects the force required to elicit withdrawal in 50% of the stimuli. For the new test, each VFH is applied to the dorsal L5 dermatome of the paw while the rat is supported by the examiner. The VFH stimulation occurs in ascending order of force until at least 2 of 3 applications at a given force produces paw withdrawal. Tactile sensory threshold is the lowest force to elicit withdrawal 66% of the time. Acclimation, testing and scoring procedures are described. Aberrant trials that require a retest and typical trials are defined. Animal use was approved by Ohio State University Animal Care and Use Committee.

We describe two tactile sensory testing methods for acute or chronic periods of spinal cord injury in rats. These validated procedures can detect the development and maintenance of allodynia-like sensations.

Aiguë et chronique Test tactile sensorielle après un traumatisme médullaire chez le rat

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

Un modèle de contusion unilatérale des blessures moelle épinière cervicale aide de l&#39;impacteur Infinite Horizon

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Use of genetically modified mice enhances our understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders such as a spinal cord injury (SCI). Freehand manual control used to produce a laceration model of SCI creates inconsistent injuries often associated with a crush or contusion component and, therefore, a novel technique was developed. Our model of cervical laceration SCI has resolved inherent difficulties with the freehand method by incorporating 1) cervical vertebral stabilization by vertebral facet fixation, 2) enhanced spinal cord exposure, and 3) creation of a reproducible laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm in depth without associated contusion. Compared to the standard methods of creating a SCI laceration such as freehand use of a scalpel or scissors, our method has produced a consistent lesion. This method is useful for studies on axonal regeneration of corticospinal, rubrospinal, and dorsal ascending tracts.

A novel technique to create a reproducible in vivo model of cervical spinal cord laceration injury in the mouse is described. This technique is based on spine stabilization by fixation of the cervical facets and laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm.

Contrôlé blessures de lacération du col chez la souris

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment (RMCA) in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination is disrupted by spinal cord injury (SCI), control of respiratory muscles innervated below the injury level is compromised1,2 leading to respiratory muscle dysfunction and pulmonary complications. These conditions are among the leading causes of death in patients with SCI3. Standard pulmonary function tests that assess respiratory motor function include spirometrical and maximum airway pressure outcomes: Forced Vital Capacity (FVC), Forced Expiratory Volume in one second (FEV1), Maximal Inspiratory Pressure (PImax) and Maximal Expiratory Pressure (PEmax)4,5. These values provide indirect measurements of respiratory muscle performance6. In clinical practice and research, a surface electromyography (sEMG) recorded from respiratory muscles can be used to assess respiratory motor function and help to diagnose neuromuscular pathology. However, variability in the sEMG amplitude inhibits efforts to develop objective and direct measures of respiratory motor function6. Based on a multi-muscle sEMG approach to characterize motor control of limb muscles7, known as the voluntary response index (VRI)8, we developed an analytical tool to characterize respiratory motor control directly from sEMG data recorded from multiple respiratory muscles during the voluntary respiratory tasks. We have termed this the Respiratory Motor Control Assessment (RMCA)9. This vector analysis method quantifies the amount and distribution of activity across muscles and presents it in the form of an index that relates the degree to which sEMG output within a test-subject resembles that from a group of healthy (non-injured) controls. The resulting index value has been shown to have high face validity, sensitivity and specificity9-11. We showed previously9 that the RMCA outcomes significantly correlate with levels of SCI and pulmonary function measures. We are presenting here the method to quantitatively compare post-spinal cord injury respiratory multi-muscle activation patterns to those of healthy individuals.

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment RMCA in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

The purpose of this publication is to present our original work on a multi-muscle surface electromyographic approach to quantitatively characterize respiratory muscle activation patterns in individuals with chronic spinal cord injury using vector-based analysis.

Evaluation de l&#39;activation des muscles respiratoires aide respiratoire évaluation du contrôle moteur (MRAC) chez les personnes atteintes de maladies chroniques Spinal Cord Injury

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

Un modèle murin de la moelle épinière cervicale blessures à étude post-lésionnelle respiratoire neuroplasticité

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Contrôlée corticale modèle d&#39;impact pour Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter connected to a radio transmitter into the femoral artery of rats that underwent a T4 spinal cord transection with or without grafting of embryonic brainstem-derived neural stem cells expressing green fluorescent protein. Compared to other methods such as cannula insertion or tail-cuff, telemetry is advantageous to continuously monitor blood pressure and heart rate in freely moving animals. It is also capable of long term multiple data acquisitions. In spinal cord injured rats, basal cardiovascular data under unrestrained condition and autonomic dysreflexia in response to colorectal distension were successfully recorded. In addition, cardiovascular parameters before and after SCI can be compared in the same rat if a transmitter is implanted before a spinal cord transection. One limitation of the described telemetry procedure is that implantation in the femoral artery may influence the blood supply to the ipsilateral hindlimb.

We present a protocol for using a radio-telemetric system to record cardiovascular parameters in T4 spinal cord transected rats eight weeks after embryonic brainstem neural stem cell grafting into the lesion site. Telemetry is an advanced technique to accurately evaluate cardiovascular function in conscious freely moving spinal cord injured rats.

Un système de radio-télémétrique de surveiller la fonction cardiovasculaire chez le rat avec la moelle épinière Transection et embryonnaires souches neurales greffes cellulaires

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

Neural Transplantation de cellules souches dans la partie expérimentale Modèle contusion de la moelle épinière des blessures

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The calibrated forceps model of compression injury is a convenient, low cost, and very reproducible animal model for SCI. We used a pair of modified forceps in accordance with the method published by Plemel et al. (2008) to laterally compress the spinal cord to a distance of 0.35 mm. In this video, we will demonstrate a dorsal laminectomy to expose the spinal cord, followed by compression of the spinal cord with the modified forceps. In the video, we will also address issues related to the care of paraplegic laboratory animals. This injury model produces mice that exhibit impairment in sensation, as well as impaired hindlimb locomotor function. Furthermore, this method of injury produces consistent aberrations in the pathology of the SCI, as determined by immunohistochemical methods. After watching this video, viewers should be able to determine the necessary supplies and methods for producing SCI of various severities in the mouse for studies on SCI and/or treatments designed to mitigate impairment after injury.

Spinal cord injury models should be highly reproducible. We demonstrate that the calibrated forceps compression model of spinal cord injury is an easy to use surgical method for generating reproducible injuries to the murine spinal cord.

Calibré Forceps modèle de compression de la moelle épinière des blessures

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...