Nous remercions le Rat des ressources et Centre de recherche de l&#39;Université du Missouri, Columbia, Missouri, pour fournir des rats GFP; Neuralstem Inc. pour fournir des cellules souches neurales humaines. Ce travail a été soutenu par l&#39;Administration des anciens combattants, le NIH (NS09881), Canadian Spinal Research Organization, la Fondation Craig H. Nielsen, et le Bernard et Anne Spitzer Charitable Trust.

Tous les protocoles d&#39;animaux sont approuvés par VA-San Diego institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité (IACUC). Directives du NIH pour laboratoire soins et la sécurité des animaux sont strictement suivies. Les animaux ont un accès libre à la nourriture et de l&#39;eau tout au long de l&#39;étude et sont convenablement traitées pour minimiser la douleur et l&#39;inconfort. 1. Préparation de fibrine composants contenant du facteur de croissance Cocktails <ol><li> Dissoudre 25 mg de fibrinogène de rat dans 0,5 ml de PBS pour obtenir 50 mg / ml solution stock 2x (voir le tableau des matériaux). Le fibrinogène est difficile à dissoudre, et doit être placé dans un incubateur à bain-marie ou à 37 ° et on l&#39;agite tout 5-10 min pendant 1-2 heures. </li><li> Dissoudre 100 thrombine rat des Nations Unies dans 2 ml de 10 mM stérile CaCl 2 pour obtenir 50 U / ml 2x solution stock. </li><li> Dissoudre les facteurs de croissance dans du PBS aux concentrations suivantes pour obtenir une solution de 100 pi de stock: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (concentration élevée d&#39;actions en perfusion intrathécale in vivo <sup&gt; 19); 200 pg / ml: GDNF; IGF; bFGF; FEM; PDGF; aFGF; HGF (environ 1000 x supérieur à celui utilisé pour la culture de cellules). </li><li> Dissoudre 25 mg MDL28170 (inhibiteur de calpaïne) dans 1,3 ml de DMSO pour obtenir mM DMSO solution stock 50, puis diluer 50 fois dans du PBS pour obtenir une solution mM. </li><li> Mélanger 100 ul de chacune des composantes du facteur de croissance et de 100 pi de MDL28170 (Traduction de solution à 1 mM) pour produire une solution du facteur de croissance de cocktail 1000 pi (figure 1). </li><li> Mélanger 500 pi fibrinogène 2x solution mère avec une croissance de 500 pi facteur cocktail pour obtenir une solution à 25 mg / ml de travail fibrinogène contenant des facteurs de croissance et aliquote dans 10 ou 20 pi pour le stockage à -70 ° C. La solution est stable pendant jusqu&#39;à 12 mois à -70 ° C. </li><li> De même, mélanger 500 pi thrombine 2x de solution concentrée avec 500 pi facteur de croissance cocktail pour obtenir une solution de travail 25 U / ml de thrombine contenant des facteurs de croissance et en volumes aliquote de 10 ou 20 pi similaires pour le stockage d&#39;unet -70 ° C pendant jusqu&#39;à 12 mois. </li><li> Le jour de la greffe, placer cocktails de fibrinogène et de facteur de croissance contenant de la thrombine sur de la glace jusqu&#39;à obtenir un mélange avec des cellules. </li></ol> 2. T3 moelle épinière Transection <ol><li> Anesthésier les femmes adultes rats Fischer 344 ou rats nus thymoprives utilisant des méthodes acceptables. Les sujets sont profondément anesthésiés, quand la réactivité à la queue et la patte de pincement sont totalement absents. Remarque: Nous utilisons généralement 150-200 g rats Fischer ou 180-220 g rats athymiques, et un cocktail d&#39;anesthésie (2 ml / kg) de kétamine (25 mg / ml), la xylazine (1,3 mg / ml) et l&#39;acépromazine (0,25 mg / ml). </li><li> Appliquer une pommade oculaire à prévenir la sécheresse ou de blessure des yeux tandis que les animaux sont sous anesthésie. </li><li> Raser la région thoracique supérieure et nettoyer la peau à la Bétadine. </li><li> Coupez la peau et des muscles en utilisant # 15 lame, exposer T3 vertèbre en utilisant un écarteur chirurgical, et d&#39;effectuer une laminectomie au T3 vertèbre pour exposer T3 / 4 de la moelle épinière en utilisant un rongeur. </li><li> Faire une londinale incision médiane dans la dure-mère d&#39;environ 2 mm de longueur à l&#39;aide d&#39;une lame n ° 11. </li><li> Placez iridectomie ciseaux sous la dure-mère à couper le latéral droit toute la moelle épinière. Faire une autre coupe du même côté 1,5 mm plus cadually. </li><li> Aspirer le tissu de la moelle épinière entre les deux segments de coupe avec une aiguille 23 G émoussé connecté à vide d&#39;intensité modérée. Utilisez vérification visuelle pour s&#39;assurer section complète sur le ventre et latéralement. Cela viendra compléter une hémisection latérale. </li><li> Pour prolonger la lésion à une résection pleine largeur moelle épinière, placez incisions de miroir dans le hemicord gauche. Tenter de laisser la dure-mère intacte, autre que la première coupe, pour retenir la matrice greffé / fibrine solide dans le site de la lésion lorsque greffé deux semaines plus tard. </li><li> Suturer le muscle, appliquer la poudre antibiotique et agrafer la peau. </li><li> Injecter lactate (3 ml) de Ringer, Bannamine (2,5-5 mg / kg) et l&#39;ampicilline (80-100 mg / kg) (voir le tableau des matériaux) immédiatement après la chirurgie et mairats ntain dans un incubateur chaud jusqu&#39;à ce que la thermorégulation est rétablie. </li><li> Vider la vessie et injecter la solution de Ringer et ampicilline deux fois par jour pendant environ deux semaines jusqu&#39;à ce que la mise en place de la vessie réflexe de vidange (figure 1B). </li></ol> 3. Préparation de la Journée fraîchement dissociées embryonnaire 14 moelle épinière Neural Stem Cells <ol><li> Obtenir consanguins transgéniques GFP rats F344 (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) de ressources et Rat Research Center, University of Missouri. </li><li> Injecter 40 ug des-Gly 10, [D-Ala 6]-Leuteinizing Hormone Releasing Hormone ethylamide (LHRH) dilué dans du PBS à une concentration de 200 pg / ml par voie intrapéritonéale (IP) par rat femelle mature (8 semaines ou plus) après 2 lumière induction -3 h pour la synchronisation de collecte d&#39;embryons. </li><li> S&#39;accoupler avec une GFP nuit de rat maturité homozygote ou hétérozygote mâle 4 jours après l&#39;injection. </li><li> Recueillir des embryons à jours de 13,5 à 14,5 coït(PC) dans un tampon HBSS froid, examiner l&#39;expression de la GFP sous un des verres &quot;Nightsea&quot; lampe de poche et de filtrage (BLS1 - BlueStar Lampe de poche et filtre barrière Modèle VG1) ou un microscope à fluorescence. </li><li> Disséquer la moelle épinière dans des conditions aseptiques de chaque fœtus GFP-positives et éliminer méninges qui recouvrent et attaché ganglions rachidiens avec des ciseaux iridectomie et bijoutiers pince fine. </li><li> Recueillir les moelles épinières disséqués en 2 ml de tampon HBSS froid dans un tube de 15 ml Cornical et garder sur la glace. </li><li> Suivez référence n ° 20 à dissocier la moelle épinière disséqués: <ol><li> Brièvement, ajouter 2 ml de 0,25% de trypsine-EDTA dans le tube contenant la moelle épinière disséquées (plusieurs cordons peuvent être digérés ensemble, une corde peut générer suffisamment de cellules pour une greffe de matière) et à digérer à 37 ° C pendant 10 à 12 min. </li><li> Arrêter la réaction de la trypsine en ajoutant 10 ml de DMEM contenant 10% de FBS dans le tube et centrifuger le tissu à 2 500 rpm pendant 2 min. </li><li> Reprendre le tissu dans 2 ml Neurobasal milieu de containing 2% B27, et triturer le tissu de la moelle épinière en utilisant progressivement plus petites pipettes Pasteur poli-feu. </li><li> Centrifuger les cellules à 2500 rpm pendant 2 min, remettre en suspension dans 2 ml de milieu Neurobasal contenant B27, et des cellules de filtration d&#39;un filtre à tamis cellulaire de 40 pm. </li></ol></li><li> Compter les cellules avec un hémocytomètre et diviser les cellules de façon égale en deux tubes Eppendorf. </li><li> Centrifuger les cellules et supprimer complètement surnageant (1-2 min sont tenus de retirer tout surnageant avec une pointe à vide faible) de sorte que les cocktails de facteurs de croissance ne seront pas dilués par surnageant restant après cellule re-suspension. </li><li> Remettre en suspension chaque moitié des cellules dans le fibrinogène ou de la solution de travail de thrombine contenant les facteurs de croissance, respectivement, à une concentration de 250 000 cellules / ul (les chiffres de culots cellulaires d&#39;environ ⅓ volume final) et les placer sur de la glace transplantation antérieur (figure 1A). Notez que le fibrinogène peut spontanément gel lorsqu&#39;il est mélangé avec cellules avant de combiner avec de la thrombine sur le site lésion / greffe; pour éviter une gélification prématurée, mélanger cellules fibrinogène immédiatement avant la greffe de cellules in vivo. </li></ol> 4. Transplantation <ol><li> Réexposer la lésion T3 / 4 de la moelle épinière, deux semaines après résection de la moelle épinière. </li><li> 5-fibrinogène et des cellules de 5 ul des cellules de la thrombine ul pourraient être injectés directement dans neuf points du site de la lésion à travers le tissu de cicatrice et dure-mère intacte étanche sans ré-ouvrir le site de la lésion. </li><li> Utilisez une aiguille 27 G pour créer 9 trous sur la surface du tissu cicatriciel et la durée intact 1-2 semaines après la lésion: 3 dans le centre (un point milieu et deux latérales dans, et espacées de 0,5 mm de distance) et 3 dans les deux rostrale et 3 à l&#39;interface caudale (environ 0,5 mm rostral ou caudale par rapport à l&#39;axe de la lésion). </li><li> Puis injecter la moitié du volume de solution de cellule de fibrinogène en trois points centraux du site de la lésion et un volume de quart en trois points de l&#39;interface rostrale et aqvolume de TRIMESTRE en 3 points de l&#39;interface caudale. </li><li> Puis, injecter immédiatement cellules throbmbin dans les mêmes endroits. Le mélange de cellules de fibrinogène et de la thrombine de cellules à l&#39;intérieur du site de la lésion va former un gel de fibrine pour maintenir les cellules dans le site de la lésion et les cocktails de facteurs de croissance supportant la survie des cellules. Les cellules sont injectées à l&#39;aide de pipettes de verre tiré connectés à un Picospritzer (General Valve, Inc.). </li><li> Transplantation CNS humaines en culture 21 dans la même procédure décrite ci-dessus, et utiliser la fibrine et le facteur de croissance cocktails à base de réactifs d&#39;origine humaine. </li></ol>

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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

L&#39;un des principaux obstacles pour NSC transplantation de la moelle épinière est faible taux de survie dans le centre de la lésion. Des lacunes ou des cavités dans le site de la lésion pourraient réduire ou affaiblir la formation de relais neuronaux fonctionnels entre les axones et supraspinales séparés segments de la moelle épinière en dessous de la blessure. En outre, la faible survie des greffés CNS pourrait influer sur leur intégration avec les tissus de l&#39;hôte, et donc de réduire la connectivi...

Lésions de la moelle épinière (SCI) souvent des dommages non seulement étendues de la substance blanche qui transportent les signaux de et vers le cerveau, mais aussi la substance grise centrale, causant la perte segmentaire des interneurones et les neurones moteurs. La conséquence de la SCI est la perte à la fois de la fonction motrice et sensorielle dessous de la lésion. Malheureusement, le système nerveux central adulte (CNS) ne se régénère pas spontanément, entraînant des déficits fonctionnels permanents 1. Par conséquent, la reconstruction de l&#39;adulte blessé de la moelle épinière et l&#39;amélioration des moteurs, sensoriels et la fonction autonome est un objectif important de la recherche SCI. Les cellules souches neurales (NSC), que ce soit directement isolé à partir de l&#39;embryon ou du SNC adulte, sont des cellules candidats convaincants pour remplacer les neurones perdus et les cellules gliales. En outre, ces cellules ont la capacité de former de nouveaux relais fonctionnels pour rétablir la conduction axonale à travers une 2,3 de site de la lésion. À ce jour, il n&#39;a pas été avoir détaillé le anatomique, electrophysiologiques et effets comportementaux de la formation des neurones de relais par NNC transplantés après la grave SCI. Il ya plusieurs raisons à cela: d&#39;abord, NNC ou tissu transplanté CNS fœtale survivre mal quand greffé dans de grandes cavités de la lésion. Des études antérieures montrent une perte précoce des cellules importante, laissant de grands vides kystiques cavités de lésions 4,5. Dans certaines études, les cellules greffées seraient ensuite diviser et remplir la cavité de la lésion 4,5, mais cela peut se produire après un délai de quelques jours ou semaines, et après le remplissage du site de la lésion peuvent ne pas être complète ou cohérente. Deuxièmement, un système de suivi efficace qui fournit des données fiables sur la survie cellulaire, la différenciation / maturation, et l&#39;excroissance de transplanté CNS a fait défaut. La plupart des études antérieures utilisés antérograde et rétrograde étiquetage de retracer projections axonales des greffes 2,3. Cependant, ces techniques que partiellement et souvent peu claire projections axonales étiquetés provenant de cellules greffées et méthodes de traçage sont subjectivest pour les défauts causés par une fuite de colorant au-delà des cellules implantées. D&#39;autres groupes ont utilisé des marqueurs neuronaux spécifiques relatives à étiqueter projections axonales après la transplantation de NSC fœtus humains dans la moelle épinière lésée rongeur 5,6. Cependant, dans ces études, les xénogreffes ne survivent pas toujours bien. Récemment, la livraison virale du gène rapporteur GFP a été utilisé pour étiqueter CNS culture 7,8. Cependant, l&#39;expression GFP était souvent incompatible et peut être régulée à la baisse 7. Récemment, l&#39;utilisation de la souris ou de rats donneurs transgéniques exprimant de façon stable le gène rapporteur GFP, ou la phosphatase alcaline placentaire humaine, a considérablement amélioré le suivi des cellules souches neurales / progéniteurs transplantées in vivo 9,11. En troisième lieu, plusieurs études indiquent que NSCs de rat en culture in vitro, soit à partir de dérivés embryonnaires ou adultes du SNC différencier en lignées exclusivement gliales lorsqu&#39;elles sont transplantées dans le milieu de l&#39;adulte intacte ou lésée cor moelled 7,12,13, en dépit du fait que ces cellules souches neurales sont capables de se différencier en neurones et les cellules gliales in vitro, ce qui indique que les environnements locaux peuvent dicter le sort des cellules souches. Alternativement, les CNS de culture, en particulier ceux issus de la SNC adulte, peuvent avoir la propriété de defaulty intrinsèque à se différencier en lignées gliales in vivo 13. En raison des limitations évoquées ci-dessus, notre groupe a récemment développé un nouveau protocole pour améliorer le suivi embryonnaire NSC, la survie et la différenciation / maturation dans la moelle épinière adulte gravement blessé. En bref, nous avons commencé avec une ligne transgénique rat Fischer 344 de consanguinité stable exprimant un gène rapporteur de la GFP qui soutient expression de la GFP après transplantation in vivo 14. Ensuite, nous avons utilisé CNS fraîchement isolés du jour embryonnaire 14 Fischer 344 de la moelle épinière, un stade de développement qui conserve le potentiel de générer deux neurones et cellules gliales. Enfin, nous avons intégréNSCs fraîchement dissociées en une matrice de fibrine contenant des facteurs de croissance de 15 à 17 pour retenir les cellules et de les distribuer uniformément au sein d&#39;une grande cavité de lésion, en vue de soutenir la survie des cellules de greffe, de la différenciation et de l&#39;intégration. Les greffes ont été placées dans les sites de T3 section complète, deux semaines après la lésion de la moelle épinière. Ces cellules greffées constamment remplis sites de section complète et différenciées en neurones abondantes qui s&#39;étendait un grand nombre d&#39;axones en hôte de la moelle épinière sur de longues distances 18. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant des greffons en culture de cellules souches neurales humaines à des rats immunodéficientes 18.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibrinogen(rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F6755-25MG</td>
 <td>2 hr at 37 &deg;C to dissovle 
 Stock Concentration: 50 mg/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thrombin (rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T5772-100UN</td>
 <td>Dissovle in 10 mM CaCl2 
 Stock Concentration: 50 U/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bFGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F0291 (25 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGF (murine)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>E1257 (0.1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDNF(human)</td>
 <td>Peprotech</td>
 <td>452-02 (1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 1000 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 50 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT-3 (human)</td>
 <td>Peprotech</td>
 <td>452-03 (1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 1000 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 50 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GDNF (rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G1401 (10 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IGF-1(mouse)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>I8779 (50 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>aFGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F5542 (25 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PDGF-AA (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3076 (10 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H9661 (5 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MDL28170</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M6690 (25 mg)</td>
 <td>Stock in DMSO 
 Stock Concentration: 1 mM 
 Final Concentration: 50 &mu;M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>BSS-1005-B</td>
 <td>Stock Concentration: 1X 
 Final Concentration: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketamine</td>
 <td>Putney</td>
 <td>26637-411-01</td>
 <td>40-80 mg/kg 
 Stock Concentration: 100 mg/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylazine</td>
 <td>Lloyd</td>
 <td>0410,</td>
 <td>2.5-8 mg/ml 
 Stock Concentration: 100 mg/ml 
 Final Concentration: 1.3 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acepromazine</td>
 <td>Butler</td>
 <td>003845</td>
 <td>0.5-4 mg/ml 
 Stock Concentration: 10 mg/ml 
 Final Concentration: 0.25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Betadine</td>
 <td>Healthpets</td>
 <td>BET16OZ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ringers</td>
 <td>Abbott</td>
 <td>04860-04-10</td>
 <td>2-3 ml/inj</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Banamine</td>
 <td>Schering-Plough</td>
 <td>0061-0851-03</td>
 <td>2.5 -5 mg/kg 
 Stock Concentration: 50 mg/ml 
 Final Concentration: 0.5 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin</td>
 <td>Sandoz</td>
 <td>0781-3404-85</td>
 <td>80-100 mg/kg 
 Final Concentration: 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LH-RH</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L4513</td>
 <td>200 &mu;g/kg 
 Final Concentration: 200 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14175-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200056 </td>
 <td>Stock Concentration: 0.25 % 
 Final Concentration: 0.125 %</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11995073 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>16000044 </td>
 <td>Stock Concentration: 100 % 
 Final Concentration: 10 %</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal Medium</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21103049 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>17504044</td>
 <td>Stock Concentration: 100x 
 Final Concentration: 1x</td>
 </tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Note, use human reagents for grafts of human NSCs</td>
 </tbody>
</table>

promotion of survival and differentiation of neural stem cells with fibrin and growth factor cocktails after severe spinal cord injury

Les cellules souches neurales (NSC) peuvent s&#39;auto-renouveler et de se différencier en neurones et cellules gliales. CNS transplantés peuvent remplacer les neurones perdus et de la glie après une blessure de la moelle épinière (SCI), et peuvent former des relais fonctionnels de renouer segments de la moelle épinière au-dessus et au-dessous d&#39;une lésion. Des études antérieures de greffe de cellules souches neurales ont été limitées par la survie du greffon incomplète dans la cavité de lésion de la moelle épinière. En outre, le suivi de la survie des cellules de la greffe, la différenciation, et l&#39;extension du procédé n&#39;a pas été optimisée. Enfin, dans des études antérieures, NNC de rat en culture ont été typiquement rapportés à se différencier en cellules gliales lorsque greffé sur la moelle épinière lésée, plutôt que de neurones, à moins que le destin a été conduit à un type de cellule spécifique. Pour répondre à ces questions, nous avons développé de nouvelles méthodes pour améliorer la survie, l&#39;intégration et la différenciation des CNS à des sites de même sévère SCI. NSC ont été fraîchement isolés de jour embryonnaire 14 moelle épinière (E14) d&#39;une lignée transgénique stable Fischer 344 de rat exprimant fl vertuo-protéine (GFP) et ont été intégré dans une matrice de fibrine contenant des facteurs de croissance; cette formulation visant à conserver les cellules greffées dans la cavité de lésion et de soutenir la survie des cellules. NNC dans le cocktail fibrine / de facteur de croissance ont été implantés deux semaines après thoracique de niveau 3 (T3) complets transections de la moelle épinière, ce qui évite les périodes de pointe de l&#39;inflammation. Greffons résultant complètement remplis la cavité de la lésion et différenciées en neurones, les axones qui s&#39;étendaient dans l&#39;hôte de la moelle épinière sur remarquablement longues distances, et les cellules gliales. Les greffes de NNC humaines en culture exprimant la GFP ont abouti à des conclusions similaires. Ainsi, les méthodes sont définies pour l&#39;amélioration de la greffe de neurones sur les cellules souches, la survie et l&#39;analyse des résultats in vivo.

GFP marquage immunohistochimique démontre que NSC de rat greffé remises en suspension dans du tampon phosphate salin (PBS) (dépourvu d&#39;une matrice de fibrine et des facteurs de croissance) ont survécu mal dans le site de résection de T3, seule la fixation de la marge de lésion / hôte et en laissant la majeure partie du site de la lésion vide sans cellules greffées (Figure 2A). La survie de NNC améliorée en cas de co-greffé avec seulement des matrices de fibrine, mais la greffe n&#39;a pa...

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Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

des matrices de fibrine contenant des facteurs de croissance ont été utilisés pour conserver des cellules souches neurales dans des sites greffés complète de transection de la moelle épinière. Cellules greffées complètement remplis la cavité de la lésion et différenciées en plusieurs types de cellules neurales, y compris les neurones qui s&#39;étendaient axones dans la moelle épinière hôte sur de longues distances.

Promotion de la survie et de la différenciation des cellules souches neurales de fibrine et du facteur de croissance Cocktails après Spinal Cord Injury sévère

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

promotion-survival-differentiation-neural-stem-cells-with-fibrin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.3K vues.  Veterans Administration Medical Center, San Diego.  des matrices de fibrine contenant des facteurs de croissance ont été utilisés pour conserver des cellules souches neurales dans des sites greffés complète de transection de la moelle épinière. Cellules greffées complètement remplis la cavité de la lésion et différenciées en plusieurs types de cellules neurales, y compris les neurones qui s'étendaient axones dans la moelle épinière hôte sur de longues distances. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

Croissance et différenciation des cellules adultes hippocampe Arctic écureuil souches neurales au sol

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the demyelinating disease Multiple Sclerosis (MS). We have shown that transplantation of NSCs into the spinal cords of sick mice results in a significant improvement in both remyelination and in clinical outcome. Cell replacement therapies for the treatment of chronic neurologic diseases are now a reality and in vivo models are vital in understanding the interactions between the engrafted cells and host tissue microenvironment. This presentation provides an adapted method for transplanting cells into the spinal cord of JHMV-infected mice. In brief, we provide a procedure for i) preparation of NSCs prior to transplant, ii) pre-operative care of mice, iii) exposure of the spinal cord via laminectomy, iv) stereotactic injection of NSCs, and iv) post-operative care.

The transplantation of mouse neural stem cells (NSCs) into the spinal cords of mice with established demyelination is detailed. The preparation of NSCs, the laminectomy of thoracic vertebra 9 (T9), and transplantation of NSCs is outlined along with the pre- and post-operative care of the mice.

Transplantation chirurgicale de cellules souches neurales de souris dans la moelle épinière des souris infectées avec le virus de l&#39;hépatite murine neurotrope

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Percussion Fluide latéral: modèle de lésions cérébrales traumatiques chez la souris

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Spinal Cord Injury complète et cerveau Protocole Dissection pour Wholemount suite<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans des larves de la lamproie marine

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induite par laser Spinal Cord Injury modèle pour évaluer les mécanismes de la dégénérescence axonale dans en temps réel

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied in vitro using the neurosphere assay. This colony-forming assay is a powerful tool to study the response of NSCs to exogenous factors in a dish; however, this can also be used to study the effect of in vivo manipulations with the proper understanding of the strengths and limitations of the assay. One manipulation of the clinical interest is the effect of injury on endogenous NSC activation. Current models of spinal cord injury provide a challenge to study this as the severity of common contusion, compression, and transection models cause the destruction of the NSC niche at the site of the injury where the stem cells reside. Here, we describe a minimal injury model that causes localized damage at the superficial dorsolateral surface of the lower thoracic level (T7/8) of the adult mouse spinal cord. This injury model spares the central canal at the level of injury and permits analysis of the NSCs that reside at the level of the lesion at various time points following injury. Here, we show how the neurosphere assay can be utilized to study the activation of the two distinct, lineally-related, populations of NSCs that reside in the spinal cord periventricular region - primitive and definitive NSCs (pNSCs and dNSCs, respectively). We demonstrate how to isolate and culture these NSCs from the periventricular region at the level of injury and the white matter injury site. Our post-surgical spinal cord dissections show increased numbers of pNSC and dNSC-derived neurospheres from the periventricular region of injured cords compared to controls, speaking to their activation via injury. Furthermore, following injury, dNSC-derived neurospheres can be isolated from the injury site &#8212; demonstrating the ability of NSCs to migrate from their periventricular niche to sites of injury.

Here, we demonstrate the performance of a minimal spinal cord injury model in an adult mouse that spares the central canal niche housing endogenous neural stem cells (NSCs). We show how the neurosphere assay can be used to quantify activation and migration of definitive and primitive NSCs following injury.

Un dosage Neurosphère pour évaluer l’Activation endogène cellules souches neurales dans un modèle murin de minime de la moelle épinière

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identification des marqueurs de surface cellulaire des cellules neurales primaires de tige et de progéniture par l'étiquetage métabolique du sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

La formation axée sur l’activité sur un tapis roulant avec la moelle épinière blessée des Rats Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...