Ce protocole est important car il s’agit d’une méthode optogénétique, ou activée par la lumière, pour induire l’expression des gènes, dans un organisme intact. Dans notre cas, un embryon de poisson zèbre. L’avantage de cette technique, c’est qu’elle utilise la lumière, comme agent inducteur, ce qui permet un contrôle très précis, spatial et temporel de l’induction.
Ce protocole serait utile pour toute situation où l’expression génique inductible serait utile. Cela inclut des choses comme le traçage de la lignée, les tests de gain de fonction ou les expériences de sauvetage. Pour commencer, positionnez le panneau LED par rapport aux boîtes de Petri contenant des embryons pour délivrer 1,5 milliwatts par centimètre carré de puissance de lumière à plusieurs embryons à la fois.
Pour réduire le risque d’endommagement photo de l’activateur transcriptionnel de la queue, affichez la lumière à des intervalles d’une heure à l’aide d’un relais de minuterie, si elle s’allume pendant plus de trois heures. Retirez les couvercles des boîtes de Petri pour minimiser la diffusion de la lumière due à la condensation. Placez des boîtes de Petri contenant des embryons témoins et une boîte à l’épreuve de la lumière pour les témoins sombres.
Retirez les embryons de l’éclairage, après la durée d’activation souhaitée. Pour l’extraction totale de l’ARN, utilisez un kit d’extraction d’ARN. Transférer les embryons dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et éliminer l’excès d’eau d’œuf.
Après avoir ajouté un tampon de lyse, homogénéiser les embryons avec le pilon en plastique. Transférez le lysate dans une colonne fournie par le kit et suivez les instructions du fabricant pour purifier l’ARN. Conservez l’ARN purifié, à moins 20 à moins 80 degrés Celsius, jusqu’à l’utilisation ou synthétisez immédiatement l’ADNc à partir d’un microgramme, l’ARN total à l’aide du kit de synthèse de l’ADNc, en suivant les instructions du fabricant.
Ajouter un microgramme d’ARN dans un tube PCR à paroi mince de 0,2 millilitre, contenant quatre microlitres, de cinq fois le mélange maître de la réaction d’ADNc, suivi de l’ajout d’un microlitre, de 20 fois la solution enzymatique de transcriptase inverse. Ensuite, composez un volume final de 20 microlitres, avec de l’eau sans nucléase. Placez le tube dans un thermocycleur programmé pour la synthèse de l’ADNc.
Conserver l’ADNc synthétisé à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation ou utilisation immédiate pour l’évaluation quantitative. Mettre en place les réactions PCR quantitatives contenant le mélange maître d’enzymes cyber-vertes. Cinq fois dilués d’ADNc et de GFP à une concentration de 325 nanomolaires dans des triplicates et conduisent la réaction dans une machine pcR programmée en temps réel.
À la fin de la réaction, analysez la courbe de fusion pour déterminer la spécificité de la réaction. Calculez l’induction activée par la lumière lorsque le pli change par rapport aux embryons témoins à l’aide de la méthode de double TD Delta. Et utilisez un logiciel statistique pour déterminer la signification.
Après avoir retiré les embryons de l’éclairage, immobiliser les embryons pour l’imagerie dans 3% de méthylcellulose contenant 0,01% de tricaïne dans des lames de dépression en verre. Obtenez des images de fluorescence et de champ lumineux sur un stéréomicroscope fluorescent connecté à un appareil photo numérique à l’aide des paramètres de filtre GFP standard. Fusionnez les images en champ clair et en fluorescence après l’acquisition avec un logiciel de traitement d’image.
La quantification de l’expression de la GFP a indiqué l’induction de l’expression dès 30 minutes après l’exposition à la lumière bleue. Les niveaux d’expression de GFP ont ensuite continué à augmenter jusqu’à six heures, après l’activation régulièrement. L’induction de GFP a également été évaluée qualitativement en examinant l’intensité de fluorescence aux mêmes points de temps après l’activation.
La fluorescence GFP au-dessus des niveaux de fond a été observée pour la première fois trois heures après l’activation et est devenue nettement plus brillante six heures après l’activation. En revanche, les embryons de contrôle pour tous les points temporels, maintenus dans l’obscurité, ne présentaient pas de fluorescence GFP appréciable. La lumière d’activation doit être dans la gamme bleue du spectre de la lumière visible.
La lumière de la pièce et la lumière du soleil contiennent de la lumière bleue. Prenez donc soin de protéger vos contrôles négatifs de toute source de lumière ambiante. Le système TAEL C120 est génétiquement codé et modulaire et peut conduire l’expression de n’importe quel gène d’intérêt.
Ainsi, combiné avec d’autres techniques, il peut être utilisé pour répondre à une gamme de questions biologiques.
